专利名称：一种利用重组羰基还原酶催化制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用大肠杆菌重组质粒无细胞提取物制备普利类药物关键手性中间体0 )-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，高血压日益危害着人们的健康。0 )-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl 0 )-2_hydroxy-4-phenylbutyrate, (R) -HPBE)是合成众多普利系列血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的关键手性中间体，如赖诺普利，依那普利，卡托普利等[1]。由于ACEI类药物的高效性和低副作用，其已成为目前市场上最畅销的药物之一。以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)作为还原反应的潜手性底物，易于合成且价格低廉，以其作为底物进行不对称还原反应获得0 )-ΗΡΒΕ是非常经济有效的制备途径。目前为止，{R)~2~羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成路线主要包括化学法和生物法。化学法分为化学合成法和化学拆分法。化学合成法往往反应步骤复杂，且需要昂贵的试剂，或者反应条件十分苛刻。化学拆分法存在的问题是以光学纯苯乙胺类衍生物作拆分剂，由于其价格昂贵，实用价值不大[2]。生物法包括脂肪酶拆分法、野生菌催化法和基因工程菌催化法。生物拆分法方面，Lies等利用来自Pseudomorms cepaica的脂肪酶拆分外消旋2_轻基_4_苯基丁酸乙酯,得到m值大于99. 5%的产物M。Inada等用微生物直接作用于2-羟基-4-苯基丁酸乙酯拆分得0 ) -HPBE,产率和ee值分别可达42%和95%[4]。然而，外消旋体拆分的理论转化率仅为50%，不利于工业化生产。目前最受关注和研究最多的是生物合成法。野生菌催化方面，Chen等人利用Candida boidinii成功制备了 0 ) -HPBE，ee值和产率分别为99%和92%[5]。Oda等用C. holmii还原0ΡΒΕ，得到产率和ee值分别为58%和90%的0 ) -HPBEte]。由于野生菌中酶系复杂，可能含有多种不同的甚至相反的立体选择性的酶，所以很难达到99%以上的m值。利用改造的基因工程菌对OPBE进行不对称还原生成(ZP)-HPBE的报道目前还比较少，Iwona等将所筛选的酿酒酵母cerevisiae的基因Yprlp在大肠杆菌中表达纯化后获得的重组蛋白YprlP，在外加NAD+和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的条件下将OPBE不对称催化还原成m值为97%的0 ) -HPBEm。目前为止，利用重组的基因工程菌催化OPBE不对称还原成(TP)-HPBE的报道中，ee值最高为98%。本发明中的重组羰基还原酶IolS可应用于不对称还原制备ee值大于99. 5%的0 )_ΗΡΒΕ。本专利中涉及到的羰基还原酶是醛酮还原酶的一种，全长310个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ NO. 2所示；编码该蛋白的基因长度为933bp，已提交至Genbank中，收录号为JQ782389，其基因序列如SEQ NO. I所示。至今尚无关于该羰基还原酶用于OPBE不对称还原(TP)-HPBE的公开报道。参考文献
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发明内容
本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌无细胞提取物作为催化剂，应用于催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备光学纯0 )-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。该方法不需要添加或少量添加昂贵的辅酶，极大地降低了生产成本，且产物的光学纯度高，条件温和，易于工业化放大。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下
从枯草芽孢杆菌(也&77心subti I is) CGMCC NO. I. 1508中克隆出羰基还原酶IolS，氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。从枯草芽孢杆菌subti I is) CGMCC NO. I. 1508中克隆出葡萄糖脱氢酶⑶H，核酸序列如SEQ NO. 3所示，氨基酸序列如SEQ NO. 4所示。采用双启动子法串联IolS基因和⑶H基因，构建pET24a-G-T7_I质粒，将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)。一种氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基还原酶，GenBank收录号JQ782389，或者是在保持该羰基还原酶催化活性的条件下，由插入、缺失或替换如SEQ NO. 2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的羰基还原酶，在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备0 )-2_羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。