专利名称：利用鸟苷发酵废液生产高蛋白饲料的方法
技术领域：
本发明属于环境工程和生物工程领域，具体来说是一种利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法。
背景技术：
鸟苷又名鸟嘌呤核苷或9-(0-D-呋喃核糖基)鸟嘌呤。鸟苷的用途十分广泛，可用于合成食品增鲜剂一 5'-鸟苷酸二钠、呈味核苷酸二钠以及作为医药产品的重要中间体， 可形成一系列的下游医药产品，包括核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造无环鸟苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鸟苷钠(GTP)等药物的主要原料。目前，国内市场鸟苷需求量大约在3 500吨/年，且以每年10%的速度增长。鸟苷生产采用发酵法，该法会产生大量发酵废水。鸟苷发酵废水中残糖量约为3%， 总氮含量约为0. 6%，氨氮含量约为0. 5%，无机盐含量约为4. 0%-5. 0%，废液pH7. 0，是一种高 B0D、高氨氮营养丰富的有机废水，直接排放会造成水体生物因缺氧而大量死亡，处理后达标排放不仅增加生产成本，而且废水中的营养成分不能充分利用，造成资源浪费。
发明内容
本发明的目的就是解决鸟苷发酵废液直接排放对环境的污染问题，另一目的就是提供一种利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法，其特征在于包括有以下步骤
1)在IL鸟苷发酵废水中补加鹿糖0. 5 g-2. 0 g,蛋白胨0.1 g -0. 5 g，酵母膏0.5 g -1.0 g，得到生产蛋白饲料的发酵培养基；
2)菌种活化，分别挑取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌接种于相应的斜面培养基上，于30°C -37°C，培养10 hr-20 hr,分别得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的斜面种子；
3)摇瓶种子培养，将步骤2)得到的活化好的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的斜面种子分别接种至三角摇瓶中进行培养，得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的摇瓶种子；
4)发酵种子培养，将步骤3)中培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的摇瓶种子按体积百分比5%-10%的接种量分别接种于种子罐中，于30°C -37°C，培养20 hr-40 hr，得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的种子液；
5)混合发酵培养，将步骤4)中培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的种子液， 采用步骤I)所述的发酵培养基，按5%-10%的总接种量接种于发酵罐中，于34°C _36°C，通风比为0. 13-0. 15，培养40 hr-48 hr，得到混合培养液；
6)喷雾干燥，将步骤5)的混合培养液进行喷雾干燥、粉碎，即得蛋白饲料。按上述方案，步骤2)所用的用于菌种活化的斜面培养基为枯草芽孢杆菌的斜面培养基组成为葡萄糖0. 5 g,蛋白胨0.6 g，酵母膏0.7 g,氯化钠0.5 g,琼脂2.0 g,去离子水100 mL ;地衣芽孢杆菌的斜面培养基组成为葡萄糖0.5 g，蛋白胨0.7 g，酵母膏0.8 g，氯化钠0.5 g,琼脂2.0 g,去离子水100 mL ;酵母菌的斜面培养基组成为鹿糖2.0 g,酵母膏0. 8 g，氯化钠0. 5 g，琼脂2. 0 g，去离子水100 mL。按上述方案，步骤3)中摇瓶种子培养条件为，枯草芽孢杆菌采用如下培养基在 100 mL鸟苷发酵废水中补加酵母膏1.0 g-3.0 g，培养基pH7. 0，于35°c-37°c，200 rpm振摇培养20 hr-24 hr ;地衣芽孢杆菌采用如下培养基在100 mL鸟苷发酵废水中补加蛋白胨 0.5 g-1.5 g、酵母膏 1.0 g-2. 0 g，培养基 pH7.0，于 35°C-37°C，180 rpm 振摇培养 26 hr-30 hr ;酵母菌采用如下培养基在100 mL鸟苷发酵废水中补加酵母膏0. 5 g-1. 0 g、鹿糖 0.5 g-2. 0 g，于 28°C-32°C，150 rpm 振摇培养 40 hr-48 hr。按上述方案，步骤4)中发酵种子培养条件为枯草芽孢杆菌采用如下培养基 在I L鸟苷发酵废水中补加酵母膏5 g-30 g，调pH7.0，接种量为体积百分比5%-7%，于 35°C-37°C，通风比为0. 13-0. 15，培养20 hr-24 hr，取样，稀释10倍，于650 nm测菌体密度，使之达I. 46-1. 52 ;地衣芽孢杆菌采用如下培养基在I L鸟苷发酵废水中补加蛋白胨
