用于治疗呼吸道病毒感染的组合物及其用途的制作方法

专利名称：用于治疗呼吸道病毒感染的组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及干扰呼吸道病毒感染，特别是呼吸道合胞体病毒和甲型禽流感病毒(包括H5N1株)中的病毒复制的siRNA组合物。本发明进一步涉及siRNA组合物的用途，所述的组合物用于抑制病毒基因在呼吸道病毒感染的细胞中的表达，并用于治疗患者的呼吸道病毒感染。
背景技术：
几个世纪以来，呼吸道病毒感染已经成为人类健康和生命的重大威胁。众所周知的事件包括由流感病毒株、呼吸道合胞体病毒引起的感染以及严重急性呼吸器官综合症(SARS)。这些包括1981年的全球性流感大流行，其导致全世界范围内约20-40百万人口死亡。在最近的十年里也存在其它的流感大流行。2002年SARS的爆发夺去了大约800条生命⑵。呼吸道合朐体病毒呼吸道合胞体病毒(RSV)感染是严重的儿童呼吸道疾病的主要原因。大约三分之ニ的婴儿在生命的第一年里感染RSV并且几乎100%的婴儿在两岁时已经感染了 RSV。目前不存在特异性和有效的治疗剂来用于治疗RSV感染。呼吸道合胞体病毒(RSV)是有包膜的，不分节的单链负链RNA病毒(NNR)，其属于单链负链病毒目中的副粘病毒科(14，29)。副粘病毒共同具有下列性质。I)它们具有病毒核衣壳蛋白(N)紧紧包被的单链RNA基因组29，30。2)亚基因组mRNA通过RdRP从负基因组转录。3)病毒复制在宿主细胞的细胞质中进行。RSV从感染到子代病毒颗粒释放的生命周期的细节得以充分地研究(15)。RSV 基因组是 15. 5kb 长的负链，包含基因 3' -NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2、L-5/ (见图I)。这些基因中有7个基因产物是和其它的副粘病毒3共有的，即N、P、M、SH、G、F和しー些病毒或宿主因子涉及调节RNA转录和复制(20)。另外，存在病毒顺式作用信号，这些信号在mRNA转录和RNA复制中起调节作用(3)。RSV感染的潜伏期大约为4-5天；它首先感染鼻咽，然后在几天内，它到达支气管和细支气管，感染局限于呼吸上皮的浅层。甲型流感从1997年开始，出现了新的甲型禽流感株，即H5N1。虽然主要局限于禽类(野生群体和家禽两者)，但是该病毒显然仅感染与受感染的禽类直接接触的人。在人中，该感染引起严重疾病，导致人的严重呼吸器官疾病和死亡(3-12)。许多案例和爆发已经在东南亚的许多国家发生。鉴于禽病毒感染人的能力，存在増加的突变成传染性人变种的风险，具有出现新的流感大流行的风险，该流感大流行具有有效且持续的人与人之间的传播和高的死亡率。由于禽流感H5N1是ー种新出现的与肺炎相关的传染性病原体并且它的病理学和机制不是很清楚，因而在人的疾病案例中仍没有用于H5N1禽流感的特异性和有效的治疗。目前，流感感染用抗病毒剂，例如这两种药物(属于神经氨酸酶抑制剂类)奥塞米韦(商业上称为Tamiflu)和扎那米韦(商业上称为Relenza)或老的M2抑制剂金刚烷胺和金刚こ胺治疗。H5N1是甲型流感病毒的ー个亚型。因而它是有包膜的，有分节的负单链RNA病毒，属于正粘病毒科。在甲型流感病毒(包括H5N1)的生命周期中，病毒基因组RNA(vRNA)用作互补RNA(cRNA)产生的模板，所述的病毒基因组RNA还用作信使RNA (mRNA)产生的模板。在病毒复制过程中产生的这三种类型的RNA分子的每种都能用有义或反义siRNA来靶向，用于siRNA介导的降解。甲型流感基因组，其由包含至少10个开放阅读框(ORF)的8个单独的RNA片段构成，可用作病毒基因组复制和亚基因组或基因引导的mRNA合成的模板。图2显示了描述甲型流感病毒颗粒结构的图示。聚合酶PB2、PB1 (聚合酶碱性蛋白I和2)和PA(聚合酶酸性蛋白)分别由RNA1、RNA2和RNA3编码。四种病毒结构蛋白H(血凝素)、N(神经氨酸酶)、Ml和M2 (基质蛋白I和2)分别由RNA片段4、6和7编码，而RNA5编码NP(核壳体蛋白)以及RNA8编码NSl和NS2(非结构蛋白I和2)。RNA 干扰RNA干扰(RNAi)是序列特异性RNA降解过程，所述的过程提供了相对容易和直接的方式来分解或沉默理论上的任何基因(17、18、19)。在自然发生的RNA干扰中，双链RNA通过RNA酶III/螺旋酶蛋白Dicer切割成小干扰RNA(siRNA)分子中，即在3'末端具有2-nt突出端的19-23个核苷酸(nt)的dsRNA。这些siRNA整合进称为RNA-诱导-沉默复合体(RISC)的多组分-核糖核酸酶中。siRNA的一条链保持与RISC结合，并引导该复合体接近与RISC中的该ss-siRNA引导序列互补的同源RNA。这种siRNA引导的核酸内切酶消化该RNA，从而使其失活。目前的研究已经表明，化学合成的21-25nt siRNA的使用在哺乳动物细胞中显示出RNAi效果(20)，并且siRNA杂交(在末端或中间)的热力学稳定性在决定该分子的作用中起重要作用(21，22)。RISC、siRNA分子和RNAi的这些及其它特性已经得以描述(23-28)。在实验室或潜在地在治疗应用中，RNAi在哺乳动物细胞中的应用使用了化学合成的siRNA或内源性表达的分子(2，21)。内源性siRNA首先通过表达载体(质粒或病毒载体)表达成小型发夹结构RNA(shRNA)，并然后通过Dicer加工成siRNA。据认为siRNA很有希望成为用于人类疾病，特别是由病毒感染引起的疾病的治疗剂(19、20、27-30)。重要的是，目前不可能以任何可信度去预测可能靶向病毒基因组序列的多种可能的候选siRNA(例如约16-30个碱基对的寡核苷酸)中哪个将实际上会显示出有效的siRNA活性。因而，必须产生并检验单独的特定候选siRNA多核苷酸或寡核苷酸序列以确定是否已经发生了对靶基因的期望干扰。因此，本领域可以设计确信能够特异性改变给定mRNA的 表达的siRNA多核苷酸。仍然相当需要抑制病毒病原体基因和它们的同源蛋白质产物的表达的组合物和方法。特别是迫切需要组合物和方法来抑制致病性呼吸道病毒基因在病毒感染的细胞中表达，并用于在受试者中治疗呼吸道病毒感染。此外，需要治疗RSV和甲型禽流感，特别是H5N1株感染的组合物和方法。另外还需要用于治疗的组合物和方法，所述的治疗是非常有效的，并且不依赖于使用或修饰已知的抗病毒剤。本发明解决了这些问题并满足了相关的
需要

发明内容
