专利名称：分离豚鼠心室肌细胞记录l型钙通道电流的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别涉及一种分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法。
背景技术：
L型钙通道主要分布于心肌、平滑肌(包括血管，肠，肺，子宫)、内分泌细胞(包括胰β细胞，垂体)以及神经。L型钙通道在心脏以及平滑肌的兴奋-收缩偶联、窦房结和房室结的动作电位的传导、突触可塑性以及激素分泌中发挥重要的作用。高血压、心血管疾病以及癌症药物的开发过程中，观察对L型钙通道的拮抗作用已成为协助评价药物效应的重要手段。膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”，是研究离子通道的最重要的技术。分离心脏的心室肌细胞用全细胞膜片钳方式记录L型钙通道用以评价药物的影响已成为药物开发过程中的重要环节。常规的心肌细胞分离的方法和手段包括胶原酶的消化和复钙的过程。这种传统的分离方法存在操作复杂，细胞收获率及成活率低等缺陷；细胞外灌流液中直接取消了 Na+，造成细胞存活时间明显缩短等缺陷，需要进行改进和提高，从而确保实验的成功率和稳定性。
发明内容
本发明的目的，在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种易操作、能提高细胞收获率和成活率的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，以提供一种临床前心脏的安全评价以及高血压抗癌药物药效评价的有效方法。本发明的目的是这样实现的:`一种分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，包括以下步骤:Α、将豚鼠猛击头部致昏迷后，开胸快速取出心脏；B、将豚鼠心脏置于4°C的正常台氏溶液中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管，置于Langendorff装置上保持温度37°C以8_10ml/min的速度进行离体心脏灌流:先以正常台氏溶液灌流5min，完全冲洗心脏内残留的血液，再用无钙台氏溶液灌流5min，至心脏完全停止搏动，再用50ml酶解液循环灌流8-10min，至心脏流出液拉丝明显，膨胀变大，颜色变淡时，再用Kraft-Briihe溶液灌流5min ；C、将心脏从LangendorfT装置上取下，剪去心房和基底部组织，将心室肌组织剪成1.5-2.5mm碎块，用粗开口吸管缓慢吹打使心室肌细胞从心肌碎块上分离；D、将分离出的心室肌细胞置于37°C水浴锅中振荡l_2min，得到细胞混悬液；E、将细胞混悬液用200目的滤网过滤，心室肌细胞收集于Kraft-Briihe溶液中，室温下静置稳定0.5-lh后备用；F、将收集于Kraft-Briihe溶液中的心室肌细胞加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，静置后心室肌细胞沉底贴壁，用细胞外灌流液清洗细胞，流速保持1-1.5ml/min ；选择边缘整齐，表面无颗粒，横纹清晰，无收缩的心室肌细胞进行膜片钳实验，采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录L型钙通道电流；实验在22-25°C下进行，使用的玻璃电极在充满细胞内灌流液时的电阻为3-5ΜΩ。步骤B中所述的正常台氏溶液由NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、4_羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，KCl的浓度为5.4mM, MgCl2的浓度为ImM，CaCl2的浓度为1.8mM，4_羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM,葡萄糖的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为290m0sm ；所述的无钙台氏溶液由NaCl、KCl、MgCl2、4_羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，KCl的浓度为5.4mM,MgCl2的浓度为ImM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为290m0sm ；所述的Kraft-Briihe溶液由氨基乙磺酸、乙二酸、谷氨酸、KCUKH2PO4、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用KOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，氨基乙磺酸的浓度为10mM，乙二酸的浓度为10mM，谷氨酸的浓度为70mM，KCl的浓度为25mM，KH2PO4的浓 度为10mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为0.5mM，4_羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为IlmM ;溶液的渗透压为290m0sm。步骤F中所述的细胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2、CaCl2、4_羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，CsCl的浓度为5.4mM, MgCl2的浓度为ImM，CaCl2的浓度为1.8mM，4_羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM,葡萄糖的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为290m0sm ；所述的细胞内灌流液由CsCl、四乙基氯化铵、CaCl2、镁-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH调节pH至7.2，配制成的溶液中，CsCl的浓度为120mM，四乙基氯化铵的浓度为20mM，CaCl2的浓度为ImM，镁-三磷酸腺苷的浓度为5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为llmM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为IOmM ；溶液的渗透压为310m0sm。