5.0 g-15.0 g、酵母膏 10. 0 g -20. 0 g，调pH7.0。接种量为 7%-10%，于 35°C-37°C，通风比为
0.13-0. 15，培养26 hr-30 hr,取样，稀释10倍，于650 nm测菌体密度，使之达I. 48-1. 52 ； 酵母菌采用如下培养基在I L鸟苷发酵废水中补加酵母膏5. 0 g-10. 0 g、鹿糖5.0 g-20. 0 g，接种量为7%-10%，于28°C-32°C，通风比为0. 10-0. 12，培养40 hr -48 hr，取样，稀释10 倍，于650 nm测菌体密度，使之达I. 44-1. 53。按上述方案，步骤5)中混合发酵的接种量为按枯草芽孢杆菌接种量I. 0%-3. 0%、 地衣芽孢杆菌接种量2. 0%-4. 0%、酵母菌接种量2. 0%-3. 0%。按上述方案，所述的蛋白饲料为淡黄色粉末，菌群总数6. 83X IO8-L 47X IO9 CFU / g，粗蛋白含量为48%-51%。富含矿质和维生素，是一种优质的禽畜蛋白饲料。本发明利用鸟苷废水为原料，发酵生产蛋白饲料，其中菌群总数为
6.83 X IO8-L 47 X IO9 CFU / g，粗蛋白含量为48%_51%，富含矿质和维生素，是一优质的蛋白禽畜饲料。本发明不仅解决了鸟苷发酵产生的废水排放对环境的污染，而且降低了蛋白饲料的生产成本，做到资源的最大化利用。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但是不会构成对本发明的限制
实施例I一种以鸟苷发酵废水生产蛋白饲料法方法如下
步骤一，菌种活化，挑取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌接种于相应的斜面培养基上，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌于37°C分别培养10 hr和16 hr ;酵母菌于30°C，培养 20 hr o枯草芽孢杆菌的斜面培养基组成为葡萄糖0. 5 g，蛋白胨0. 6 g，酵母膏0. 7 g，氯化钠0. 5 g，琼脂2. 0 g，去离子水100 mL ;地衣芽孢杆菌的斜面培养基组成为葡萄糖0. 5 g，蛋白胨0.7 g，酵母膏0.8 g,氯化钠0.5 g,琼脂2.0 g,去离子水100 mL ;酵母菌的斜面培养基组成为蔗糖2.0 g，酵母膏0.8 g，氯化钠0.5 g，琼脂2.0 g，去离子水100 mL。
步骤二，摇瓶种子培养，将步骤一中活化好的枯草芽孢杆菌接种于已灭菌含酵母膏2. 0 g、鸟苷发酵废水100 mL, pH 7. 0的摇瓶中，于37°C，200 rpm振摇培养20 hr ;将步骤二中活化好的地衣芽孢杆菌接种于已灭菌含蛋白胨1.0 g、酵母膏I. 5 g、鸟苷发酵废水 100 mL、pH7. 0的摇瓶中，于35°C，180 rpm振摇培养24 hr ;将步骤二中活化好的酵母菌接种于已灭菌含鹿糖1.0 g，酵母膏0.7 g，鸟苷发酵废水100 mL的摇瓶中，于30°C, 150 rpm 振摇培养48 hr o步骤三，发酵种子培养。将步骤二中摇瓶培养的菌液分别接种于种子罐中进行种子培养。枯草芽孢杆菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加体积质量比为
2.0%的酵母膏，调pH7. 0，121°C灭菌30 min，冷却。以5%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，37°C，通风比0. 13，培养20 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为1.46。然后压入500 L的种子罐中，于37°C，通风比0. 12，培养20 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为I. 48。地衣芽孢杆菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加体积质量比为 1.0%的蛋白胨、I. 5%的酵母膏，调pH7. O。121°C灭菌30 min，冷却。以7%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，35°C，通风比0. 14，培养26 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为1.49。然后压入500 L的种子罐中，于35°C，通风比0. 14，培养 26 hr,使稀释10倍的菌体密度在650 nm处达I. 48。