本发明提供了涉及使用RNA干扰来抑制病毒感染和复制的组合物和方法，所述的抑制是通过分裂病毒病原体，例如那些引起呼吸道病毒感染的病毒病原体(包括甲型流感H5N1和RSV)的病毒RNA分子来获得的。这些病毒是在人和其它哺乳动物中引起严重呼吸道疾病的病原体。抑制病毒复制将对抗感染了病毒的培养细胞和受试者中的病毒感染，包括减轻它的症状。在第一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸的长度可以是15-200之间任何数目的核苷酸。多核苷酸包括靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组的第一核苷酸序列。在该多核苷酸中，任意T(胸苷)或任意U(尿苷)可以任选地被彼此替代。另外，在多核苷酸中第一核苷酸序列由以下构成a)长度为15-30之间任何数目的核苷酸的序列，或b)在a)中给出的序列的互补序列。这种多核苷酸在此可以称为线性多核苷酸。在本发明ー个相关方面，上面描述的多核苷酸进ー步包括通过环序列与第一核苷酸序列分开的第二核苷酸序列，从而第二核苷酸序列a)具有与第一核苷酸序列基本相同的长度,并且b)是与第一核苷酸序列基本互补的。在该后面的结构中，称为发夹结构多核苷酸，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列杂交而形成发夹结构，所述发夹结构的互补序列通过环(loop)序列连接。在线性多核苷酸和发夹结构多核苷酸的许多实施方案中，第一核苷酸序列是a)选自 SEQ ID NO : 1-263 的序列；b)比a)项中给出的序列长的祀向序列,其中该祀向序列(targeting sequence)靶向呼吸道病毒的基因组并包括选自SEQ ID NO 1-263的序列；c)选自SEQ ID NO :1-263的序列的片段，其中所述片段由长度为至少15个核苷酸且至多比所选择的序列短一个碱基的连续碱基序列构成；d)其中最多有5个核苷酸不同于选自SEQ ID NO :1-263的序列的序列；或e)在a)_d)中给出的任何序列的互补序列。在线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸的多种实施方案中，第一核苷酸序列的长度是21-25之间任何数目的核苷酸。在许多实施方案中，线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸由选自SEQ ID NO :1-263的序列构成，并任选包含结合至所选择的序列3'的二核苷酸突出端。然而，在线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸的另外的实施方案中，位于第一核苷酸序列的3'末端的二核苷酸序列是TT、TU、UT或UU并且包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者。在多个其它的实施方案中，线性或发夹结构多核苷酸可以是DNA，或者它可以是RNA，或者它可以由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者构成。在本发明的另外方面提供了双链多核苷酸，所述的双链多核苷酸包括在权利要求I中描述的第一条多核苷酸链和与第一条链的至少第一核苷酸序列互补并与其杂交而形成双链组合物的第二条多核苷酸链。这些多核苷酸结构也可以称为线性多核苷酸。仍然在ー另外方面中，本发明提供了包含两种或多种在权利要求I、权利要求2或两者中描述的靶向多核苷酸的组合物，这样该组合物的每个多核苷酸靶向靶标病毒的基因组中的不同序列。由于与呼吸道病毒病原体靶标的高度相似性或同一性，并且在理论上不希望被结合的，相信一旦引入至病毒感染的细胞中，该多核苷酸会引起RNA干扰，导致病原体基因组RNA、互补RNA和信使RNA的消化。特别地，在本发明这些方面的重要实施方案中，相信在这些多核苷酸中的第一核苷酸序列或其互补序列形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，所述的RNA诱导沉默复合物将多核苷酸siRNA序列引导至病原体基因组的RNA序列，从而促进病原体基因组的RNA的切割。在另外的方面，本发明提供了包含由本发明的线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸提供的序列的载体。在多个实施方案中，这些载体的任何ー种可以是质粒、重组病毒、转座子或微小染色体。仍然在另外的方面，提供了通过本发明的一个或多个线性多核苷酸，或通过本发明的一个或多个发夹结构多核苷酸转染的细胞。依然在另外的方面，本发明提供了药物组合物和可药用载体，所述的药物组合物包含一个或多个线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸，或它们的混合物，其中每个多核苷酸靶向靶标病毒基因组中的不同序列。然而在另外的方面，本发明提供了药物组合物和可药用载体，所述的药物组合物包含含有线性多核苷酸的ー个或多个载体，或含有发夹结构多核苷酸的载体，或它们的混合物，其中每个载体含有靶向靶标病毒基因组中的不同序列的多核苷酸。在药物组合物的多个实施方案中，载体包括合成的阳离子聚合物、脂质体、葡萄糖、表面活性剂或它们的任何两种或多种的组合。依然在另一方面，本发明提供了合成线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸的方法，所述的这两种多核苷酸具有靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组的序列。该方法包括以下步骤a)提供包含活性反应末端并对应所述序列第一个末端的核苷酸的核苷酸反应物；b)加入包含活性反应末端并对应该序列相继位置的另ー核苷酸反应物，用来与来自前面步骤的活性末端反应并使该生长的多核苷酸序列増加ー个核苷酸长度，并且除去不希望的产物和过剩的反应物，和c)重复步骤b)直到加入了对应于该序列第二个末端的核苷酸的核苷酸反应物；从而提供了完整的多核苷酸。依然在另外的方面，本发明提供了用于用RNA抑制剂转染细胞的方法，其中该方法包括使细胞与包含一个或多个线性多核苷酸，或一个或多个发夹结构多核苷酸的组合物接触。在许多实施方案中，如此转染的细胞包含通过ー个或多个多核苷酸靶向的呼吸道病毒。然而在另一方面，本发明提供了抑制呼吸道病毒在经病毒感染的细胞中复制的方法，所述的方法包括使细胞与包含一个或多个线性多核苷酸，或一个或多个发夹结构多核苷酸的组合物接触，其中所述的ー个或多个多核苷酸靶向病毒。