步骤F中所述的电压钳模式为,钳制电压_80mV,先施予50ms的_40mV预脉冲,后给予300ms、OmV去极化脉冲。步骤B中所述的各灌流溶液均通以100%氧气15_min后使用。步骤E中所述的室温下静置稳定时间为30_min。本发明分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法的优点在于:1、Kraft-Bruhe溶液的灌流可以充分清洗组织中残留的胶原酶，避免了残留胶原酶对细胞的影响，提高了细胞的收获率和成活率；2,Kraft-Bruhe溶液中的乙二醇二乙醚二胺四乙酸进入细胞内充分螯合胞内游离的钙离子，减弱心肌细胞的自发性收缩，提高了细胞的成活率；3、Kraft-Bruhe液中加入了氨基乙磺酸、谷氨酸等营养物可显著延长细胞的存活时间和良好状态；4、细胞外灌流液中正常加入了 Na+，维持了细胞内外的离子的平衡，有效延长了细胞的稳定性；5、本发明分离所得豚鼠心室肌细胞具有正常的离子通道功能，适用于膜片钳技术对心肌电生理特性的研究，本实验操作易于掌握，是一种简单有效的急性分离心室肌细胞的方法。
具体实施例方式本发明分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，包括以下步骤:一、单个心室肌细胞的分离豚鼠(体重220_250g)猛击头部致昏迷后，开胸快速取出心脏，在4°C正常台氏液中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管，以8-10ml/min的速度进行离体心脏灌流。先以正常台氏液灌流5min完全冲洗心脏内残留的血液，再用无钙台氏液灌流5min至心脏完全停止搏动，再用50ml酶解液循环灌流8-10min，至心脏流出液拉丝明显，心脏膨胀变大，颜色变淡时，用Kraft-Briihe液灌流5min后,将心脏从Langendorff装置上取下,剪去心房和基底部组织，将心室肌组织剪成约2mm碎块，用粗开口吸管缓慢吹打使细胞从心肌碎块上分离，置于37°C水浴锅中振荡l_2min。细胞混悬液用200目的滤网过滤，心肌细胞收集于Kraft-Bruhe液中，室温下静置稳定0.5-lh后(最好是0.5h)备用。整个灌流系统温度保持在37°C，流速8-10ml/min。所有的灌流液均通以100%氧气15min后使用。二、L型钙通道电流的记录将细胞加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，细胞静置后沉底贴壁，用细胞外灌流液灌流清洗细胞，流速保持1-1.5ml/min。选择边缘整齐，表面无颗粒，横纹清晰，无收缩的细胞进行膜片钳实验。所有实验在室温(22-25°C)下进行。使用的玻璃电极在充满细胞内灌流液时的电阻约为3-5ΜΩ。采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录通道电流。记录L型I丐通道电流时,钳制电压_80mV,先施予50ms的_40mV预脉冲,后给予300ms, OmV去极化脉冲。本发明中所采用的正常台氏溶`液由NaCl、KC1、MgCl2, CaCl2、4_羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，KCl的浓度为5.4mM, MgCl2的浓度为ImM，CaCl2的浓度为1.8_mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM,葡萄糖的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为290m0sm ；本发明中所采用的无钙台氏溶液由NaCl、KCl、MgCl2、4_羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，KCl的浓度为5.4mM, MgCl2的浓度为lmM，4_羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为IOmM ；溶液的渗透压为290m0sm ；本发明中所采用的Kraft-Briihe溶液由氨基乙磺酸、乙二酸、谷氨酸、KC1、KH2P04、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用KOH调节pH至
7.4，配制成的溶液中，氨基乙磺酸的浓度为10mM，乙二酸的浓度为10mM，谷氨酸的浓度为70mM,KCl的浓度为25mM，KH2PO4的浓度为10mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为0.5mM,4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为IlmM ;溶液的渗透压为290m0sm。本发明中所采用的细胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2, CaCl2、4_羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，CsCl的浓度为5.4mM, MgCl2的浓度为ImM，CaCl2的浓度为1.8mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM,葡萄糖的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为290m0sm ；
本发明中所采用的细胞内灌流液由CsCl、四乙基氯化铵、CaCl2、镁-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH调节pH至702，配制成的溶液中，CsCl的浓度为120mM，四乙基氯化铵的浓度为20mM，CaClJ^浓度为1禮，镁-三磷酸腺苷的浓度为5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为llmM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为IOmM ;溶液的渗透 压为310m0sm。
权利要求
