专利名称：生产还原型谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物生物技术领域，涉及发酵产谷胱甘肽的微生物及其制备方法。
背景技术：
谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的非蛋白巯基化合物，在医学和化妆品，食品加工，蛋白纯化等领域有着广泛的应用[Sies H. (1999)Free Rad Biol Med. 27，916-921 ； Henry Jay Forman et, al, (2009)Molecular Aspects of Medicine 30,1-12;郑云朗 (1995)生物学通报 30，22-24 ；Castro, VM. et, al (1993), Biochem J 292,371-377]。自上世纪70年代日本协和公司(Kyowa Hakko Kogyo Co.)使用发酵法生产谷胱甘肽工业化以后，发酵法生产GSH就成为其工业生产研究的主要方法[Sakato，K. and Tanaka H. 1992，Biotechnol. Bioeng. 40，904-912]。为此，上世纪七十年代后，各国开始对生物法合成GSH进行了大量研究，发表了大量文章和申请并公布了一系列相关专利 [Kimura A. (1986)Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. ,33,1-51, Nanjo, H. , Yamashita, K., et.，al (1986)公开特许公报 61-52299 ；Tezuka, H.，Otake，Y.，Yabushi，et.，al (1987)公开特许公报 62-275685 ；Christine, L.，Ulf, S. (1989) Eur. Pat. Appl. EP 300168 ；王绍校， (2005).中国学位论文全文数据库；饶志明等O007).应用与环境生物学报，13 :257-260; 饶志明等(2007)，食品与发酵工业.33 1-4 ；蔡宇杰等，食品与机械，23，16-19 ；US Patent 6902912 ；US Patent 4598046 ；US Patent 4582801 ；JP19890032584 ；W02004/003217A1 ； EP1539982 ；US Patent 20050239164 ；CN200810019761. 6] 其中，发酵菌株的选育主要集中在酵母(如 Saccharomyces cervisiae、Pichia pastoris、Candida utilis)禾口大肠杆菌等微生物，通常的方法是在育种中利用基因重组技术使微生物细胞表达GSH相关合成相关基因谷氨酰半胱氨酸合成酶gshl和谷胱甘肽合成酶gsh2基因，打破转录调控，使细胞内 GSH合成酶活增加，从而提高GSH产量。谷胱甘肽作为细胞内重要的多功能因子，其合成与调控等机理复杂。Alfafara等人研究表明，胞内半胱氨酸的浓度是GSH合成产量的限制因素 [Alfafara et, al. 1992，Appl. microbiol. biotechol. 36，358-540]。发酵添加半胱氨酸直接提高 GSH 的产量[Wen，S. et, al. 2004，Enzyme Microbial, tech. 35，501-507]。GSH 的生产中如果增加细胞内的半胱氨酸相对含量、就可以减少外源半胱氨酸添加量，提高半胱氨酸转化率，生产成本将会大大降低。
发明内容
本发明首先提供一种生产谷胱甘肽的重组菌株。本发明还提供所述重组菌株的制备方法。本发明还提供所述重组菌株在发酵生产谷胱甘肽中的应用。本发明提供的生产谷胱甘肽的重组菌株，其谷胱甘肽合成转录调控失调，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因被失活或敲除。
3