酵母菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加补加体积质量比为I. 0% 的蔗糖、0. 7%的酵母膏，pH自然。121°C灭菌30 min，冷却。以10%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，30°C，通风比0. 10，培养48 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为1.53。然后压入500 L的种子罐中，30°C，通风比0. 10，培养48 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为I. 54。步骤四，混合发酵培养。取蔗糖18 kg，蛋白胨12 kg，酵母膏18 kg，鸟苷发酵废水 36 m3，混合溶解后加入50 m3的发酵罐中，121 °C灭菌30 min。冷却，接种枯草芽孢杆菌I. 2 m3、地衣芽孢杆菌I. 4 m3、酵母菌I. 4 m3 (总接种量10%)，36°C，通风比为0. 13，培养40 hr,放罐。步骤五，喷雾干燥。将步骤四中混合发酵液进行喷雾干燥、粉碎，得菌体蛋白(为淡黄色粉末)，其中菌群总数为为I. 07X IO9CFU / g，粗蛋白含量为50.6%。实施例2 —种以鸟苷发酵废水生产蛋白饲料法方法如下
步骤一，同实施例I进行菌种活化。步骤二，摇瓶种子培养，将步骤一中活化好的枯草芽孢杆菌接种于已灭菌含酵母膏I. 0 g、鸟苷发酵废水100 mL, pH7. 0的摇瓶中，于35°C，200 rpm振摇培养24 hr ;将步骤二中活化好的地衣芽孢杆菌接种于已灭菌含蛋白胨0.5 g、酵母膏2.0 g、鸟苷发酵废水 100 mL、pH7. 0的摇瓶中，于36°C，180 rpm振摇培养30 hr ;将步骤二中活化好的酵母菌接种于已灭菌含鹿糖0.5 g，酵母膏1.0 g，鸟苷发酵废水100 mL的摇瓶中，于28°C, 150 rpm 振摇培养44 hr o步骤三，发酵种子培养。将步骤二中摇瓶培养的菌液分别接种于种子罐中进行种子培养。
枯草芽孢杆菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加体积质量比为 1.0%的酵母膏，调pH7. 0，121°C灭菌30 min，冷却。以6%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，35°C，通风比0. 15，培养24 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为I. 51。然后压入500 L的种子罐中，于35°C，通风比0. 15，培养24 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为I. 49。地衣芽孢杆菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加体积质量比为
0.5%的蛋白胨、2. 0%的酵母膏，调pH7. O。121°C灭菌30 min，冷却。以9%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，36°C，通风比0. 13，培养30 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为1.48。然后压入500 L的种子罐中，于36°C，通风比0. 13，培养 30 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为I. 49。酵母菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加体积质量比为0. 5%的蔗糖、1.0%的酵母膏，pH自然。121°C灭菌30 min，冷却。以7%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，28°C，通风比0. 12，培养44 hr，稀释10倍的菌体密度在 650 nm处为1.44。然后压入500 L的种子罐中，28°C，通风比0. 12，培养44 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为I. 46。步骤四，混合发酵培养。取蔗糖40 kg，蛋白胨18 kg，酵母膏24 kg，鸟苷发酵废水 36 m3，混合溶解后加入50 m3的发酵罐中，121 °C灭菌30 min。冷却，接种枯草芽孢杆菌0. 8 m3、地衣芽孢杆菌I. I m3、酵母菌0.9 m3 (总接种量7%)，34°C，通风比为0. 14，培养45 hr,放罐。步骤五，喷雾干燥。将步骤四中混合发酵液进行喷雾干燥、粉碎，得菌体蛋白(为淡黄色粉末)，其中菌群总数9. 26 X IO8CFU / g，粗蛋白含量为51.0%。实施例3 —种以鸟苷发酵废水生产蛋白饲料法方法如下
