一种制备低致敏大豆蛋白的方法
【专利摘要】一种制备低致敏大豆蛋白的方法，（1）将新鲜干大豆，洗净，37℃恒温浸泡8h；（2）浸泡后的大豆转移至培养箱，温度为30℃，湿度为85%，发芽1-5d后，提取大豆蛋白；（3）将大豆蛋白40-60℃、pH6.0-8.0酶水解2-6h，酶添加量E/S=1/20-1/50，搅拌并使反应体系pH值稳定，反应后90-100℃灭酶8-10min，速冷反应液，5000g/min，离心分离15-20min；（4）酶解液-40℃预冻12h，然后在冷冻温度-65℃、真空度100Pa、加热板温度50℃，真空冷冻干燥24h，水分含量在5%以下。本发明操作简单，易于控制，且安全、经济；产品致敏性低、营养价值高，能满足大豆过敏患者的消费要求，具有良好的推广和应用前景，可用于食品、药品和化妆品等领域。
【专利说明】一种制备低致敏大豆蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]大豆是我国主要的植物性蛋白食物资源，但同时大豆也是8类主要致敏食物之一，目前约有0.3%~0.4%的婴幼儿患有大豆过敏症，此外，随着大豆制品种类的增多，成年人大豆过敏的发病率也在不断上升。迄今为止，大豆过敏尚无特效疗法。因此大豆中的致敏蛋白限制了大豆蛋白在食品加工工业中的广泛应用，为了体现大豆蛋白高营养价值的特性，同时保障大豆过敏患者的健康和安全，寻找有效途径来降低或去除大豆蛋白中的主要致敏成分，开发低致敏性大豆食品，越来越受到人们的关注。
[0003]目前，大豆蛋白常用的脱敏技术包括物理法、化学法、基因工程法和酶处理法等。加热是脱敏常用的方法，由于大豆蛋白经过热加工处理引起的Maillard反应可能会产生新的致敏原表位，从而难以有效的降低大豆蛋白的致敏性。而紫外辐照等方法会影响大豆产品的风味，并且基于安全考虑，在有些食品的国标中明确指出不可采用辐照原料。此外根据大豆致敏蛋白的物理化学特性，可通过调节大豆蛋白溶液的pH、无机盐种类、溶剂的极性等使其沉淀或萃取，从而降低致敏蛋白的含量，但是其效率较低。基因工程法可以单纯地去除大豆致敏原的内源基因，但是这些蛋白的缺失很可能会直接影响大豆植株的生长及其相关的生理特性，而且基因改造食品本身还存在着安全性的争议。
[0004]酶解法是一种较 常用的蛋白改性法。酶解作用可以破坏大豆蛋白的一些致敏表位，特别是大豆蛋白的构象性表位，也可以通过断裂一些化学键来破坏致敏原表位的一级结构，从而降低或者消除大豆蛋白致敏性。但是天然大豆蛋白分子高度压缩，结构致密，对酶解作用具有很强的抵抗力。因此，要增强大豆蛋白对酶的敏感度，提高其水解度，就必须对大豆蛋白进行预处理，使其结构由高度致密变得松散，暴露出分子内部的酶作用位点以利于与酶的结合。而经发芽处理后，大豆种子受内源性酶的作用发生了生理生化变化，其化学成分改变，营养价值升高，大豆蛋白的致敏性也会降低；而且在此期间蛋白质结构变得松散，酶的作用位点暴露，当加入外源性酶时，酶水解速度加快。因此，采用发芽协同酶解法能有效降低大豆蛋白的致敏性。
[0005]目前，国内对大豆食品的研究主要集中在油脂提取、蛋白质加工和豆腥味消除等方面，对于大豆致敏性的研究以及开发低敏性大豆制品尚处于起步阶段。因此，本发明提供了一种发芽结合酶解法降低大豆蛋白致敏性的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的在于提供一种制备低致敏性大豆蛋白的方法。
[0007]本发明所采取的技术方案如下。
[0008](I)称取一定质量新鲜干大豆，冲洗干净后，加适量水，37°C恒温浸泡8 h。
[0009](2)将步骤(1)浸泡后的大豆转移至培养箱，温度为30°C，湿度为85%，发芽1-5 d后，常规方法提取大豆蛋白。
[0010](3)将步骤(2)所提大豆蛋白进行酶水解，酶解温度40-60°C，pH 6.0-8.0，酶的添加量为E/S=l/20-l/50，时间2-6 h，期间不断搅拌并使反应体系pH值保持相对稳定，反应结束后在90-100°C灭酶8-10 min，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000 g/min，离心分离15-20 min，得到上层的酶解液。