依然在另一方面，本发明提供了靶向呼吸道病毒的线性多核苷酸，或它们的两种或多种的混合物的用途，或者靶向呼吸道病毒的发夹结构多核苷酸，或它们的两种或多种的混合物的用途，所述的用途用于生产在受试者中有效治疗由呼吸道病毒引起的感染的药物组合物。在所述用途的多个实施方案中，受试者是人。 然而在另一方面，本发明提供了在受试者中治疗由呼吸道病毒引起的感染的方法。该方法包括施用有效剂量的靶向呼吸道病毒的线性多核苷酸，或它们的两种或多种的混合物给受试者，或者施用有效剂量的靶向呼吸道病毒的发夹结构多核苷酸，或它们的一种或多种的混合物给受试者。在这种方法的多个实施方案中，受试者是人。在另外的实施方案中，将线性多核苷酸和发夹结构多核苷酸两者都施用给受试者。


图I.人呼吸道合胞体病毒(hRSV、RSV) (_) ssRNA基因组的示意图。基于GenBank登记号 NC_001781。图2.甲型流感病毒结构的示意图。该图显示了整合于病毒颗粒中的病毒基因组的8个片段。图3.本发明多核苷酸的多种实施方案的示意图。图A，线性多核苷酸的实施方案。长度为200或低于200个核苷酸，并且为15个或大于15个核苷酸。在b)中，特异性靶向序列包含于更长的靶向序列中。在d)中较黑的直条图解表示取代的核苷酸。图B，全长为200个核苷酸或少于200个核苷酸的发夹结构多核苷酸的实施方案。图4.显示H5N1基因组中siRNA序列的位置的示意5.在MDCK细胞培养基中H5N1病毒生长的抑制图6.在不同时间点测定的siRNA的抑制效果
具体实施例方式在这里确定的所有专利、专利申请公开内容和专利申请通过全文引用作为參考，就如同在这里是逐字显现的。在此确定的所有技术公开内容也通过引用作为參考。在当前描述中，冠词“a”、“an”和“the”等价地指単数或复数含义。这些冠词的特殊意思在使用它们的上下文中是明显的。如于此使用的，术语“靶标”序列以及类似的术语和短语涉及本发明多核苷酸所针对的存在于病原体基因组中的核苷酸序列。多核苷酸a)通过包括与病原体基因组内包含的特定子序列(称为靶标序列)同源或者相同的序列，或者b)通过包括其互补序列与所述靶标序列同源或相同的序列来靶向病原体序列。根据RNA干扰现象，相信靶向病原体序列的任何多核苷酸具有与靶标序列杂交的能力，因而起始了 RNA干扰。如此处使用的，术语“互补序列”、“互补性序列”及相似的术语和短语指其碱基形成互补碱基对(碱基对碱基)的两个序列，如领域如生物化学、分子生物学、基因组学及与本发明领域相关的类似领域中的技术人员常规理解的。如此处使用的，当在序列或子序列的每个位点上第一个序列或子序列具有与第二个序列或子序列相同的碱基时，第一个序列或子序列是与第二个序列或子序列“相同的”，或具有“ 100%的同一性”，或通过表达100%同一性概念的术语或短语来描述。在測定同一性时，包含T(胸腺嘧啶)或任何它的衍生物，或U(尿嘧啶)或任何它的衍生物的任何特定碱基位置是彼此相同的，因而认为是同一的。如于此描述的，靶向多核苷酸的序列或其互补序列可以与靶序列完全相同，或者其在序列的特定位置可以包含错配的碱基。在这里充分描述了错配的整合。尽管不愿受理论束缚，据信整合入错配在生理学条件下提供了期望水平的杂交稳定性来优化对讨论的特定靶序列的RNA干扰现象。同一性程度决定了在两个序列中其碱基彼此相同的位置的百分比。“序列同一性百分比”是通过这样计算的在比较区来比较经最佳比对的两个序列，測定两个序列中都出现相同核酸碱基(在核酸的情形中，例如A、T或U，C、G或I，)处的位置数以获得匹配位置数，用匹配位置数除以比较区内(即窗ロ大小)的位置总数，并将结果乘以100而得到序列同一性的百分比。彼此低于100%相同的序列是“相似的”或“同源的”；同 源性程度或百分比相似性是指如在下面段落中确定的两个序列或子序列之间的同一性的百分比的同义术语。例如，彼此显示出至少60%的同一性，或优选至少65%的同一性，或优选至少70%的同一‘注,或优选至少75%的同一‘注,或优选至少80%的同一‘注,或更优选至少85%的同一性，或更优选至少90%的同一性，或更优选至少95%的同一性的两个序列是彼此“相似的”或“同源的”。备选地，关于siRNA分子的寡核苷酸序列，有5个或少于5个的碱基，或有4个或少于4个的碱基，或有3个或少于3个的碱基，或有2个或少于2个的碱基，或有一个碱基不同的两个序列称为彼此“相似的”或“同源的”。如本领域已知的，“同一性”是两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列来确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列亲缘关系水平，根据具体情况而定，如通过在这些序列的字符之间匹配来測定。“同一性”和“相似性”可以容易地通过已知方法计算，所述的方法包括但不限于在(Computational Molecular Biology, Lesk. A. M. , ed. , Oxford University Press,New York,1988 ;Biocomputing :Informatics and Genome Projects, Smith, D. ff.,ed. , Academic Press, New York,1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, PartI.Griffin, A.M.,和 Griffin, H. G. , ed s. Humana Press, New Jersey,1994 ；SequenceAnalysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press,1987 ;和 SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J. ,eds. ,M Stockton Press. New York, 1991 ；以及 Carillo，H.和 Lipman，D.，SIAM J. Applied Math. (1988)48 :1073 中描述的那些方法。用于测定同一性的优选方法是设计来在检验的序列之间产生最大匹配。用于测定同一性和相似性的方法编码于公共可获得的计算机程序中。用于测定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devercux,J等(1984), NucleicAcids Research 12(1) :387)、BLASTP、BLASTN和 FASTA(Atschul，S. F.等(1990)J. Molec.Biol. 215 403-410o BLAST X 程序是从 NCBI 和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md. 20894 ；Altschul,S.等(1990)J. Mol. Biol. 215 :403-410)可公共可获得的。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一‘注。序列比较的參数包括下面的算法Needleman和Wunsch, J. Mol Biol. 48 443-453(1970)。比较矩阵来自 Hentikoff and Hentikoff, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 10915-10919 的 BL0SSUM62。