本发明中谷胱甘肽合成转录调控失调，可以采用组成型或诱导型启动子表达谷胱甘肽相关合成酶，也可以表达谷胱甘肽相关合成酶正调控蛋白。谷胱甘肽相关合成酶可以选择来源各种生物的谷氨酰半胱氨酸合成酶gshl或突变体和谷胱甘肽合成酶gsh2或突变体，如酵母、大肠杆菌、高等动植物等，也可以选择双功能酶gshF或其突变体，如多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)的gshF基因。本发明中谷胱甘肽合成转录调控失调，也可以表达谷胱甘肽相关合成酶基因转录正调节蛋白(如Yaplp、Met4)启动谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因转录。 优选的，所述的重组菌选择真菌，特别是酵母菌，在本发明中最优选为毕赤酵母。在本发明重组菌株的一个优选实施方案中，其内源的半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因和/或被失活或敲除，更优选的，Str3基因被失活。本发明提供的所述重组菌株的制备方法，以毕赤酵母为出发菌株为例，表达来源于大肠杆菌gshl和gsh2并且基因失活为例，包括如下步骤1)将大肠杆菌gshl和gsh2的表达盒转化到毕赤酵母中，获得表达大肠杆菌gshl 和gsh2基因的毕赤酵母。2)将步骤1)获得的毕赤酵母通过同源重组失活内源的基因，从而获得表达谷胱甘肽合成失调，半胱氨酸向高半胱氨酸的循环途径被切断的新菌株。本发明中基因表达可以采用商业化表达系统，也可以采用改造表达系统；表达载体可以选择游离质粒，也可以选择整合基因组。本发明中基因表达启动子可以选择诱导型启动子，也可以选择组成型启动子或其突变体，以酵母菌为出发菌株优选为GAP，YPT1，PGK， ADHl，TEF, HXK2等启动子中的几种或一种。在本发明中菌株的相关基因突变或修饰可以通过同源重组-反筛选基因修饰技术，也可以转座技术来构建多基因突变或修饰。本发明的微生物菌株用于本领域已知的方法在发酵罐内制备谷胱甘肽。举例言之，所用的碳源可以是葡萄糖、淀粉糖、糖蜜或其他糖类，而所用氮源可以是铵或蛋白水解物。举例言之，所用的硫源可以是硫酸盐和含硫氨基酸等。在本发明发现，表达gshl和gsh2基因的重组菌株，在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，虽然可以达到一定产量，但是存在半胱氨酸转化效率低下。当切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环，在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，同表达gshl和gsh2基因的对照菌株相比达到相同产量时，可以大大提高外源半胱氨酸转化效率和缩短发酵时间。使用本发明的方法构建的微生物菌株发酵培养，其谷胱甘肽的产量显著高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水平，提高了原料利用效率，降低了生产成本，可用于工业化生产。
图1为ρ Pic G1G2的质粒图谱。图2所示为失活切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环。图3所示为str3基因失活突变过程示意图。图4所示为切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径对发酵生产GSH的影响。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在下实施例中未注明的具体的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验手册》、《pichia protocols》(Humana Press)中所说的方法或厂商提供的方案进行。本发明实施例中，毕赤酵母表达系统(包括=Pichia pastoris X33、pPIC3. 5K、 pGAPZB、pGAPZC 等)、合成引物等购于 invitrogen 公司，其中 Pichia pastoris X33 为出发菌株。KOD聚合酶、PCR纯化试剂盒、胶回收纯化试剂盒、DNA抽提试剂盒、碱性磷酸酶、 部分限制性内切酶、DH5ci、G418、ZeCOin、氨苄等购于上海悦克生物科技有限公司；Taq酶、 T4连接酶、部分限制性内切酶、质粒PMDT-18、质粒PUC18购于Takara公司；同源重组-反筛选系统质粒PPicZ mazF(A0Xl-mazF-Zeocin，图3)是本实验室参照文献[Yunjie Y. et， al. 2009，TEMS Yeast Res. 9，600-609]方法构建。试剂除特殊要求外，均为国产试剂。电转参照pichia expression Kit手册中提供方法进行。