[0011]所述的酶为Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶或Protamex复合蛋白酶中任意一种。
[0012](4)将步骤(3)所得的酶解液在_40°C预冻12 h，然后在冷冻温度为_65°C、真空度100 Pa、加热板温度50°C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏大豆蛋白。
[0013]本发明采用ELISA法，通过分析蛋白酶解产物与大豆过敏患者血清IgE的结合能力评价其致敏性。
[0014]本发明的优点是:1、本发明所采用发芽协同酶解技术降低大豆蛋白的致敏性，操作简单，易于控制，且安全、经济。2、采用本发明专利得到的产品致敏性低、营养价值高，能满足大豆过敏患者的消费要求，具有良好的推广和应用前景，可用于食品、药品和化妆品等领域。
【具体实施方式】 [0015]本发明将通过以下具体实施例作进一步说明。
[0016]实施例1。
[0017](I)称取一定质量新鲜干大豆，用1%的双氧水杀死附着在种子表面的病原菌，冲洗干净后，加入大豆质量5倍体积的自来水，置于37°C恒温培养箱中浸泡8 h。
[0018](2)将步骤(1)浸泡后的大豆转移至种子培养箱，培养温度为30°C，湿度为85%，发芽时间为5 d。将所得的豆芽冻干，液氮研磨，按丙酮1/20 (w/v)脱脂3 h，然后于4。C10, 000 g/min离心10 min，弃上清，通风橱中挥发去丙酮后备用，得脱脂大豆粉。脱脂大豆粉按1:10 (w/v)溶于Tris-HCL缓冲液(pH 8.0，0.05mol)中震荡提取2 h，然后于4° C10,000 g/min离心10 min,取上清待用，即得大豆蛋白。
[0019](3)将步骤(2)所提的蛋白进行酶水解，控制温度50°C，pH 7.0，按照大豆蛋白质量，Alcalase碱性蛋白酶的添加量为E/S=l/20，酶解2 h，期间不断搅拌并使反应体系pH值保持相对稳定，反应结束后在100°C灭酶10 min，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000 g/min,离心分离20 min,得到上层的酶解液。
[0020](4)将步骤(3)所得的酶解液在_40°C预冻12 h，冷冻温度为_65°C，真空度100Pa，加热板温度50°C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏大豆蛋白。
[0021]实施例2。
[0022](I)称取一定质量新鲜干大豆，用1%的双氧水杀死附着在种子表面的病原菌，冲洗干净后，加入大豆质量5倍体积的自来水，置于37°C恒温培养箱中浸泡8 h。
[0023](2)将步骤(1)浸泡后的大豆转移至种子培养箱，培养温度为30°C，湿度为85%，发芽时间为4 d。将所得豆芽冻干，液氮研磨，按丙酮l/20(w/v)脱脂3 h，然后于4° C 10, 000g/min离心10 min，弃上清，通风橱中挥发去丙酮后备用，得脱脂大豆粉。脱脂大豆粉按1:10 (w/v)溶于 Tris-HCL 缓冲液(pH 8.0，0.05mol)中震荡提取 2 h，然后于 4° C 10,000g/min离心10 min,取上清待用，即得大豆蛋白。
[0024](3)将步骤(2)所提取的蛋白进行酶水解，控制温度45°C，pH 6.5，按照大豆蛋白质量，Flavourzyme风味蛋白酶的添加量为E/S=l/50,酶解4 h,期间不断搅拌并使反应体系PH值保持相对稳定，反应结束后在100°C灭酶10 min，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000 g/min,离心分离20 min,得到上层的酶解液。
[0025](4)将步骤(3)所得的酶解液在_40°C预冻12 h，冷冻温度为_65°C，真空度100Pa，加热板温度50°C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏大豆蛋白。
[0026]实施例3。
[0027](I)称取一定质量新鲜干大豆，用1%的双氧水杀死附着在种子表面的病原菌，冲洗干净后，加入大豆质量5倍体积的自来水，置于37°C恒温培养箱中浸泡8 h。