如在此使用的，术语“分离的”，和类似的词，在用于描述核酸、多核苷酸或寡核苷酸时，指从它的天然或初始状态移开。因而，如果它是天然存在的，则它已经从其初始环境中移开。如果它已经通过合成制备，则它已经从该合成产生的初始产物的混合物中分离。例如，天然存在于生物体(以其自然状态)中的天然出现的多核苷酸是未经“分离”的，但是从与其共存的物质中分离的相同的多核苷酸是“分离的”，如在此采用的术语。通常，除去至少一种显著共存的物质构成了“分离的”核酸、多核苷酸、寡核苷酸。在多数情况下，可以去除数种、许多或大多数共存的物质来分离核酸、多核苷酸、寡核苷酸、蛋白质、多肽或寡肽。作为非限制性的实例，对于多核苷酸，术语“分离的”可以表示它从其天然存在的染色体和细胞中分离。进ー步的实例是，“分离的”蛋白质或多肽可以表示使其从细胞溶解产物或细胞均浆中的另ー种成分分离。作为体外合成方法或化学合成方法的产物的核酸、多核苷酸或寡核苷酸基本上通过合成方法分离。在重要的实施方案中，处理这种合成产品以去除使用的试剂和产物母体，以及通过该方法产生的副产品。同样，多核苷酸和多肽可以存在于例如不是天然存在的组合物的组合物中，例如制剂、用于将多核苷酸引入至细胞中的组合物、用于化学或酶促反应的组合物或溶液，并且，其中保留有如在此采用的术语的意义范围内的分离的多核苷酸或多肽。如在此和在权利要求中使用的，“核酸”或“多核苷酸”，以及基于这些的类似术语指由天然存在的核苷酸构成的聚合物以及由合成的或经修饰的核苷酸构成的聚合物。从而，如在此使用的，是RNA的多核苷酸，或者是DNA的多核苷酸可以包含天然存在的部分例如天然存在的碱基和核糖或脱氧核糖环，或者它们可以如下面描述的由合成的或经修饰的部分构成。核苷酸之间的键通常是3' -5'磷酸键，其可以是天然的磷酸ニ酯键、磷酸硫酯键和其它合成的键。经修饰的主链的实例包括，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、手性硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酷、磷酸三酷、氨烷基磷酸三酷、甲基和其它的烷基磷酸酯包括3'-亚烷基磷酸酷、5'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、亚磷酸酷、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酷、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酷、硒基磷酸酯和硼烷基磷酸酷。另外的键包括磷酸三酷、硅氧烷、碳酸酷、羧甲基酷、氨基こ酸酷，氨基甲酸酷、硫醚、桥联的氨基磷酸酷、桥联的亚甲基磷酸酯、桥联的硫代磷酸酯和磺基核苷酸间键合。其它聚合物键包括这些的2' -5'链连类似物。參见美国专利6，503, 754和6，506, 735和于此引用的參考文献，在这里通过引用作为參考。核酸和多核苷酸长度可以是20个或更多的核苷酸，或者是30个或更多的核苷酸，或者是50个或更多的核苷酸，或者是100个或更多的，或者是1000个或更多的，或者是数万个或更多的，或者是数十万个或更多的核苷酸。siRNA可以是如在此定义的多核苷酸。如在此使用的，“寡核苷酸”和基干“寡核苷酸”的类似术语涉及由天然存在的核苷酸构成的短聚合物，也涉及由合成的或经修饰的核苷酸(如在前面的段落中刚描述的)构成的聚合物。寡核苷酸长度可以是10个或更多的核苷酸，或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个或更多的核苷酸,或者21个、或者22个、或者23个、或者24个或更多的核苷酸,或者25个、或者26个、或者27个、或者28个或2 9个、或者30个或更多的核苷酸，或者35个或更多的、40个或更多的、45个或更多的、达到约50个核苷酸。作为siRNA的寡核苷酸可以具有15-30个核苷酸之间的任何数量的核苷酸。在许多实施方案中，siRNA可能具有21-25个核苷酸之间的任何数量的核苷酸。
从刚提供的定义中可以理解，由于尺寸范围的重叠，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在此可以等同使用来指本发明的siRNA。如在此和在权利要求中使用的，“核苷酸序列”、“寡核苷酸序列”或“多核苷酸序列”，以及类似的术语可互換地指寡核苷酸或多核苷酸具有的碱基序列，也涉及具有该序列的寡核苷酸或多核苷酸结构。此外，核苷酸序列或多核苷酸序列涉及任何天然的或合成的多核苷酸或寡核苷酸，其中碱基序列是通过表示碱基的字母的特定序列的描述或列举所定义，所述的表示碱基的字母是如本领域中常规采用的。在寡核苷酸和多核苷酸中的碱基可以是“未修饰的”或“天然的”碱基，所述的碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。另外，它们可以是具有修饰或取代基的碱基。