专利名称：一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物技术领域，涉及ー种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。
背景技术：
大豆是重要的植物蛋白来源之一，同时也是8类主要致过敏食物之一(Metcalfe D. i'he nature and mechanisms οι iood allergies ana related diseases, rooa technology, 1992, 5 (5) :136-140)。Ogawa等(1991)通过免疫印迹技术在大豆中检测到 15种过敏蛋白质，并对有食物过敏史的人检测发现，14%的人对大豆过敏，仅次于对蛋清的反应06.7%)。近年来包括中国在内的世界各国对大豆的消费迅速增长，増加了大豆胃自弓白勺；L$。 (0g￡W￡i Τ, Bando N, Tsuji H, Okajima H, Nishikawa K, Sasaoka K. investigation οι the Igii-Dinamg proteins in soyoeans by immunoblottmg with the sera of the soybean sensitive patients with atopic dermatitis. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 1991, 37 :555-565.)Gly m Bd 30K、Gly m Bd 60K和Gly m Bd ^K是大豆中的3种主要过敏蛋白。Gly m Bd 30K也称为P34，是半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族的一个边缘成员。与Ig E结合试验中表明，超过65%以上对大豆敏感的病人仅对Gly m Bd 30K蛋白过敏，因此Gly m Bd 30K蛋白被视为大豆蛋白中ー个重要的免疫显性过敏原。目前还没有筛选到30K缺失或低含量的种质。在美国^klich等(1999)筛选美国农业部大豆核心种质，发现30K含量相似，且野生亲缘种也不缺失 30K。(Yaklich Rff,Helm RM, Cockrell G, Herman EM. Analysis οι tne distribution of the major soybean seed allergens in a core collection oi Glycine max accessions. Crop Science, 1999, 39 1444-1447.)日本用诱变方法在改造 β-伴球蛋白起了很大的作用，但去除30K的努力并没取得成功。在我国关荣霞等Ο004) 筛选了 175份多样性广的、具有代表性的中国大豆品种也没有检测到缺失30Κ过敏原的材料。(关荣霞，常汝镇，邱丽娟，刘章雄，郭顺堂.栽培大豆蛋白亚基11S/7S組成及过敏蛋白缺失分析.作物学报，2004,11 :1076-1079.)这些结果表明，直接利用目前的种质资源培育低30K过敏原的大豆品种似乎是比较困难的。RNAi是最近几年才发展起来的研究生物体基因表达、调控与功能的ー项技木，是由小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)引起的生物細胞内同源基因的特异性沉默 (silencing)现象。其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合并引起降解，从而阻止mRNA的翻译。将小片段双链RNA(siRNA)导入細胞，siRNA结合一个核酶复合物，从而形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到mRNA转录本上，并在距离siRNA
端12个碱基的位置切割mRNA，引起mRNA的降解，从而特异性抑制靶基因的表达，是基因敲除(knockdown or knockout)的強大工具，在功能基因组研究和基因治疗中有很好的前景。(Liparai C, Wei Q,Paterson BM. RNAi as random degraaative PCR siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degradedto generate new siRNAs. Cell,2001,107,297-307.)在植物中持久表达RNA沉默通常是先构建表达载体，然后通过PEG介导、电穿孔介导、农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达。由于农杆菌侵染法技术的成熟，在持久性的RNA沉默研究中得到了广泛应用。构建hpRNA高效表达载体用于特定基因沉默是研究的热点之一。Wesley等Q001)系统研究了不同结构的RNA对沉默效率的影响，发现相比于单链正义或反义RNA，双链RNA尤其是发夹式结构的RNA(hpRNA) 对RNA沉默的效率有非常显著的提高。