实施例1谷胱甘肽合成转录调控失调菌株X33 (gshl, gsh2)的构建1)引物gshl-Ι tgaaGGTACCTTGATCCCGGACGTATCACAGGC(SEQ ID No. 1)gsh 1-2 :atgaTCTAGAATCAGGCGTGTTTTTCCAGCCAC(SEQ ID No. 2)gsh2-l :atcaGAATTCATGATCAAGCTCGGCATCGTGA(SEQ ID No. 3)gsh 2-2 :attaCTCGAGTTACTGCTGCTGTAAACGTGCTTC xhol(SEQ ID No. 4)GAPG1G2-1 CGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAAC (SEQ ID No. 5)GAPG1G2-2 :GTAACCATGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGGTGT(SEQ ID No. 6)2)方法本实施例采用组成型启动子GAP表达来源大肠杆菌的gshl和gsh2基因来解除GSH转录调控。具体方法如下用引物gshl-Ι和gsh 1-2PCR扩增大肠杆菌Dffia的gsh 1基因(EcoGene登录号 EG10418)，经过Kpn I、Xba I双酶切后连接相同酶切的质粒pGAPZB，得到pGAPGl ；用引物gsh2_l和gsh 2-2PCR扩增大肠杆菌Dffia的gsh 2基因(EcoGene登录号 EG10419) J^lEcoR I、Xho I双酶切后连接相同酶切的质粒pGAPZB，得到pGAPG2。pGAPG2 用Bgl II, BamH I双酶切后连接到BamH I酶切并经过碱性磷酸酶处理的pGAPGl，得到 PGAPG1G2。以 pGAPGlG2 为模板，GAPG1G2-1 和 GAPG1G2-2 为引物的 PCR产物经 Bgl II,Nco I 酶切连接到Nco I/BamH I酶切的pPIC3.阢得到质粒pPicGlG2 (图1)。pPicGlG2经过&ic I酶切线性化后电转Pichia pastoris X33，G418平板筛选得菌株X33 (gshl，gsh2)。挑取阳性克隆菌落，摇瓶发酵培养保种。将其阳性克隆菌株命名为ZX067。实施例2切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环
切断半胱氨酉髮向高半胱氨酸循环示意图如图2所示。
1)引物
Pst3-1-1:5，TACCAGCAGCAACAGTATGAATGAGATCTC(SEQ ID No. 7)
Pst3-l-2:5，GCGTTCCCGCTCAATAATTACTC(1653-1675)(SEQ ID No. 8)
Pst3-3-l:5，GTCCTGCCTAAACGTTGCAGTC(2724-2745)(SEQ ID No. 9)
Pst3-3-2:5，actactgcaGGGGCATCACAGCTCCCTTCTTG(SEQ ID No. 10)
5
Pst3-l-3-l-3，GACTGCAACGTTTAGGCAGGACGCGTTCCCGCTCAATAATTACTCTGAT(SEQ ID No. 11)str3-l-r :TGCCCAGTTCCACCCTTTCC (SEQ ID No. 12)P5AOX-1 :AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTG(SEQ ID No. 13)Pzeo-2 :TGGCCTTTTGCTCACATGTTGGTCTCC(SEQ ID No. 14)2)方法(如图3，基因突变经过a、b、c、d四个步骤)①Str3 基因克隆(GeneID :8199046 ；NCBI)X33基因组为模板，Pst3-l_l和为引物的PCR产物用Bgl Il.Pst I酶切后，经胶回收试剂盒回收产物连接到BamH I.Pst I酶切的pUC18得pUCstr3。②基因突变体反筛选盒(图3a)将以pPicZ mazF为模板，以P5Aox_l和Pzeo-2为引物的PCR产物 AOXl-mazF-Zeocin反筛选盒插入经SnaBI酶切并经过碱性磷酸酯酶处理后的质粒pUCstr3 中得质粒 pUCstr3: (AOXl-mazF-Zeocin)。③基因体外突变构建(图北)以pUCstr3为模板，以和Pst3_l_2为引物扩增得到PCR产物I3StS-I ；以pUCstr3为模板，以和Pst3_3_2为引物扩增得到PCR产物；以I3StS-I为模板，以I3StS-I-I和Ι^ 3-1-3-1-3，为引物扩增得到PCR产物 I^t3-l-3-5’，其3’端带有I^t3-3的部分5’碱基序列；以 Pst3-l-3_5，和 Pst3_3 为模板，以 Pst3_l_l 和 Pst3_3_2 为引物扩增得到 PCR 产物I^t3-l-3，其为去除部分碱基序列的基因的Δ str3 (SEQ ID No. 15)④基因突变(图3c和d)以 pUCstr3: (AOXl-mazF-Zeocin)为模板，以 str3-l_l，和 Pst3_3_2 为引物扩增得到 PCR 产物 str3: (AOXl-mazF-Zeocin)。