如在此使用的，经修饰的碱基的非限制性实例包括其它合成的和天然的碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-巯基胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫脲嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8_硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它经修饰的碱基包括三环嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1,4]苯丙噁嗪-2 (3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(I-嘧啶并[5，4-b] [1,4]苯并噻嗪_2 (3H)-酮)、G-clamps例如经取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基こ氧基)-H-嘧啶并[5，4_b] [1，4]苯并噁嗪-2 (3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、批啶并叼丨哚胞苷(H-吡啶并[3'、2' : 4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的碱基还包括其中嘌呤或嘧啶碱基经其它杂环取代的那些碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤核苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它碱基包括在美国专利No. 3，687，808中公开的那些碱基、在The ConciseEncyclopedia Oi Polymer science Ana Engineering, pages 858-859, Kroschwitz,J.L,ed. John Wiley & Sons, 1990 中公开的那些喊基、由 Englisch 等，Angewandte Chemie,International Edition (1991) 30,613 公开的那些喊基，以及由 Sanghvi, Y. S.，Chapter15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, b. T.和 Lebleu,B.，ed.，CRC Press, 1993公开的那些碱基。这些碱基的某些特别是可用于增加本发明寡聚化合物(oligomeric compounds)的亲合性。这些包括5-取代的B密唳、6-氮杂喃唳以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示能增加核酸双链体的稳定性0. 6-1. 2个水平(Sanghvi，Y. S.，し;rooke，S. T.ネロ Lebieu，B.，eds.，Antisense Research and Applications, CRし Press，Boca Raton, 1993，pp. 276-278)并且是目前优选的碱基取代，在与2' -0-甲氧こ基糖修饰组合时甚至更优选。參见美国专利6，503, 754和6，506, 735和在其中引用的參考文献，在这里将它们引入作为參考。任何经修饰的碱基的使用等同于具有相同碱基配对特性的天然存在的碱基的使用，如本领域技术人员所理解的。
如在此和在权利要求中使用的，术语“互补”和基干“互补”的类似词语，指在核酸、多核苷酸或寡核苷酸的一条链中的第一核酸碱基只与在核酸、多核苷酸或寡核苷酸的另ー条链中的特定的第二核酸碱基特异性相互作用的能力。作为非限制性的实例，如果考虑天然存在的碱基，A和T或U可彼此相互作用，以及G和C可彼此相互作用。如在本发明中和权利要求中使用的，“互补”用g在表示“完全互补”，即，当两条多核苷酸链互相比对时，将会至少存在一部分链，在该链中，一条链中的连续碱基序列中的每个碱基与在相对链上相同长度的连续碱基序列中的相互作用的碱基互补如在此使用的，“杂交”、“杂交化”以及类似的词语涉及通过使具有互补序列的链彼此相互作用来形成核酸、多核苷酸或寡核苷酸双链体的过程。由于每条链上的互补碱基特异性相互作用而形成碱基对而使相互作用发生。链相互杂交的能力取决于多种条件，如在下面列出的。核酸链在每条链中有足够数量的相对应位置由可以相互作用的核苷酸占据时相互杂交。本发明领域中的熟练技术人员包括分子生物学家和细胞生物学家(作为非限制性的实例)可理解，形成双链体的链的序列不需要彼此100%的互补而能特异性杂交。如此处使用的，“片段”以及基于“片段”的类似词语指短于全长參照序列的核酸、多核苷酸或寡核苷酸的部分。片段中的碱基序列未经改变地来自产生该片段的分子的对应部分的序列；与其产生它的分子的相应部分比较在该片段中不存在插入或缺失。如在此考虑的，核酸或多核苷酸(例如寡核苷酸)的片段长度是15个或更多碱基、或者16个或更多、17个或更多、18个或更多、19个或更多、20个或更多、21个或更多、22个或更多、23个或更多、24个或更多、25个或更多、26个或更多、27个或更多、28个或更多、29个或更多、30个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多，多达比全长序列短一个碱基的长度。寡核苷酸可以是化学合成的并且可以用作siRNA、PCR引物或探针。检测和标记。靶向多核苷酸，例如包含SiRNA序列的多核苷酸，以及病毒多核苷酸靶标可以以多种方式检测。检测可以包括导致能够观测靶向多核苷酸的存在和或数量的任何ー种或多种方法。在一个实施方案中，含有革G向多核苷酸或病毒祀标的样品核酸可以在扩增之前检测。在一个备选的实施方案中，可以扩增样品中的靶向多核苷酸来提供増加的靶向多核苷酸，或者是扩增的病毒靶标，并检测或定量该扩增的多核苷酸。物理、化学或生物学方法可用于检测和定量靶向多核苷酸。物理方法包括，作为非限制性实例，表面等离子共振(SPR)检测法，例如使探针结合至表面并使用SPR来检测靶向多核苷酸结合至固定的探针上，或在层析介质中放入探针并检测层析介质中靶向多核苷酸的结合。物理方法进ー步包括凝胶电泳或毛细管电泳形式，其中将靶向多核苷酸从其它的多核苷酸分解，并且检测该分解的靶向多核苷酸。化学方法通常包括聚合酶链式反应(PCR)方法，以及其中靶向多核苷酸与探针杂交的杂交方法。生物学方法包括使靶向多核苷酸或靶标多核苷酸对细胞产生生物效应，并检测该效应。本发明公开了可以用作生物学检测法的生物效应的实例。这些包括通过颗粒计数、噬菌斑測定、对感染细胞的细胞病变效应评估等来计算病毒颗粒。在许多实施方案中，可按下面描述地标记多核苷酸以助于检测和定量。例如，在不包括扩增的实施方案中，样品核酸可以通过化学或酶促添加标记部分(例如标记核苷酸或标记寡核苷酸连接序列)来标记。扩增的多核苷酸可以直接检测和/或定量。例如，可以在凝胶中对扩增的多核苷酸进行电泳以便按大小解析，并用染料染色显示它的存在和数量。备选地，扩增的靶向多核苷酸可以在杂交条件下暴露于探针核酸(见下文)并检测和/或定量通过杂交的结合而得以检測。检测可以以允许测定靶向多核苷酸已经结合至探针的任何方式完成。这可通过检测由杂交片段引起的探针物理性质的变化来完成。这种物理检测方法的非限制性实例是SPR。完成检测的备选方法是使用标记形式的扩增多核苷酸，并且检测结合的标记。