一种含所述羰 基还原酶的大肠杆菌重组质粒的构建方法，从枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilisXGMCC NO. I. 1508中克隆了羰基还原酶IolS和葡萄糖脱氢酶⑶H基因片段，采用双启动子法串联IolS基因和GDH基因，构建了 pET24a-G-T7-I质粒，将该质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)而获得的大肠杆菌重组质粒，实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的共表达。所述大肠杆菌重组质粒的应用，以所述大肠杆菌重组质粒的无细胞提取物为催化齐U，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，葡萄糖为辅底物，在不添加或添加少量NADP+辅因子 (〈0.05 mmol/L)的条件下,进行生物转化制备0 ) _2_轻基-4-苯基丁酸乙酯，ee值大于99. 5% ；
水相反应15 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L，pH值6. 0)，5 mL无细胞提取物，200 g/L的D-葡萄糖，20 g/L的OPBE和O. 05 mM的NADP+，37°C在220 r/min摇床震荡反应13-15h ；
水/辛醇两相反应5 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L，pH值6. 0)，5 mL无细胞提取物，200 g/L 的 D-葡萄糖，20 g/L 的 0PBE，0. 05mM 的 NADP+以及 IOmL 的辛醇，37°C在 220 r/min摇床震荡反应13-15 h。本发明构建的共表达重组质粒能够实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的高效共表达，可应用于高效催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备光学纯0 ) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，ee值大于99. 5%。同时，通过采用水/辛醇两相反应体系、分批添加底物等方式，解决了底物和产物对酶的抑制作用，显著提高了转化效果。本发明的有益效果本发明首次将氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基还原酶应用于不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备0 ) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，取得了较好的效果，粗酶液中羰基还原酶的比酶活达到I. 5 U/mg，产物的对映体过量值大于99. 5%。通过与葡萄糖脱氢酶共表达，解决了辅因子的再生问题，且对羰基还原酶的酶活没有影响。在水/辛醇两相体系中，不对称还原20g/L的底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，可获得ee值大于99. 5%的0 ) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，转化率为70. 4%。
图I羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶PCR扩增产物电泳图谱。I :DNA marker ;2 :⑶H基因；3 :IolS基因。图2重组质粒pET24a-G-T7_I的构建图。图3大肠杆菌重组质粒中羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的SDS-PAGE图。I 蛋白 Marker ;2 么 co7iBL21(DE3)空白对照；3 么 coli BL21(DE3)/pET24a-G-T7-I 诱导后总蛋白；4 么 coli BL21 (DE3)/pET24a_G-T7_I 诱导后可溶蛋白。
具体实施例方式实施例I羰基还原酶基因的获取
枯草芽孢杆菌心subti I is) CGMCC NO. I. 1508来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，培养基LB (g/L):胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g,补水至I L。将枯草芽孢杆菌接种于50 mL液体培养基中37 °C培养至对数培养期，使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组。引物序列设计如下
上游引物IolSf含有Atie I 5， -GGAATTCCATATGAAAAAAGCGAAGCTCGG-3>下游引物IolSr含有Zho I 5， -CCGCTCGAGTGCGAACAGCTTATCAAT-3，
PCR条件为:95°C变性5 min，按如下参数循环30次95 °C变性I min，62°C退火50 S，72°C延伸I min。最后72 °C延伸10 min。PCR结果如图I所示。实施例2擬基还原酶基因的表达