(Wesley SV, Helliwell CA，Smith ΝΑ, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoufjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG,Waterhouse PM. Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant Journal, 2001,27 :581-590.)如果在发夹结构的反向重复序列间加入一段非编码序列如内含子，在植物体内转录形成含内含子的发卡结构(intronsplicinghpRNA，ihpRNA)，则沉默效果与hpRNA相比可从58%提高到90%。Moutjesdijk等Q002)采用FAD2基因的5' UTR片段也有效地沉默了该基因。 (Stoutjesdijk P, Singh SP,Liu Q,Hurlstone C,Waterhouse P,Green A. hpRNA-mediated targeting of tne Arabidopsis FflD2gene gives highly efficient and staole silencing. Plant Physiology,2002,129 :1723-1731.)目前，构建植物干扰表达载体通过遗传转化的方法来降低大豆Gly m Bd 30K致敏性的研究报道在国内很少。Herman等Q003)通过遗传修饰去除大豆主要的过敏原30K已获得成功，遗传修饰后在30K多肽含量受抑制，但多肽结构上没有显著的变化，进ー步观察发现30K沉默性状可在子代中稳定遗传，且它们的生长性、蛋白含量、含油率等农艺学性状与未遗传改造的对照株没有显著的差异，更说明通过遗传修饰得到的30K沉默植株确能有效地去除;Ci敏原。(Herman EMiHelm RM, J ung RiKinney AJ. Genetic modification removes an immunodominant allergen from soybean. Plant Physiology，2003，132 :36一43.ノoi也为遗传改良去除大豆中过敏蛋白基因提供了可能。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。ー种转基因脱致敏大豆新材料的制备方法，将大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi通过农杆菌介导的方法导入大豆；所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi是将序列为SEQ ID N0. 2的Gly m Bd 30K基因的发卡结构插入到载体pCAMBIA3301的RiiI I和BstE II位点得到。所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体的构建方法，包括如下步骤1)大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K干扰片段序列SEQ ID NO. 1的获得以大豆 iNYlOOl'籽粒为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以大豆cDNA为模板，设计上游引物I3S SEQ ID N0. 3，下游引物1 :SEQ ID NO. 4，扩增得到大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K的干扰片段，PCR产物连接到PMD19-T载体，测序验证；2)内含子序列的获得以质粒pCAMBIA3301为模板，设计上游引物Is :SEQ ID NO. 5，下游引物Ia :SEQ IDNO. 6扩增得到内含子序列，PCR产物连接到pMD19-T载体，测序验证；3)发卡结构序列的获得通过融合PCR的方法，设计四条引物 P1 =SEQ ID No. 7,P2 =SEQ ID No. 8,P3 :SEQ ID No. 9, P4 =SEQ ID No. 10进行3轮PCR，将30K干扰片段与内含子序列以大豆过敏蛋白基因 Glym Bd30K的干扰片段反向序列-内含子-大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K的干扰片段正向序列的形式连接，形成发卡结构，并导入酶切位点RiiI I和BstE II，PCR产物连接到pMD 19-T载体，测序验证；4)30K 干扰表达载体 pCAMBIA3301-30K-RNAi 的构建PmI I/BstEII双酶切发卡结构的PCR产物，插入到pCAMBIA3301载体PmI I和 BstE II位点，酶切验证，干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi构建成功。转染所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301_30K_RNAi的細胞。所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301_30K-RNAi在转基因大豆脱致敏新材料、新品种培育中的应用。有益效果本发明构建了一个沉默大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K基因的RNAi发卡结构， 并导入到含有除草剂抗性基因(bar)的表达载体pCAMBIA3301中，获得植株干扰表达载体 pCAMBIA3301-30K-RNAi。bar基因既可作为筛选标记基因，也可以作为抗除草剂的功能基因。转基因大豆籽粒中过敏蛋白Gly m Bd 30K基因的表达量明显降低，同时转化株具有除草剂抗性。