标记可以是放射性同位素标记，例如125I、35S、32P、14C或3H，例如这些标记可通过它们的放射性检测。备选地，可以选择标记，这样使得其可以用光谱法，例如通过荧光、磷光或化学发光检测。因而可以采用发荧光的，或发出磷光的，或引起化学发光反应的标记。此外标记还可以是在特异性配体-受体对中的配体，该配体的存在则可通过第二次结合特异性受体来检测，所述的受体通常是自身经标记用于检测的。干扰RNA根据本发明，呼吸道病毒靶标的基因表达通过RNA干扰来削弱。病毒基因的表达产物通过特异性双链siRNA核苷酸序列靶向，所述的核苷酸序列至少与含有15-30之间任何数量的核苷酸，或在多数情况下，含有21和25个核苷酸之间任何数量的核苷酸的病毒靶标的片段互补。靶标序列可以出现在5'非翻译(UT)区中、编码序列中或3' UT区中。參见，例如，PCT 申请 W000/44895、W099/32619、W001/75164、W001/92513、W001/29058、W001/89304.W002/16620和W002/29858，每个在此通过全文引用作为參考。根据本发明的方法，呼吸道病毒基因的表达，并由此呼吸道病毒的复制可用siRNA来抑制。根据本发明的靶向多核苷酸包括siRNA寡核苷酸。这种siRNA也可以通过化学合成与病毒序列相同或相似的核苷酸序列来制备。參见，例如，Tuschl, Zamore, Lehmann,Bartel and Sharp (1999)，Genes & Dev. 13 :3191_3197，在此通过全文引用作为參考。备选地，靶向siRNA可以使用靶向多核苷酸序列，例如通过在无细胞系统(例如但不限制于果蝇提取物)中消化呼吸道病毒的核糖多核苷酸，或者通过转录重组双链病毒cRNA来获得。使用由16_30nt的有义链和相同长度的16_30nt的反义链构成的siRNA双链体通常可观察到有效的沉默。在许多实施方案中，siRNA配对双链体的每条链在3'末端另外具有2-nt的突出端。2-nt 3'突出端的序列对siRNA靶标识别的特异性提供了额外的较小的贡献。在一个实施方案中，位于3'突出端的核苷酸是核糖核苷酸。在一个备选的实施方案中，位于3'突出端的核苷酸是脱氧核糖核苷酸，3'脱氧核苷酸的使用提供了增强的细胞内稳定性。本发明的重组表达载体，当介导入细胞内时，经加工而提供包含靶向呼吸道病毒的siRNA序列的RNA。这种载体是以允许表达的方式克隆进表达载体的DNA分子，所述的表达载体包含有效连接的位于病毒靶向序列旁侧的调控序列。与病毒RNA反义的RNA分子通过第一个启动子(例如，克隆DNA 3'的启动子序列)转录并且病毒RNA靶标的有义链的RNA分子通过第二个启动子(例如克隆DNA 5/的启动子序列)从该载体转录。有义和反义链然后在体内杂交以产生用于沉默病毒基因的靶向呼吸道病毒的siRNA构建体。备选地，可以使用两个构建体来产生siRNA构建体的有义和反义链。此外，克隆DNA能够编码具有ニ级结构的转录产物，其中单个转录产物具有来自靶基因或基因的有义序列和互补的反义序列两者。在这个实施方案的一个实例中，发夹结构的RNAi产物与全部或部分靶基因相似。在另ー个实例中，发夹结构的RNAi产物是siRNA。在病毒序列旁侧的调控序列可以是相同的或者可以是不同的，这样它们的表达可以独立地调控，或以时间或空间的方式调控。在某些实施方案中，siRNA通过克隆病毒基因模板进含有，例如来自小核RNA(snRNA)U6或人RNase P RNA Hl的RNA聚合酶III转录单位的载体而得以在细胞内转录。载体系统的ー个实例是GeneSuppressorTM RNA干扰试剂盒(购自Imgenex)。U6和Hl启动子是III型Pol III启动子的成员。类U6启动子的+1核苷酸总是鸟嘌呤核苷，然Hl启动子的+1核苷酸是腺嘌呤核苷。这些启动子的終止信号由5个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷确定。转录产物通常在第二个尿苷后裂解。在该位置裂解在表达的siRNA中产生了 3' UU突出端，其类似于合成的siRNA的3'突出端。长度少于400个核苷酸的任何序列可以通过这些启动子转录，从而它们理想地适合约21-核苷酸的siRNA在例如大约50-核苷酸RNA莖环(stem-loop)转录产物中的表达。已经研究了 RNAi和影响siRNA效カ的因子的特征(參见，例如 Elbashir, Lendeckel 和 Tuschl (2001)Genes & Dev. 15 188-200)。对可利用的核苷酸序列文库进行初始BLAST同源性检索选择的siRNA序列以确保只靶向病毒基因，而不是宿主基因。參见，Elbashir等，2001 EMBO J. 20(23) :6877_88。多核—酸的合成对应靶向核苷酸序列的寡核苷酸，以及包含靶向序列的多核苷酸可以通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成仪来制备。用于合成寡核苷酸的方法包括熟知的化学方法，包括(但不限于)连续添加核苷酸亚磷酰胺至表面衍生化颗粒，如由T, Brown和DorcasJ. S. Brown 在 Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach, F. Eckstein,editor, Oxford University Press, Oxford, pp. 1-24(1991)中描述的，并且在这里将其通过全文引用作为參考。合成方法的一个实例使用Expedite RNA亚磷酰胺和胸苷亚磷酰胺(Proligo公司，德国)。将使合成的寡核苷酸去保护并进行凝胶-纯化(Elbashir等，(2001)Genes &Dev. 15,188-200)，随后通过 Sep-Pak C18 柱(Waters, Milford, Mass.，USA)纯化(Tuschl等，(1993) Biochemistry, 32 :11658-11668)。将互补的 ssRNA 在 90°C 下于退火缓冲液(IOOmM醋酸钾、pH为7. 4的30mM HEPES_K0H、2mM醋酸镁)中培养I分钟，随后在37°C下培养I小时以便与对应的ds-siRNA杂交。寡核苷酸合成的其它方法包括(但不限于)根据磷酸三酯和磷酸ニ酯方法的固相寡核苷酸合成法(Narang等,(1979)Meth. Enzymol. 