[0028](2)将步骤(1)浸泡后的大豆转移至种子培养箱，培养温度为30°C，湿度为85%，发芽时间为4 d。将所得豆芽冻干，液氮研磨，按丙酮l/20(w/v)脱脂3 h，然后于4° C 10, 000g/min离心10 min，弃上清，通风橱中挥发去丙酮后备用，得脱脂大豆粉。脱脂大豆粉按1:10 (w/v)溶于 Tris-HCL 缓冲液(pH 8.0，0.05mol)中震荡提取 2 h，然后于 4°C 10,000g/min离心10 min,取上清待用，即得大豆蛋白。
[0029](3)将步骤(2)所提的蛋白进行酶水解，控制温度55°C，pH 7.0，按照大豆蛋白质量，Neutrase中性蛋白酶的添加量为E/S=l/20，酶解3 h，期间不断搅拌并使反应体系pH值保持相对稳定，反应结束后在90°C灭酶10 min，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000g/min,离心分离20 min,得到上层的酶解液。
[0030](4)将步骤(3)所得的酶解液在_40°C预冻12 h，冷冻温度为_65°C，真空度100Pa，加热板温度50°C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏大豆蛋白。
[0031]实施例4。
[0032](I)称取一定质量新鲜干大豆，用1%的双氧水杀死附着在种子表面的病原菌，冲洗干净后，加入大豆质量5倍体积的自来水，置于37°C恒温培养箱中浸泡8 h。
[0033](2)将步骤(1)浸泡后的大豆转移至种子培养箱，培养温度为30°C，湿度为85%，发芽时间为4 d。将所得豆芽冻干，液氮研磨，按丙酮l/20(w/v)脱脂3 h，然后于4° C 10, 000g/min离心10 min，弃上清，通风橱中挥发去丙酮后备用，得脱脂大豆粉。脱脂大豆粉按1:10 (w/v)溶于 Tris-HCL 缓冲液(pH 8.0，0.05mol)中震荡提取 2 h，然后于 4°C 10,000g/min离心10 min,取上清待用，即得大豆蛋白。
[0034](3)将步骤(2)所提的蛋白进行酶水解，控制温度40°C，pH 6.5，按照大豆蛋白质量,Protamex复合蛋白酶的添加量为E/S=l/20,酶解3 h,期间不断搅拌并使反应体系pH值保持相对稳定，反应结束后在90°C灭酶10 min，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000g/min,离心分离20 min,得到上层的酶解液。
[0035](4)将步骤(3) 所得的酶解液在_40°C预冻12 h，冷冻温度为_65°C，真空度100Pa，加热板温度50°C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏大豆蛋白。
【权利要求】
1.一种制备低致敏大豆蛋白的方法，其特征是按以下步骤: (1)称取一定质量新鲜干大豆，冲洗干净后，加适量水，37°C恒温浸泡8 h ； (2)将步骤(1)浸泡后的大豆转移至培养箱，温度为30°C，湿度为85%，发芽1-5d后，提取大?蛋白； (3)将步骤(2)所提大豆蛋白进行酶水解，酶解温度40-60°C，pH6.0-8.0,酶的添加量E/S=l/20-l/50,时间2-6 h，期间不断搅拌并使反应体系pH值保持相对稳定，反应结束后在90-100°C灭酶8-10 min，快速冷却反应液，然后采用离心机转速5000 g/min，离心分离15-20 min，得到上层的酶解液； (4)将步骤(3)所得的酶解液在_40°C预冻12h，然后在冷冻温度_65°C、真空度100Pa、加热板温度50°C，真空冷冻干燥24 h，水分含量在5%以下，干燥后所得粉末即为低致敏大豆蛋白； 步骤(3)所述的酶为Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶或Protamex复合 蛋白酶中的一种。
【文档编号】C12P21/06GK103981244SQ201410199893
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】陈红兵, 杨慧, 杨安树, 范膑 申请人:南昌大学