将上述 str3: (AOXl-mazF-Zeocin) PCR产物电转X33(gshl，gsh2)经hoc in筛选阳性克隆菌落得X33(gshl，gsh2， str3: (AOXl-mazF-kocin))。将 PCR 产物 Pst3_l_3 (SEQ ID No. 15)电转导入 X33 (gshl， gsh2, str3:: (AOXl-mazF-Zeocin))，在含甲醇为唯一碳源的培养基筛选阳性克隆菌落得 X33(gshl,gsh2, Δ str3) 0挑取阳性克隆菌落，摇瓶发酵培养保种，将其阳性克隆菌株命名为 ZX068。实施例3制备发酵生产GSH培养基1)发酵生产GSH摇瓶种子培养基采用YPD培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。2)摇瓶培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨 5g/L，酵母膏 5g/L，KH2PO4 2. 82g/L，K2HPO4 9. 12g/L，MgSO4 lg/L，(MM)2SO4 2g/L，Nacl 0. 2g/L, Cacl 0. 2g/L, FeS047H20 0. lg/L，生物素 0. 4mg/l，泛酸钙 0.8mg/l，肌醇 ％ig/l，烟酸 0.8mg/l，对甲苯磺酸 0.%ig/l，V B6 0. 6mg/l,V B2 0. 4mg/ 1，硫胺素 0. 6mg/l，硼酸 lmg/1，CuSO4 0. 6mg/l，KI 0. 2mg/l, MnSO4 0. 8mg/l, Na2MoO4 0. 4mg/l, ZnSO4 0.8mg/lo3)发酵罐发酵生产GSH培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 10g/L，KH2PO4 30g/L，MgSO4 2g/L，(NH4)2SO4
65g/L，NaCl 0. 4g/L，CaCl 0. 5g/L，FeS047H20 0. 2g/L，生物素 0. 8mg/l，泛酸 丐 1. 6mg/l，肌醇 8mg/l，烟酸 1.6mg/l，对甲苯磺酸 0.8mg/l，VB6 1.6mg/l,VB2 0.8mg/l，硫胺素 1.6mg/l, 硼酸 2mg/l, CuSO4 1. 6mg/l, KI 0. 4mg/l, MnSO4 1. 6mg/l, Na2MoO4 0. 8mg/l, ZnSO4 1. 6mg/ 1，聚醚泡敌少许。4)流加培养基1 葡萄糖700g/L，酵母膏40g/L。5)流加培养基2 =L-半胱氨酸盐酸盐120g/L。实施例4胞内还原型谷胱甘肽的含量检测1)待测样品的制备胞内谷胱甘肽的含量采用以下方法处理取一定量的发酵液离心，去上清，加一定倍数稀释，沸水5分钟后冷却，12000g离心20分钟后上清液过滤，过滤液待上样。2)色谱检测色谱条件色谱柱C18 (4. 6X250mm)，磷酸盐溶液(取磷酸二氢钾6. 8克，庚烷磺酸钠2.2克，加水溶解使成1000ml，用磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(97 3体积比)流速 lml/min，检测波长210nm。进样量为20微升。以还原型谷胱甘肽纯品为标准制备标准曲线，根据检测样品峰面积计算待测样品谷胱甘肽含量。实施例5切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环对摇瓶发酵生产GSH的影响选取X33、ZX067、ZX068菌株，经摇瓶种子培养基YPD中，30°C、280rpm培养M小时后，按照10% (ν/ν)接种量接种到50ml摇瓶培养基中Q50ml三角瓶)，30°C、280rpm培养。 分别于24小时、36小时、48小时每次补加“流加培养基1”0· 8ml和“流加培养基2”0· 8ml, 并与36小时、48小时、60小时取样检测培养液中还原性谷胱甘肽GSH的含量。检测结果如表1所示表1 GSH的摇瓶产量(g/L)