68 90)和H-磷酸酯方法(尤其是 Garegg, P. J 等，(1985)" Formation of internucleotidie bonds via phosphonateintermediates" , Chem. Scripta 25,280-282 ;和 Froehler, B. C 等,(1986a)" Synthesisof DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates" , Nucleic Acid Res. ,14,5399-5407)和载体合成方法(Beaucage 等,(1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1862)以及氨基憐酸酯技术(Caruthers, M. H 等，"Methods in Enzymology, " Vol. 154,pp. 287-314(1988))、美国专利 5，153，319,5, 132，418,4, 500，707,4, 458，066,4, 973，679、4，668，777 和 4，415，732，以及在“ Synthesis and Applications of DNA and RNA，”S.A. Narang, editor, Academic Press, New York, 1987中描述的其它方法，以及其中包括的參考文献，以及非亚磷酰胺技木。固相合成法有助于寡核苷酸从杂质和过剩的试剂中分离。一旦从固体载体分离，寡核苷酸可以进一歩通过已知的技术分离。本发明的抑制性多核苷酸
本发明广泛提供了用于一旦进入呼吸道病毒病原体感染的细胞中就能引起RNA干扰现象的寡核苷酸。本发明，虽然不限于呼吸道病毒靶标的种类，但重点是靶向RSV和多种甲型流感株的寡核苷酸。RNA干扰通过合适的双链RNA在细胞中发生，所述的双链RNA的一条链与病毒靶基因中的序列一致或高度相似。通常，靶向呼吸道病毒的寡核苷酸可以是DNA或RNA，或者它可能包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。后者的实例是在3/末端以脱氧二核苷酸序列，例如d(TT)、d(UU)、d(TU)、d(UT)，以及其它可能的二核苷酸的终止的RNA序列。在另外的实施方案中，3'突出端可以由具有上面指定喊基或其它喊基的核糖核苷酸构成。此外，寡核苷酸药物制剂可以是单链的或双链的。本发明的治疗性寡核苷酸的数个实施方案可以认为是寡核糖核苷酸或具有3' d(TT)末端的寡核糖核苷酸。单链的靶向多核苷酸，一旦进入哺乳动物细胞中，容易通过细胞中存在的内源性酶活性转化成 双链分子。最一般的，本发明提供了长度可以是15个核苷酸至200个核苷酸的任何长度的寡核苷酸或多核苷酸。多核苷酸包括靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组的第一核苷酸序列。所述的第一核苷酸序列由a)其长度是15-30之间任何数目的核苷酸的序列，或b)它的互补序列构成。这种多核苷酸在这里称为线性多核苷酸。图3提供了本发明多核苷酸的某些实施方案的示意图。本发明公开了在RSV或多种甲型流感株中的靶序列，或在某些方案中公开了与靶序列稍微错配的siRNA序列，所有的这些在SEQ ID NO 1-263中提供。在此公开的序列长度为19个核苷酸至25个核苷酸。靶向序列在图3中通过浅的阴影区段表示。图3小图A，a)阐明了一个实施方案，其中显示为“SEQ”的公开序列可以任选地包含于全长可以达到200个核苷酸的更长的多核苷酸中。本发明另外提供的是，在靶向多核苷酸中，选自SEQ ID NO :1-263的序列可以是更长的靶向序列的部分，这样该靶向多核苷酸就可以靶向比由SEQ表示的第一核苷酸序列长的病毒基因序列。这在图3，小图A，b)中得以阐明，其中完整的靶向序列用多核苷酸上方的水平线显示，并且用在SEQ区段周围的较暗的阴影显示。如在多核苷酸的所有实施方案中，这种较长的序列可以任选地包含于更长的多核苷酸(长度为200或少于200的碱基)中(图3，小图A，b)。本发明进一歩提供了是任意SEQ ID NO :1-263的片段的序列，所述的片段长度至少为15个核苷酸(并且至多比參照SEQ ID NO :短一个碱基；在图3，小图A，c)中说明)，以及其中多达5个核苷酸可以与SEQ ID NO :1-263提供的靶序列不同的序列(在图3，小图A，d)中阐明，在该实例中显示了由三条较暗的直条表示的三个不同的碱基)。本发明更进ー步提供了与任何的上述序列互补的序列(在图3，小图A，e)中显示，并称为“C0MPL”)。任何这些序列包含于本发明的寡核苷酸或多核苷酸中。本发明的任何线性多核苷酸可以只由在上面a)_e)中描述的序列构成，或者任选可以包含另外的碱基达到200个核苷酸限制。由于RNA干扰需要双链RNA，靶向多核苷酸本身可以是双链的，该双链包括与SEQ ID NO :1-263提供的至少ー个序列互补并与其杂交的第二条链，或者可依靠细胞内过程来产生互补链。从而，多核苷酸可以是单链的，或者它可以是双链的。在更进ー步的实施方案中，多核苷酸仅包含脱氧核糖核苷酸，或者它仅包含核糖核苷酸，或者它包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者。在于此描述的多核苷酸的重要实施方案中，靶序列由长度可以是15个核苷酸(nt)，或 16nt、或 17nt、或 18nt、或 19nt、或 20nt、或 21nt、或 22nt、或 23nt、或 24nt、或25nt、或26nt、或27nt、或28nt、或29nt、或30nt的序列构成。依然在另外有利的实施方案中，靶向序列可以与病毒 病原体基因组中的靶序列有多达5个碱基的差別。在本发明的多个实施方案中，多核苷酸是由靶向序列构成的siRNA，其任选包含如在此描述的3' 二核苷酸突出端。备选地，鉴于在RNA干扰中需要双链RNA，寡核苷酸或多核苷酸可以制备形成分子内发夹环状的双链分子。这种分子由先前段落的任何实施方案中描述的第一个序列、后面的短的环序列、该环序列后面依次接着的与第一个序列互补的第二个序列构成。这种结构形成了期望的分子内发夹结构。而且，据公开这种多核苷酸同样具有200个核苷酸的最大长度，这样，列举的这三种需要的结构可以构成具有任何全长达到200个核苷酸的任何寡核苷酸或多核苷酸。发夹环状的多核苷酸在图3，小图B中说明。作为靶标的RSV株对于RSV，尽管可以靶向病毒基因组的任何部分，合理的是靶向编码病毒特异性酶促功能的基因应该提供有效的候选siRNA。这些基因包括L、F、G和P基因。L基因，位于病毒基因组的5'末端，只少量地表达，因此有效的RNAi沉默可能只需要少量的siRNA。也可以革巴向结构基因。RSV亚型A和B的以下代表性病毒株的序列可用于选择靶序列，所述的靶序列是亚型A和B之间共有的(表I)或者是亚型A特异性(表2)或亚型B特异性(表3)。亚型A A2 株(GenBank M74568)和 Long 株(仅 PnRNA, GenBank M22644 和F-mRNA,GenBank M22643)。亚型B B1 株(GenBank NC_001781)和株 9320 (GenBank AY353550)。比对病毒基因序列以寻找共有的或特有的区域。对于每种靶基因或区，选择至少两个靶标，除非不适用(NA)。寻找两种亚型共有的靶序列比寻找它们之ー特有的靶标更困难，因为只存在非常少的同源或相同的序列可利用。表I. RSV亚型A和B(A2、BI和9230株)共有的靶基因