图1干扰载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建流程图2植物表达载体pCAMBIA3301-30K_RNAi的鉴定A :30K干扰片段琼脂糖凝胶电泳分析M =DNA Marker (2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)，1 :30K 干扰片段；B 内含子片段琼脂糖凝胶电泳分析M=DNA Marker(1. 5Kb/lKb/0. 9Kb/0. 8Kb/0. 7Kb/0. 6Kb/0. 5Kb/0. 4Kb/0. 3Kb/0. 2K b/0. 1Kb), 1 :内含子；C :30K片段反向连接到内含子的5、端琼脂糖凝胶电泳分析M =DNA Marker (2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)，1 :30K 反向-内含子；D :30K片段正向连接到内含子的3、端琼脂糖凝胶电泳分析M =DNA Marker (2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)，1 发卡结构；E 植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi质粒双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分折M=DNA Marker(10Kb/9Kb/8Kb/7Kb/6Kb/5Kb/4Kb/3Kb/2Kb/lKb)，1 :pCAMBIA3301-30K-RNAi 双酶切(PmI I/BstE II)；图3植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K_RNAi图谱图4转基因大豆的再生
A :无菌苗；B 子叶节外植体；C 农杆菌菌液；D 不定芽的形成；E 芽伸长；F 再生植株生根；F 移植成苗图5转基因大豆T1代植株PCR鉴定A :bar基因的PCR扩增；B ⑶S基因的扩增M =DNA Marker (2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb) ；P 阳性对照(质粒)； WT 阴性对照(野生型植株)；1，2，3，4，6，7，8，9，10，13，14，15 转化植株；11，12 分离植株图6转基因大豆叶片Basta涂抹鉴定A 转基因大豆叶片；B 野生型大豆叶片图7转基因大豆花和种子⑶S染色鉴定A 花GUS染色；B 种子GUS染色图8转基因大豆30K基因相对表达量的測定提取转基因大豆籽粒总RNA，反转录成cDNA后用于荧光定量PCR。大豆环孢素A 受体基因(CYP2)作为内參基因。通过公式2_“CT计算出T1代12棵转化株相对于对照株中30K基因的相对表达量。
具体实施例方式下述实施方法若无特殊说明均为常规方法。下述实施方法中所用的试剂、材料，如无特殊说明均可通过商业途径得到。实施例1植物双价表达载体pCAMBIA3301-30K_RNAi的构建本发明所构建植物表达载体以pCAMBIA3301载体为基础载体，构建的策略如图1 所示，具体实施方式
如下1.30K干扰片段的克隆选用结荚期大豆‘ΝΥ100Γ的嫩荚作为材料，參照TaKaRa公司总RNA提取试剂盒 (目录号D9108A)说明书方法，提取籽粒总RNA并反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物， 參照大豆Gly m Bd 30K (以下简称30K)基因序列信息(NCBI登录号EU883600)，设计引物扩增序列为SEQ ID NO. 1所示的30K干扰片段；上游引物Ps :5, -CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC-3’ (SEQ ID NO. 3)下游引物Pa:5' -GATGGTCACAAGAATATTGTTC-3 ‘ (SEQ ID NO. 4)以上述籽粒cDNA为模板，进行PCR反应，凝胶电泳检测(如图2_A所示)50 μ L 反应体系包含10 X PCR Buffer 5. 0 μ L, dNTP mix 4· 0 μ L (2. 