步骤一，同实施例I进行菌种活化。步骤二，摇瓶种子培养，将步骤二中活化好的枯草芽孢杆菌接种于已灭菌含酵母膏3.0 g、鸟苷发酵废水100 mL，pH7. 0的摇瓶中，于36°C，200 rpm振摇培养22 hr ;将步骤一中活化好的地衣芽孢杆菌接种于已灭菌含蛋白胨I. 5 g、酵母膏0.5 g、鸟苷发酵废水 100 mL、pH7. 0的摇瓶中，于37°C，180 rpm振摇培养28 hr ;将步骤二中活化好的酵母菌接种于已灭菌含鹿糖2.0 g，酵母膏0.5 g，鸟苷发酵废水100 mL的摇瓶中，于32°C, 150 rpm 振摇培养40 hr o步骤三，发酵种子培养。将步骤二中摇瓶培养的菌液分别接种于种子罐中进行种子培养。枯草芽孢杆菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加体积质量比为
3.0%的酵母膏，调pH7. 0，121°C灭菌30 min，冷却。以7%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，36°C，通风比0. 14，培养22 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为1.49。然后压入500 L的种子罐中，于36°C，通风比0. 14，培养22 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为1.52。地衣芽孢杆菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加体积质量比为
1.5%的蛋白胨、0.5%的酵母膏，调pH7. O。121°C灭菌30 min，冷却。以10%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，37°C通风比0. 15，培养28 hr，稀释10倍的菌体密度在650 11111处为1.52。然后压入500 L的种子罐中，于37°C，通风比0. 15，培养28 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为1.51。酵母菌种子液培养。培养基制备在鸟苷发酵废水中补加体积质量比为2. 0%的蔗糖、0.5%的酵母膏，pH自然。121°C灭菌30 min，冷却。以9%接种量，将步骤二中培养的摇瓶种子，接种于10 L的种子罐中，32°C，150 rpm，通风比0. 11，培养40 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为1.45。然后压入500 L的种子罐中，32°C，150 rpm，通风比0. 11，培养40 hr，稀释10倍的菌体密度在650 nm处为I. 46。步骤四，混合发酵培养。取蔗糖72 1^，蛋白胨3.6 kg，酵母膏36 kg，鸟苷发酵废水36 m3，混合溶解后加入50 m3的发酵罐中，121 °C灭菌30 min。冷却，接种枯草芽孢杆菌 0.5 m3、地衣芽孢杆菌0.8 m3、酵母菌0.7 m3 (总接种量5%)，35°C，通风比为0. 15，培养48 hr，放罐。步骤五，喷雾干燥。将步骤四中混合发酵液进行喷雾干燥、粉碎，得菌体蛋白(为淡黄色粉末)，其中菌群总数6. 97 X IO8CFU / g，粗蛋白含量为48.6%。
权利要求
1.利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法，其特征在于包括有以下步骤1)在IL鸟苷发酵废水中补加鹿糖O. 5 g-2. O g,蛋白胨O. I g -O. 5 g，酵母膏O. 5 g -I. O g，得到生产蛋白饲料的发酵培养基；2)菌种活化，分别挑取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌接种于相应的斜面培养基上，于30°C -37°C，培养10 hr-20 hr,分别得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的斜面种子；3)摇瓶种子培养，将步骤2)得到的活化好的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的斜面种子分别接种至三角摇瓶中进行培养，得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的摇瓶种子；4)发酵种子培养，将步骤3)中培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的摇瓶种子按体积百分比5%-10%的接种量分别接种于种子罐中，于30°C -37°C，培养20 hr-40 hr，得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的种子液；5)混合发酵培养，将步骤4)中培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌的种子液， 采用步骤I)所述的发酵培养基，按5%-10%的总接种量接种于发酵罐中，于34°C _36°C，通风比为O. 13-0. 15，培养40 hr-48 hr，得到混合培养液；6)喷雾干燥，将步骤5)的混合培养液进行喷雾干燥、粉碎，即得蛋白饲料。
