专利名称：一种微生物谷氨酰胺转胺酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种微生物谷氨酰胺转胺酶(MicrobialTransglutaminase,简称 MTG)及其应用。
背景技术：
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase, EC 2.3.2. 13,简称TG)可以催化酰基转移反应，催化蛋白内谷氨酰胺Y-甲酰基与赖氨酸的e-氨基交联。在原核生物和真核生物中均存在TG。而微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)由于其不依赖于钙的活性，自从被发现以后就被广泛应用于工业，在食品、化工、医药等行业均有广泛使用。
微生物谷氨酰胺转胺酶(microbial transglutaminase缩写MTG)与凝血因子FACTOR XIII同属于一个家族的酶，具有与其类似的作用效果，很多研究表明了其在凝血反应中的作用。利用MTG可以交联明胶，形成良好的多空物或者网状物，可以在多方面应用，例如交联I型胶原蛋白，形成抗高温的胶(Nomura Y, Toki S，Ishii Y, ShiraiK. Biosci Biotechnol Biochem. 2001Apr; 65 (4) :982-5), MTG 与明胶作用形成的胶不会受热溶解(Chen T, Embree HD, Brown EM, Taylor MM, Payne GF. , Biomaterials. 2003Aug;24(17) :2831-41，美国专利5，834，232)并可用于细胞固定(Chen T, Small DA, McDermottMK, Bentley WE, Payne GF.，Biomacromolecules. 2003Nov_Dec; 4 (6) : 1558-63)，生物支架(Broderick EP,0’Halloran DM, Rochev YA, Griffin M, Collighan RJ, Pandit AS. J BiomedMater Res B Appl Biomater. 2005Jan 15;72(I):37-42. ；Chen RN, Ho HO, Sheu MT. Biomaterials. 2005Jul; 26 (20) :4229-35)。可以用MTG增加明胶的交联，以提高其强度和黏性，从而用于制作止血材料、止血敷料或止血用密封材料(McDermott MK, Chen T, WilliamsCM, Markley KM, Payne GF. Biomacromolecules. 2004 Jul-Aug; 5 (4) : 1270-9 ;中国专利200980131973. 6 和 200780051215. 4 ;美国专利8, 133，484 ；欧洲专利TO2012017415、W02011132153、BRPI0718328、ZA200904470、EP2303344、EP2303341 及 CN102124058)。对于医疗产品来说，酶的稳定性十分重要，特别是对于常温保存的产品来说更是如此。但是MTG的最佳反应温度一般在50°C _55°C左右，在常温(25°C )时酶活只有最佳反应温度的20%左右，即使是在体温(37°C )左右，酶活也只有最佳酶活的一半左右(BuettnerK, Hertel TC, Pietzsch M, Amino Acids. 2012,42(2-3):987-96. ；Marx CK,HertelTC, Pietzsch M, J Biotechnol. 2008 Sep 10; 136 (3-4) : 156-62.) 此外，MTG 酶的热稳定性比较差，60°C 10分钟可以导致MTG酶活损失80%左右(Marx CK, Hertel TC, Pietzsch M,J Biotechnol. 2008 SeplO;136 (3-4):156-62.) 有文献报道具有热稳定性MTG的突变位点包括2位的丝氨酸突变为酪氨酸，23位的丝氨酸突变为缬氨酸或酪氨酸，24位的酪氨酸突变为天冬酰胺，294位的赖氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；101位的丝氨酸突变为脯氨酸，250位的甘氨酸突变位有氨酸，157位的甘氨酸突变为丝氨酸。本发明提出一种新的微生物谷氨酰胺转胺酶，其氨基酸序列结构不同于已经文献报道，突变位点具有特定的组合，且最佳活性温度向较低温度偏离，还具有较好热稳定性。
发明内容
本发明克服现有技术以上缺陷，提出了一种新的微生物酰胺转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，其中，第10位上的氨基酸为丝氨酸、组氨酸或苏氨酸；第241位上的氨基酸为甘氨酸、苏氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸为缬氨酸、酪氨酸或丙氨酸。进一步地，所述第10位上的氨基酸为丝氨酸或者苏氨酸；所述第241位上的氨基酸为丙氨酸或者甘氨酸；所述第284位上的氨基酸缬氨酸或者酪氨酸。进一步地，本发明的第10位氨基酸还可以是谷氨酰胺、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、组氨酸或者苏氨酸；第241位氨基酸还可以是谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸或者丙氨酸；第284位氨基 酸还可以是谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或者丙氨酸。本发明中，所述微生物酰胺转氨酶活性的反应温度在25-75摄氏度之间。优选地，其酶活性的反应温度在25-45摄氏度之间。更优选地，其酶活性为在25摄氏度时所述酶活性仍然不低于35U。本发明微生物酰胺转氨酶的制备方法，包括以下步骤合成如SEQ ID NO. 8所示序列，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a并将其转化到大肠杆菌BL21中，得到基因工程菌。