5mmol ·じ1)，MgCl2 3μ L(25mmol ·じ1)，Ps、Pa 弓丨物各 1· 0μ L(20ymol ·じ1)，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1. 0μ L，ddH20 补至 50 μ L ；反应程序94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，51. 8°C 复性30sec，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C总延伸IOmin ；PCR产物用凝胶回收试剂盒 (AXYGEN,目录号:AP-GX-50)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa,目录号:D2011A)连接到 PMD19-T载体(TaKaRa，目录号D102A)，转化T0P10感受态細胞，进行序列测定；2.内含子序列的克隆以质粒pCAMBIA3301为模板，參照GUS基因(NCBI登录号AF485783)中内含子序列信息设计引物扩增内含子片段；上游引物Is:5' -GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT-3‘ (SEQ ID N0. 5)
6
下游引物Ia:5' -CTGTAACTATCATCATCATCAT-3‘ (SEQ ID NO. 6)以质粒pCAMBIA3301为模板，进行PCR反应，凝胶电泳检测(如图2_B所示)。 50 μ L 反应体系包含10 X PCR Buffer 5. 0 μ L, dNTP mix 4· 0 μ L (2. 5mmol ·じ1)，MgCl2 3yL(25mmol ·じ1)，Is、Ia 弓丨物各 L0yL(20ymol ·じ1)，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L, ddH20 补至 50 μ L ；反应程序94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，45. 3°C复性30seC，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C总延伸IOmin ；PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，用T4DNA连接酶连接到pMD19-T载体，转化T0P10感受态細胞，进行序列測定；3.发卡结构的构建通过融合PCR的方法将三个片段(反向A-内含子I-正向S)连接起来。设计四条引物，P” P2> p3、P4，在两端引入酶切位点PmII和BstEIIo以下用PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa 目录号=DROlOA)引物序列30k 反向序列上游引物 P1 5~ -ACCACGTGGATGGTCACAAGAAT-3~ (SEQ ID No. 7)30k 反向序列下游引物 P2 5~ -ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG-3~ (SEQ ID No. 8, P2 各有A和I的部分序列)内含子的下游引物 P3 :5:GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCA-3~ (SEQ ID No. 9，P3 各有I和S的部分序列)30k正向序列的下游引物P4 -TATGGTGACCGATGGTCACAAGAAT-3~ (SEQ ID No. 10)(1)第一轮PCR 以Gly m Bd 30K干扰片段为模板，P1, P2为引物进行扩増PCR 反应体系10 X PCR Buffer 5. 0 μ L, dNTP mix 4· 0 μ L (2. 5mmol ·じ1)，引物 P1 禾ロ P2 各 1·0μΜ20μπιο1 ·じ1)，P rimeSTAR HS DNA Polymerase 0· 4 μ L，cDNA 模板 1 μ L， ddH20补至50 μ L ；反应程序94°C预变性5min，94°C变性30sec，52°C复性lmin，72°C延伸 45s, 30个循环后，72°C总延伸lOmin，获得部分融合的A。カロ A 反应5 μ L IOx A—Tailing Buffer,4y L dNTP Mixture,0. 5 μ L Α-Tailing Enzyme (TaKaRa, D404), 4 μ g DNA，ddH20 补至 50 μ し 72°C反应 20min，冰置 l_2min。PCR 产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，用T4DNA连接酶连接到pMD19-T载体，转化T0P10感受态细胞，进行序列測定；(2)第二轮PCR 以融合片段A和I为模板，P1, P3为引物进行扩增PCR 反应体系10 X PCR Buffer 5. 0 μ L, dNTP mix 4· 0 μ L (2. 5mmol ·じ1)，A 片段和 I 片段各 1. 