2.根据权利I所述的利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法，其特征在于步骤2)所用的用于菌种活化的斜面培养基为枯草芽孢杆菌的斜面培养基组成为葡萄糖O. 5 g，蛋白胨O. 6 g，酵母膏O. 7 g,氯化钠O. 5 g,琼脂2. O g,去离子水100 mL ;地衣芽孢杆菌的斜面培养基组成为葡萄糖O. 5 g，蛋白胨O. 7 g，酵母膏O. 8 g，氯化钠O. 5 8，琼脂2.0 g，去离子水100 mL ;酵母菌的斜面培养基组成为蔗糖2.0 g，酵母膏0.8 g，氯化钠0.5 g，琼脂2.O g，去离子水100 mL。
3.根据权利I所述的利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法，其特征在于步骤3)中摇瓶种子培养条件为，枯草芽孢杆菌米用如下培养基在100 mL鸟苷发酵废水中补加酵母膏I. O g-3. O g，培养基ρΗ7·0，于35°C_37°C，200 rpm振摇培养20 hr-24 hr ;地衣芽孢杆菌采用如下培养基在100 mL鸟苷发酵废水中补加蛋白胨O. 5 g-1.5 g、酵母膏I. O g-2. O g，培养基pH7. 0，于35°C-37°C，180 rpm振摇培养26 hr-30 hr ;酵母菌采用如下培养基 在100 mL鸟苷发酵废水中补加酵母膏O. 5 g-1.0 g、蔗糖O. 5 g-2. O g，于28°C _32°C，150 rpm 振摇培养 40 hr-48 hr。
4.根据权利I所述的利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法中，其特征在于步骤4)中发酵种子培养条件为枯草芽孢杆菌采用如下培养基在I L鸟苷发酵废水中补加酵母膏5 g-30 g，调pH7. 0，接种量为体积百分比5%-7%，于35°C-37°C，通风比为O. 13-0. 15，培养20 hr-24 hr,取样，稀释10倍，于650 nm测菌体密度，使之达I. 46-1. 52 ;地衣芽孢杆菌采用如下培养基在I L鸟苷发酵废水中补加蛋白胨5. O g-15. O g、酵母膏10. O g -20.0 g，调 ρΗ7· 0，接种量为 7%-10%，于 35°C _37°C，通风比为 O. 13-0. 15，培养 26 hr-30 hr，取样，稀释10倍，于650 nm测菌体密度，使之达I. 48-1. 52 ;酵母菌采用如下培养基在I L鸟苷发酵废水中补加酵母膏5. O g-10. O 8、蔗糖5.0 g-20. O g，接种量为7%_10%，于28°C _32°C， 通风比为O. 10-0. 12，培养40 hr -48 hr，取样，稀释10倍，于650 nm测菌体密度，使之达 I. 44-1. 53。
5.根据权利I所述的利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法中，其特征在于步骤5)中混合发酵的接种量为按枯草芽孢杆菌接种量I. 0%-3. 0%、地衣芽孢杆菌接种量2.0%-4. 0%、酵母菌接种量2. 0%-3. 0%进行接种。
6.根据权利I所述的利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法中，其特征在于所述的蛋白饲料为淡黄色粉末，菌群总数6. 83 X IO8-L 47 X IO9 CFU / g，粗蛋白含量为48%_51%。
全文摘要
本发明属于环境工程和生物工程领域，具体来说是一种利用鸟苷发酵废水生产蛋白饲料的方法，包括以下几个步骤第一，菌种活化；第二，摇瓶种子培养；第三，生产种子培养；第四，以鸟苷发酵废水为原料，接种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌，进行混合发酵；第五，喷雾干燥、粉碎，得蛋白饲料。该蛋白饲料含菌群总数为6.83×108-1.47×109CFU／g，粗蛋白含量为49%-51%，富含矿质和维生素，是一优质的蛋白禽畜饲料。
文档编号C12P21/00GK102578389SQ20121003318
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者户业丽, 程波 申请人:武汉工程大学