菌株基因型发酵时间36 h48 h60 hX33野生型0.050.090.02ZX067X33 (gshl,gsh2)0.230.450.42ZX068X33 ( gshl,gsh2,Astr3 )0.390.590.76从表1中可以看出，仅切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环，在相同条件下，与没有切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环菌株相比，大大提高了底物转化效率以及缩短发酵时间。实施例6切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环对发酵生产GSH的影响采用实施例3发酵培养基，选取ZX067、ZX068菌株，经摇瓶种子培养基YPD中， 30°C、280rpm培养M小时后，按照10% (ν/ν)接种量接种到15L发酵培养基中(30L发酵罐)，30°C发酵，流加氨水控制pH7. 0，调节转速、温度、罐压、通风量等控制溶氧D030%。发酵过程流加“流加培养基1”，控制葡萄糖含量为20-30g/L，以满足细胞生长。待细胞生长到0D6(i(i150时，开始添加“流加培养基2”，继续发酵至GSH含量不积累为止(50-70小时)。 发酵自开始添加“流加培养基2”每4时取样检测培养液中GSH产量，结果如图4，发酵产量 ZX068菌株同ZX067相比，发酵产量大大提高，超过历史报道水平7g/L ；同时半胱氨酸转化
7生产谷胱甘肽的转化率(摩尔)也由52-60%提高75-83%。 在本发明的实施例中，所用的菌株、启动子等仅用作说明之用，不能用来限制本发明。对于本领域技术人员而言，可对微生物，谷胱甘肽相关合成酶或突变体、启动子或突变体用来同本实施例结果进行比较优化(对发酵生产谷胱甘肽的产量影响)，这种优化是显而易见的。因此，选择实施例以外的其他微生物、其他谷胱甘肽相关合成酶或突变体、启动子或突变体以及切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环的其他基因同样适用本发明范围。
权利要求
1.一种产谷胱甘肽重组菌株，其特征在于，其谷胱甘肽合成转录调控失调，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因被失活或敲除。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，采用组成型或诱导型启动子表达谷胱甘肽相关合成酶基因gshl和gsh2基因或表达谷胱甘肽双功能合成酶gshF基因，使谷胱甘肽合成转录调控失调。
3.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，内源的半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因失活或敲除。
4.根据权利要求1 3任一项所述的重组菌株，其为真菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其为酵母菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其为毕赤酵母。
7.制备权利要求1 6任一项所述的重组菌株的方法，其包括如下步骤1)将大肠杆菌gshl和gsh2的表达盒转化到毕赤酵母中，获得表达大肠杆菌gshl和 gsh2基因的毕赤酵母。2)将步骤1)获得的毕赤酵母通过同源重组-反筛选基因修饰技术失活内源基因，从而获得表达谷胱甘肽合成失调，半胱氨酸向高半胱氨酸的循环途径被切断的新菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，表达大肠杆菌gshl和gsh2的启动子为GAP、 YPTl、PGK、ADHl、TEF、HXK2 中的一种或一种以上。
9.权利要求1 6任一项所述的重组菌株在发酵生产谷胱甘肽中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种产谷胱甘肽重组菌株，其谷胱甘肽合成转录调控失调，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因被失活或敲除。本发明提供的菌株切断了半胱氨酸向高半胱氨酸循环，在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，同表达gsh1和gsh2基因的对照菌株相比达到相同产量时，可以大大提高外源半胱氨酸转化效率和缩短发酵时间。
文档编号C12R1/84GK102433265SQ20111034387
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者许善峰 申请人:镇江市德尔生物制品研究所有限公司