权利要求
1.长度为200或更少核苷酸的分离的线性多核苷酸,所述多核苷酸包含第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列靶向甲型流感病毒的基因组，其中任意T (胸苷)或任意U (尿苷)可以任选地被彼此替代，并且其中所述第一核苷酸序列由下列序列构成 a)长度是15-30之间任何数目的核苷酸的序列，或 b)在a)中给出的序列的互补序列。
2.在权利要求I中描述的多核苷酸，所述的多核苷酸进ー步包含第二核苷酸序列，其中所述的第二核苷酸序列 a)具有与第一核苷酸序列基本相同的长度，并且 b)是与第一核苷酸序列基本上互补的。
3.在权利要求I或2中描述的多核苷酸,其中第一核苷酸序列由下列序列构成 a)选自SEQ ID NO :61-263 的序列； b)比a)项中给出的序列长的靶向序列，其中该靶向序列靶向甲型流感病毒的基因组并包括选自SEQ ID NO =61-263的序列； c)选自SEQID NO =61-263的序列的片段，其中所述片段由长度为至少15个核苷酸且至多比所选序列短一个碱基的连续的碱基序列构成； d)其中与选自SEQID NO =61-263的序列最多有5个核苷酸差别的序列；或 e)在a)至d)中给出的序列的互补序列。
4.在权利要求I或权利要求2中描述的多核苷酸,其中第一核苷酸序列的长度是21-25之间任何数目的核苷酸。
5.在权利要求I或权利要求2中描述的多核苷酸，所述的多核苷酸由选自SEQID NO 61-263的序列构成，任选地包括结合至所选序列的3'的二核苷酸突出端。
6.在权利要求I或权利要求2中描述的多核苷酸,其中位于第一核苷酸序列的3'末端的二核苷酸序列是TT、TU、UT或UU，并且其中二核苷酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者。
7.在权利要求I或权利要求2中描述的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。
8.在权利要求I或权利要求2中描述的多核苷酸,其中多核苷酸是RNA。
9.在权利要求I或权利要求2中描述的多核苷酸,其中多核苷酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者。
10.双链的多核苷酸，所述的多核苷酸包含在权利要求I中描述的第一多核苷酸链和与该第一多核苷酸链的至少第一核苷酸序列互补并与其杂交的第二多核苷酸链。
11.一种组合物，所述的组合物包含在权利要求I、权利要求2或两者中描述的多种靶向多核苷酸，其中每种多核苷酸靶向靶标病毒的基因组中的不同序列。
12.—种载体,所述的载体包含权利要求I的多核苷酸。
13.—种载体,所述的载体包含权利要求2的多核苷酸。
14.在权利要求12或权利要求13中描述的载体，其中该载体是质粒、重组病毒、转座子或微小染色体。
15.一种细胞，所述的细胞用权利要求I中描述的ー种或多种多核苷酸转染。
16.一种细胞，所述的细胞用权利要求2中描述的ー种或多种多核苷酸转染。
17.药物组合物，所述的药物组合物包含权利要求I或权利要求2中描述的ー种或多种多核苷酸或其混合物以及可药用的载体，其中所述的每种多核苷酸靶向靶标病毒的基因组中的不同序列。
18.药物组合物，所述的药物组合物包含权利要求12或权利要求13中描述的ー种或多种载体或其混合物以及可药用载体，其中每种载体包含靶向靶标病毒基因组中的不同序列的多核苷酸。
19.在权利要求17或权利要求18中描述的药物组合物，其中所述药用载体包括合成聚合物、脂质体、葡萄糖、表面活性剂或它们任意两种或更多种的组合。
20.用RNA抑制剂转染细胞的方法，所述的方法包括使细胞与含有在权利要求I中描述的一种或多种多核苷酸的组合物接触。
21.用RNA抑制剂转染细胞的方法，所述的方法包括使细胞与含有在权利要求2中描述的一种或多种多核苷酸的组合物接触。
22.在感染了甲型流感病毒的细胞中抑制甲型流感病毒复制的方法，所述的方法包括使细胞与含有在权利要求I中描述的ー种或多种多核苷酸的组合物接触，其中所述的ー种或多种多核苷酸靶向所述病毒。
23.在感染了甲型流感病毒的细胞中抑制甲型流感病毒复制的方法，所述的方法包括使细胞与含有在权利要求2中描述的ー种或多种多核苷酸的组合物接触，其中所述的ー种或多种多核苷酸靶向所述病毒。
24.在权利要求I中描述的并且靶向甲型流感病毒的多核苷酸的用途，或它们的两种或更多种的混合物的用途，所述的用途用于生产在受试者中有效治疗由甲型流感病毒引起的感染的药物组合物。
25.在权利要求24中描述的用途，其中受试者是人。
26.在权利要求2中描述的并且靶向甲型流感病毒的多核苷酸的用途，或它们的两种或更多种的混合物的用途，所述的用途用于生产在受试者中有效治疗由甲型流感病毒引起的感染的药物组合物。
27.在权利要求26中描述的用途，其中受试者是人。
全文摘要
本发明提供了干扰呼吸道病毒感染，包括呼吸道合胞体病毒和甲型禽流感病毒(包括H5N1株)中的病毒复制的siRNA组合物。本发明进一步提供了siRNA组合物的用途，所述的组合物用于抑制呼吸道病毒感染的细胞中的病毒基因表达，并用于治疗患者的呼吸道病毒感染。总的来说，本发明提供了多核苷酸、双链多核苷酸或发夹结构多核苷酸，所述的多核苷酸包含15-30个碱基的第一核苷酸序列及其互补序列，所述的第一核苷酸序列靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组。另外，本发明提供了含有siRNA序列的载体、细胞和药物组合物。
文档编号C12N15/63GK102618541SQ20111044034
公开日2012年8月1日 申请日期2005年11月4日 优先权日2004年11月5日
发明者B·郑, F·Y·谢, M·C·伍德勒, P·Y·卢, Q·唐 申请人:圣诺制药公司