用Me I和Jho I分别酶切pET20b和羰基还原酶基因，将酶切回收产物用T4连接酶连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，热休克法转化，涂布于含有100 μ g/mL的氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养12 h。以载体所带氨苄青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。实施例3葡萄糖脱氢酶基因的获取
菌株培养和基因提取如实施例I。引物序列设计如下
上游引物⑶Hf含有Me I 5’ -GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGC-3>
下游引物⑶Hr含有Mnd III 5， -CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGC-3，
PCR条件为:95°C变性5 min，按如下参数循环30次95°C变性I min, 55 °C退火50 S，72°C延伸I min。最后72°C延伸10 min。PCR结果如图I所示。实施例4葡萄糖脱氢酶基因的表达
用Me I和"ind III分别酶切pET24a和葡萄糖脱氢酶基因，将酶切回收产物用T4连接酶连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，热休克法转化，涂布于含有50 μ g/mL的卡那青霉素的LB平板上，37 °C培养12 h。以载体所带卡那青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。实施例5羰基还原酶酶活的测定
重组大肠杆菌的粗酶液制备重组大肠杆菌接种至含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C，180 r/min培养过夜后，以体积分数I %接种量接种至新鲜LB培养基中，37°C, 200 r/min培养至OD为O. 6 O. 9时，加入诱导剂IPTG(终浓度为O. 4 mmol/L)，诱导4 h后测定羰基还原酶活力。取经诱导的菌液离心(4°C,5000 r/min离心15 min),菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬，超声破碎细胞(功率300 W，超声I S，间歇3
S,共10 min) ,4°C, 11000 r/min离心15 min),测定上清液中羰基还原酶的酶活。羰基还原酶活力测定酶反应体系包括100 mM磷酸钾缓冲溶液(pH 6. 0),0. I mMNADPH, I mM 0PBE,340 nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟消耗I μ mol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示粗酶液中羰基还原酶的比酶活为I. 5 U/mg。实施例6葡萄糖脱氢酶酶活的测定
重组大肠杆菌细胞粗酶液制备重组大肠杆菌接种至含50 μ g/mL卡那青霉素的LB液体培养基，37°C，180 r/min培养过夜后，以体积分数I %接种量接种至新鲜LB培养基中，37°C, 200 r/min培养至OD为O. 6 O. 9时，加入诱导剂IPTG(终浓度为O. 8 mmol/L)，诱导4 h后测定葡萄糖脱氢酶活力。取经诱导的菌液离心(4 °C, 5 000 r/min离心15 min)，菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬，超声破碎细胞(功率300 W，超声I S，间歇3 S，共10 min), 4 °C，11 000 r/min离心15 min)，测定上清液中葡萄糖脱氢酶的酶活。葡萄糖脱氢酶活力测定酶反应体系包括75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),2.0mmol/L NADP+, O. I mol/L D-葡萄糖，340 nm处测定吸光值的上升。酶活定义为每分钟生成I μ mol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示粗酶液中葡萄糖脱氢酶的比酶活为9. 5 U/mg ο实施例7羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的共表达
从以构建的重组质粒pET20b-I上通过PCR扩增获得连有T7启动子的羰基还原酶基因(T7-iolS)片断。N端引物含有ArOt I限制性酶切位点
T7-IolSf: 5’ -AAGGAAAAAA GCGGCCGCTA ATACGACTCA CTATAG-3’。C 端引物为 IolSr。将PCR扩增出的连有T7启动子的羰基还原酶基因(TJ-iolS、，分别经Abt I和Zho I酶切后与进行相同酶切的pET24a-G相连，构建了重组质粒pET24a_G-T7_I (图2)。重组质粒经热休克法转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。以载体所带卡那青霉素抗性筛选阳性转化子。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切的方法进行验证。实施例8 SDS-PAGE检测目的蛋白
取诱导后的菌体重悬液超声破碎，离心取上清进行SDS-PAGE分析。采用4%的浓缩胶，15%的分离胶，电泳后凝胶用考马斯亮蓝G250染色(图3)。实施例9大肠杆菌重组质粒无细胞提取物的制备