0 μ L(20 μ mol ·じ1)作模板，引物 P” P3 各 1. 0 μ L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 4μ L, ddH20 补至 50 μ L ；反应程序94°0 预变性 5min，94°C 变性 30sec， 54. 7 °C复性30sec，72 °C延伸lmin，30个循环后，72 °C总延伸lOmin，获得部分融合的 A-I (如图3-C所示)。カロ A 反应5 μ L IOXA-Tailing Buffer,4y L dNTP Mixture,0. 5 μ L Α-Tailing Enzyme,4y g DNA最后补水至50 μし72°C反应20min，冰置l-anin。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，用T4DNA连接酶连接到pMD19-T载体，转化T0P10感受态細胞，进行序列測定；(3)第三轮PCR:以融合片段A-I和Gly m Bd 30K干扰片段为模板，Pp P4为引物进行PCR扩增PCR 反应体系10XPCR Buffer 5. 0 μ L, dNTP mix 4. 0 μ L(2. 5mmol ·じ1)，融合片段 A-I 和 Gly m Bd 30K 干扰片段各 1. 0 μ L 作模板，P” P4L OyL, PrimeSTAR HS DNA Ρο1γπ ΘΓ38Θ0·4μ ，(ΜΗ20*·50μ ；反应程序94°C预变性 5min，94°C变性 30sec，55°C复性lmin, 72°C延伸lmin, 30个循环后，72°C总延伸IOmin,获得发卡结构A-I-S (如图2-D所示)°カロ A 反应5 μ L IOx A—Tailing Buffer,4y L dNTP Mixture,0. 5 μ L Α-Tailing Enzyme,4y g DNA最后补水至50 μし72°C反应20min，冰置l-anin。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，用T4DNA连接酶连接到pMD19-T载体，转化T0P10感受态細胞，进行序列測定，获得的发卡结构A-I-S序列如SEQ ID NO. 2所示；4.植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建(I)PmII和BstEII双酶切分別取pCAMBIA3301载体和第3步所得到发卡结构的PCR产物各15yL用PmI I和BstE II双酶切，双酶切体系(50 μ L) :10XBuffer 15 μ L(NEB)，BSAO. 5 μ L, DNA 15 μ L, BstEIIl. 0 μ L，PmII 1. 0μ L, ddH20 补至 50 μ L ；37°C 反应池；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收质粒PCAMBIA3301大片段和发卡结构小片段；(2)上述回收的大片段和小片段，按照1 4的比例，用T4DNA连接酶连接，连接反应体系10 X T4Iigase Buffer 2. 5 μ L，pCAMBIA3301 大片段 2 μ L，发卡结构小片段 8 μ L， T4DNA连接酶1 μ L，ddH20补至25 μ L ； 16°C反应过夜，取10 μ L连接产物转化Τ0Ρ10感受态細胞。37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，提取质粒，进行双酶切验证(如图2-Ε所示)， 植物表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建成功(如图3所示)。实施例2 质粒 pCAMBIA3301-30K-RNAi 转染农杆菌 EHA105(1)质取2μβαθμ1)纯化的质粒り〇八1^认3301-301(-1 離し加入20(^し农杆菌 ΕΗΑ105感受态，混勻；(2)冰浴5min，转入液氮冷冻Imin ；(3)加入 800 μ L YEB 液体培养基，250rpm, 28°C，4_5h ；(4)用移液器将菌液移至YEB固体选择培养基(含相应抗生素)均勻涂布；( ^培养l-2d，挑取单菌落，提质粒，酶切检測。实施例3农杆菌介导30K干扰表达载体转化大豆1.外植体的制备及侵染取成熟饱满的大豆‘ΝΥ100Γ种子，表面消毒后接种于萌发培养基(B5+3%蔗糖 +0.8%琼脂，pH 5. 8)，25°C条件下，光照(16/81ι，90μπιΟ1 πΓ、—1)培养5_6天获得无菌苗 (如图4-Α所示)。保留子叶下方2-3cm的下胚轴，垂直沿下轴胚将子叶分开，水平划5_7 次腋芽原基区，得到子叶节外植体(如图4-B所示)。将农杆菌EHA105(含pCAMBIA3301_30K_RNAi)划线于平板，沘で培养Mh，挑取单克隆液体培养Mh，然后取2ml菌液加入200ml YEP液体培养基中，扩大培养至OD65tl 为0. 6-0. 8，菌液离心后，用液体共培养培养基(1/10B5，1. 