1.一种分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于，包括以下步骤: A、将豚鼠猛击头部致昏迷后，开胸快速取出心脏； B、将豚鼠心脏置于4°C的正常台氏溶液中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管，置于Langendorff装置上保持温度37°C以8-10ml/min的速度进行离体心脏灌流:先以正常台氏溶液灌流5min，完全冲洗心脏内残留的血液，再用无钙台氏溶液灌流5min，至心脏完全停止搏动，再用50ml酶解液循环灌流8-10min，至心脏流出液拉丝明显，膨胀变大，颜色变淡时，再用Kraft-Briihe溶液灌流5min ； C、将心脏从LangendorfT装置上取下，剪去心房和基底部组织，将心室肌组织剪成1.5-2.5mm碎块，用粗开口吸管缓慢吹打使心室肌细胞从心肌碎块上分离； D、将分离出的心室 肌细胞置于37°C水浴锅中振荡l_2min，得到细胞混悬液； E、将细胞混悬液用200目的滤网过滤，心室肌细胞收集于Kraft-Brilhe溶液中，室温下静置稳定0.5-lh后备用； F、将收集于Kraft-Briihe溶液中的心室肌细胞加入灌流槽中，置于倒置显微镜载物台上，静置后心室肌细胞沉底贴壁，用细胞外灌流液清洗细胞，流速保持1-1.5ml/min ;选择边缘整齐，表面无颗粒，横纹清晰，无收缩的心室肌细胞进行膜片钳实验，采用标准的全细胞膜片钳记录方法，在电压钳模式下记录L型钙通道电流；实验在22-25°C下进行，使用的玻璃电极充满细胞内灌流液，电阻为3-5ΜΩ。
2.根据权利要求1所述的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于:步骤B中所述的正常台氏溶液由NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，KCl的浓度为5.4mM, MgCl2的浓度为ImM，CaCl2的浓度为1.8_mM, 4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为290m0sm ； 所述的无钙台氏溶液由NaCl、KC1、MgCl2,4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，KCl的浓度为5.4mM, MgCl2的浓度为ImM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为290m0sm ； 所述的Kraft-Brilhe溶液由氨基乙磺酸、乙二酸、谷氨酸、KCUKH2PO4、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用KOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，氨基乙磺酸的浓度为10mM，乙二酸的浓度为IOmM,谷氨酸的浓度为70mM，KCl的浓度为25mM, KH2PO4的浓度为IOmM,乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为0.5mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为IlmM ;溶液的渗透压为290m0sm。
3.根据权利要求1所述的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于:步骤F中所述的细胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2、CaCl2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖配制而成，并用NaOH调节pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的浓度为135mM，CsCl的浓度为5.4mM, MgCl2的浓度为ImM，CaCl2的浓度为1.8mM，4_羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为5mM，葡萄糖的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为290m0sm ； 所述的细胞内灌流液由CsCl、四乙基氯化铵、CaCl2、镁-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH调节pH至7.2，配制成的溶液中，CsCl的浓度为120mM，四乙基氯化铵的浓度为20mM，CaCl2的浓度为1禮，镁-三磷酸腺苷的浓度为5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为llmM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为IOmM ;溶液的渗透压为310m0Sm。
4.根据权利要求1所述的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于:步骤F中所述的电压钳模式为，钳制电压_80mV，先施予50ms的_40mV预脉冲，后给予300ms>OmV去极化脉冲。
5.根据权利要求1所述的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于:步骤B中所述的各灌流溶液均通以100%氧气15min后使用。
6.根据权利要求1所述的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，其特征在于:步骤E中所述的室温 下静置稳定时间为30min。
全文摘要
L型钙通道主要分布于心脏，血管，内分泌以及神经系统，在心脏和平滑肌兴奋-收缩偶联，窦房结和房室结的动作电位传导中发挥着极其重要的作用。通过膜片钳记录方法观察化合物对L型钙通道的影响以评价该化合物的心脏安全系数以及治疗高血压的效果已成为重要的研究方式。本发明的分离豚鼠心室肌细胞记录L型钙通道电流的方法，通过改良灌流液，保存方式以提高分离豚鼠心室肌细胞的收获率和成活率，延长细胞的稳定时间从而提高了实验的成功率和稳定性。
文档编号C12Q1/24GK103103245SQ20111036209
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者谈学海, 林佩元, 陈景才, 范柳 申请人:辉源生物科技(上海)有限公司