重组大肠杆菌接种至含50 μ g/mL卡那青霉素的LB液体培养基，37°C、180 r/min培养过夜后，以体积分数1%接种量接种至新鲜LB培养基中，37°C，200 r/min培养至OD为
0.6 0. 9时，加入诱导剂IPTG (终浓度为0. 8 mmol/L)，25°C诱导4 h。取经诱导的菌液离心(4 °C, 5000 r/min离心15 min),菌体用100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)重悬,超声破碎细胞(功率300 W，超声I S，间歇3 S，共10 min)后，4°C，11000 r/min离心15 min,所得上清液作为无细胞提取物用于不对称转化反应。实施例10重组大肠杆菌无细胞提取物催化OPBE的不对称还原
水相反应15 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L，pH值6. 0)，5 mL无细胞提取物，200 g/L的D-葡萄糖，20 g/L的OPBE和0. 05 mM的NADP+，37°C在220 r/min摇床震荡反应15 h。水/辛醇两相反应5 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L，pH值6. 0)，5 mL无细胞提取物，200 g/L 的 D-葡萄糖，20 g/L 的 0ΡΒΕ，0. 05mM 的 NADP+ 以及 IOmL 的辛醇。37°C在 220r/min摇床震荡反应15h。反应时间进程曲线如下表所示，由表可知，约13 h反应达到平衡，水相中转化率达到52. 5%，水/辛醇两相中转化率达到70. 5%。
权利要求
1.一种氨基酸序列如SEQ NO. 2所示的羰基还原酶，GenBank收录号JQ782389，或者是在保持该羰基还原酶催化活性的条件下，由插入、缺失或替换如SEQ NO. 2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的羰基还原酶，在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备0 )-2_羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。
2.一种含权利要求I所述羰基还原酶的大肠杆菌重组质粒的构建方法，其特征在于从枯草芽孢杆菌(及^77心subtilisXmCC NO. I. 1508中克隆了羰基还原酶IolS和葡萄糖脱氢酶⑶H基因片段，采用双启动子法串联IolS基因和⑶H基因，构建了 pET24a-G-T7-I质粒，将该质粒导入大肠杆菌BL21 (DE3)而获得的大肠杆菌重组质粒，实现羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的共表达。
3.权利要求2所述方法构建的大肠杆菌重组质粒的应用，其特征在于以所述大肠杆菌重组质粒的无细胞提取物为催化剂，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，葡萄糖为辅底物，在不添加或添加〈O. 05 mmol/L NADP+辅因子的条件下，进行生物转化制备0 )-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，θθ值大于99. 5% ； 水相反应100 mmol/L，pH值6. O的15 mL磷酸钾缓冲液，5 mL无细胞提取物，200 g/L的D-葡萄糖，20 g/L的OPBE和O. 05 mM的NADP+，37°C在220 r/min摇床震荡反应13-15h ； 水/辛醇两相反应100 mmol/L，pH值6. O的5 mL磷酸钾缓冲液，5 mL无细胞提取物，.200 g/L 的 D-葡萄糖，20 g/L 的 0PBE，0. 05mM 的 NADP+以及 IOmL 的辛醇，37°C在 220 r/min摇床震荡反应13-15 h。
全文摘要
一种利用重组羰基还原酶催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，属于生物工程技术领域。本方法从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC NO.1.1508中克隆了羰基还原酶(IolS)和葡萄糖脱氢酶(GDH)基因片段，采用双启动子法串联表达IolS基因和GDH基因，构建重组质粒pET24a-G-T7-I，并将该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)。以该大肠杆菌重组质粒的无细胞提取物为催化剂，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，葡萄糖为辅底物，在不添加或添加少量NADP+辅因子的条件下，进行生物转化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，产物的对映体过量值高于99.5%。本发明通过IolS和GDH的共表达，实现细胞内辅因子NADP(H)的高效再生，降低了生产成本，具有很好的工业应用前景。
文档编号C12R1/19GK102618590SQ20121013769
公开日2012年8月1日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者倪晔, 宿宇宁, 李海东, 薛天芸 申请人:江南大学