67mg ·じ16-苄基氨基嘌呤， 0. 25mg ·じ1赤霉素，200μπιΟ1 じ1乙酰丁香酮，3%蔗糖和0. 7%琼脂，pH 5.4)重悬，调节 OD65tl值为1(如图3-C所示)。外植体放入到50ml重悬菌液中，侵染30min。侵染结束后，吸干多余菌液，将外植体近轴面向下接种于铺有一层滤纸的共培养基(添加3mmol じ1L-半胱氨酸，Immol じ1硫代硫酸钠和ニ硫苏糖醇)，25°C暗培养4天。2.大豆的再生共培养结束后的外植体，用液体芽诱导培养基(B5，1. 67mg ·じ16_苄基氨基嘌呤， 500mg ·じ1羧苄青霉素，3% (w/v)蔗糖，3mmol · L^1MES, pH 5. 6)摇动洗涤4_5次，近轴面向上接种于固体芽诱导培养基(液体芽诱导培养基+0.8%琼脂)。25°C光照(16/8h， QOymolm-2S-1)培养10天。10天后，外植体接种于芽诱导筛选培养基(芽诱导培养基 +4mg ·じ1双丙氨磷)，筛选培养4周，每2周继代一次。筛选后含有丛生芽的外植体(如图4-D所示)，接种到芽伸长培养基(MS，Img じ1 玉米素，0. 5mg ·じ1赤霉素，0. Img ·じ1吲哚乙酸，IOOmg ·じ1焦谷氨酸，50mg ·じ1 L-天冬酰胺，300mg ·じ1羧苄青霉素，2mg ·じ1双丙氨磷，3%蔗糖，3mmol ·じ1MES和0. 8%的琼脂， PH 5. 6)，芽伸长6-8周，每隔两周继代1次。待芽伸长至34cm时(如图4_E所示)，用手术刀从基部切下，转入生根培养基 (1/2B5，0. 5mg じ1 IBA，3%蔗糖，0. 8%琼脂，pH 5. 6)，根长至ト2cm长时(如图4-F所示)， 驯化移入温室，常规管理，直至成熟收获(如图4-G所示)。实施例3转基因大豆的鉴定1.转基因大豆植株PCR鉴定取转基因大豆幼嫩籽粒，SDS法，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别设计 GUS和bar基因的引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检测(如图5所示)。通过对转化植株中外源基因GUS和bar的PCR检测，初歩证实植株的转基因特性。上游引物GUS 1 5~ -TGGTGACGCATGTCGCGCAAGAC-3~ (SEQ ID No. 11)下游引物⑶S25~-GGTGATGATAATCGCCTGATGCAG-3~ (SEQ ID No. 12)上游引物barl _GCACCATCGTCAACCACTAC_3~ (SEQ ID No. 13)下游引物bar2 _TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC_3~ (SEQ ID No. 14)⑶S基因的PCR扩增程序94°C预变性5min，94°C变性45sec，55°C复性lmin，72°C 延伸lmin，30个循环后，72°C总延伸lOmin，bar基因的PCR扩增程序94°C预变性5min， 94°C变性 45sec，58°C 复性 lmin，72°C延伸 lmin，30 个循环后，72°C总延伸 IOmin02.转基因大豆Basta涂抹鉴定选取健康生长的转基因大豆和野生型大豆叶片，用棉棒蘸取0. 05% Basta涂抹于半张叶片，五天之后观察叶片表现，拍照记录(如图6所示)。图6所示，非转基因植株涂抹 Basta的半张叶片表现出失緑，而转基因植株的叶片正常，显示出Basta的抗性。3.转基因大豆花和种子的⑶S鉴定取转基因大豆和野生型大豆花和种子，分别置于⑶S染色液[50mmol ·じ1磷酸钠缓冲液(pH 7.0),1% (v/v) Triton X 100, 20% (ν/ν)甲醇，50mmol ·じ1 六氰合亚铁酸钾， 50mmol ·じ1 六氰合铁酸钾，lmMX-gluc(G0LDBI0，@—:G1281C)]中，37°C染色 12h。70% 乙醇脱色后，拍照观察(如图7所示)。与对照组相比转化植株的花和种子都有⑶S表达， 进ー步证明植株的转基因特性。4.转基因大豆中Gly m Bd 30K基因相对表达量的测定实时荧光定量PCR反应在安捷伦荧光PCR系统M3005P上进行，大豆环孢素A受体基因(CYP2)作为内參基因。分别设计CYP2和30K基因的RT-PCR引物
上游引物FCYP:5' -CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA-3‘ (SEQ ID No. 15)下游引物RCYP:5' -CCCCTCCACTACAAAGGCTCG-3‘ (SEQ ID No. 16)上游引物FK 5~ -GGTTCAGCGGATGGTGTAGATTA-3~ (SEQ ID No. 17)下游引物RK 5~ -TGGTTGGGTATGAAGCGAAATAA-3~ (SEQ ID No. 18)为检测大豆种子中30K基因的表达情況，取成熟期大豆种子，提取总RNA(參照 TaKaRaTrizol Reagent说明书)，按照反转录试剂盒(TaKaRa，货号DRR047A)的方法将RNA 反转录为cDNA，进行荧光定量PCR反应。反应体系參照TaKaRa SYBR I^emix Ex Taq11Hl 明书，25 μ L体系包括SYBR Premix Ex Taq 2 μ L，上游引物和下游引物(CYP2和30Κ基因)各0. 5 μ L，cDNA模板2 μ L，ddH20 9. 5 μし反应程序95°C预变性30sec后，95°C变性 5s，60°C退火20s，40个循环。30K基因的相对表达量=2_崎，Δ ACT = (C讓_CT,cyp2)转基因株系-(CT,麗_CT,cyp2)野生 ，其中CT,3(1K =30Κ基因的Ct值，CT,。yp2 :环孢素A受体基因的Ct值。对T1代12棵转化株的籽粒进行相对定量(如图8所示)，将对照组中的30K基因的表达量定为1，由图8可观察到，所有转化株籽粒中的30K基因的表达量均远低于对照組。 表明干扰载体pCAMBIA3301-30K-RNAi明显地降低了转基因植株中Gly mBd 30K基因在籽粒中的表达量。
权利要求
1.大豆Glym Bd30K基因RNA干扰，其特征在于选择大豆Gly m Bd30K基因用于RNA 干扰的基因片段序列为SEQ ID NO. 1。
2.大豆Glym Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301_30K_RNAi，其特征在于构建RNAi的发卡结构，其序列为SEQ ID NO. 2，并将Gly mBd 30K基因的发卡结构插入到载体 PCAMBIA3301 的 PmII 和 BstE II 位点得到。
3.权利要求2所述的大豆GlymBd 30K基因RNA干扰表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)大豆过敏蛋白基因Glym Bd30K干扰片段序列SEQ ID NO. 1的获得以大豆籽粒为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以大豆cDNA为模板，设计上游引物I3S =SEQ ID NO. 3，下游引物!3a:SEQ ID NO. 4，扩增得到大豆过敏蛋白基因Gly mBd 30K的干扰片段，PCR产物连接到pMD 19-T载体，测序验证；2)内含子序列的获得以质粒pCAMBIA3301为模板，设计上游引物Is =SEQ ID NO. 5，下游引物Ia =SEQ ID NO. 6扩增得到内含子序列，PCR产物连接到pMD19-T载体，测序验证；3)发卡结构序列的获得通过融合PCR的方法，设计四条引物Pl :SEQ ID No. 7、P2 :SEQ ID No. 8、P3 :SEQ ID No.9,P4 =SEQ ID No. 10进行3轮PCR，将30K干扰片段与内含子序列以大豆过敏蛋白基因 Glym Bd30K的干扰片段反向序列-内含子-大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K的干扰片段正向序列的形式连接，形成发卡结构，并导入酶切位点RiiI I和BstE II，PCR产物连接到 PMD19-T载体，测序验证；4)30K干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建PmI I/BstE II双酶切发卡结构的PCR产物，插入到pCAMBIA3301载体PmI I和BstE II位点，酶切验证，干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi构建成功。
4.转染权利要求2所述的大豆Glym Bd 30K基因RNA干扰表达载体 pCAMBIA3301-30K-RNAi 的細胞。
5.权利要求2所述的大豆Glym Bd 30K基因RNA干扰表达载体 pCAMBIA3301-30K-RNAi在转基因大豆脱致敏新材料、新品种培育中的应用。
6.权利要求4所述的转染大豆Glym Bd 30K基因RNA干扰表达载体 pCAMBIA3301-30K-RNAi的細胞在转基因大豆脱致敏新材料、新品种培育中的应用。
全文摘要
本发明属于分子生物学与生物技术领域，涉及一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。该方法是将大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi通过农杆菌介导的方法导入大豆；所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi是将序列为SEQ ID NO.2的Gly m Bd 30K基因的发卡结构插入到载体pCAMBIA3301的PmI I和BstEII位点得到。本发明获得的脱致敏转基因大豆籽粒中过敏蛋白Gly m Bd 30K基因的表达量明显降低，同时转化株具有除草剂抗性。
文档编号C12N15/84GK102533762SQ20111043775
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者刘思辰, 朱月林, 杨立飞, 盖钧镒 申请人:南京农业大学