将该基因工程菌发酵表达，并破碎菌体，用亲和层析含有突变的MTG的融合蛋白。向融合蛋白溶液中按照融合蛋白的质量加入1/10质量的分散酶，37摄氏度作用30分钟，用DEAE离子交换法纯化。最终可以获得突变MTG蛋白。本发明还提供了一种微生物酰胺转氨酶的应用，是将如权利要求I所述的微生物酰胺转氨酶在10-75摄氏度下交联明胶。优选地，在25-45摄氏度下交联明胶。更优选地，在室温(25摄氏度)下将微生物酰胺转氨酶与明胶组合应用。本发明微生物酰胺转氨酶在室温下催化明胶交联的效率远远高于野生型的微生物酰胺转氨酶。所述微生物酰胺转氨酶用于催化明胶交联，还可用于制备止血剂。本发明微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)，可通过紫外诱变筛选得到，在70°C高温条件处理后该MTG仍然体现了很高的残余酶活。研究表明，本发明微生物谷氨酰胺转胺酶的最佳活性温度为40°C -50°C，优选为40°C，而野生型MTG的最佳活性温度为55°C，可见，本发明微生物谷氨酰胺转胺酶的最佳活性温度明显较低，且在常温及室温如25V _37°C时其比酶活显著高于野生型MTG。通过DNA测序结果显示，与野生型MTG相比，本发明微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)发生了突变，例如，突变为第10位的丙氨酸或丝氨酸、第241位的脯氨酸或丙氨酸、第284位的丝氨酸或缬氨酸。发生了突变变异的本发明MTG在常温下交联蛋白的能力大大提高，从而可以在常温高效粘合蛋白，可有效用于明胶制品的交联。本发明微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)具有新的氨基酸结构及新性能，在常温及偏低温度下具较好比酶活及最佳酶活性。本发明微生物谷氨酰胺转胺酶的纯化过程涉及蛋白质工程相关技术，可以在包括但不限于医药、食品等领域中作为包括但不限于辅助材料、药物或者添加剂等应用。
图I表示实施例I的本发明微生物谷氨酰胺转胺酶的酶活测定标准曲线。图2表示实施例2中部分诱变菌株的筛选结果示意图。图3表示实施例3中诱变菌株MTG基因的PCR产物电泳图。图4表示诱变的茂源链霉菌MTG基因与野生型MTG基因的核苷酸序列对比。图5表示实施例6中纯化的微生物谷氨酰胺转胺酶蛋白电泳图。图6表示本发明微生物谷氨酰胺转胺酶与野生型MTG在不同温度下的酶活。
具体实施方式
结合以下具体实施例及附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。实施例I酶活测定I)测酶活试剂配制A 液(0. 5L):将 0. 015mol (5. 06g)底物 Na-CBZ-Gln-Gly,0. 05mol (3. 475g)盐酸羟胺、0. 005mol (I. 536g)还原型谷胱甘肽加入400ml蒸懼水于烧杯中，用磁力搅拌器搅拌20分钟后，加入0. Imol (12. llg))Tris，用6mol/L(或lmol/L)盐酸调pH至6. 0，将溶液移至500ml容量瓶中，用蒸馏水洗涤烧杯3次倒入容量瓶中，定容至500ml。B 液3mol/L HCl,12% 三氯乙酸(W/V)、5% 三氯化铁(W/V，溶于 0. lmol/L 盐酸，再过滤)按I: I: I的体积比混合。2)酶活测定放线菌发酵液过滤，取滤液稀释5倍。实验组取0.2ml稀释液，加2ml A液37V温育10分钟，再加2ml B液。对照组取0. 2ml稀释液，加2ml B液37°C温育10分钟，再加2mlA液。于525nm测定吸光值。实验结果如图I所示酶活测定标准曲线，横坐标为酶活单位(U/mL)，纵坐标为酶反应液在525nm处的吸光值，图I表明该曲线的线性较好，相关系数大于99%。实施例2野生菌株的诱变野生型MTG菌株为茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis) STK4菌株。野生型MTG的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。培养基配置高氏一号培养基(g/L):可溶性淀粉20，KN031, MgS04 7H20 0. 5，K2HP04 3H20 0. 5，NaCl 0. 5，FeS04 7H20 0. 01，琼脂 20，pH 7. 2-7. 4。发酵培养基(g/L):甘油 20，酵母膏 6，鱼粉蛋白胨 25，MgS04 7H20 2，K2HP04 3H20 2，pH 7.4。向高氏一号培养基中加入IOml冷无菌水，用接种针充分刮取表面菌丝，打散孢子，无菌滤纸过滤。操作在红灯或避光条件下进行，提前0. 5h开紫外灯，使光源稳定。取浓度约为107个孢子/mL的孢子悬浮液3ml置于直径为6cm灭菌平皿中，利用磁力搅拌子搅拌，在紫外灯功率15W条件下，不同辐照距离，紫外辐照不同的时间进行诱变。避光Ih后，暗环境中将不同稀释度的孢子悬液涂布于高氏培养基上。30°C培养7天。
挑取单菌落，在发酵培养基中培养24小时，分别测定37°C时候选菌株和野生菌株的酶活。部分筛选结果如图2所示，其中，WT表示未经诱变的野生型菌株的发酵酶活；1#-5#分别是5株不同的诱变菌株的发酵酶活。MTG的酶活(U/mL)为发酵液的酶活，测定酶活的反应温度为37°C。图2表明2#菌株的酶活较野生菌株高。实施例3突变体MTG基因的获取基因组抽提将实施例2中液体培养的2#突变菌株的新鲜菌丝体接种于新鲜培养基，培养24小时左右；离心收集IOml菌体；新鲜菌体于研钵(一 20°C预冷)中，反复液氮研磨至细粉状，迅速平均分装至2个I. 5mL离心管中；加TE Buffer 550 y L，加65°C预热的20% SDS溶液30 u L，漩涡振荡5S，加20mg/mL蛋白酶K 20 u L,轻轻混匀，37°C保温Ih ;加等体积Tris饱和酹/氯仿/异戍醇(25 24 I)抽提,轻微颠倒混勻，IOOOOr / min离心IOmin ;小心吸取上清至新离心管中,加等体积氯仿/异戍醇(24 I)抽提,IOOOOr / min,离心5min ;吸取上清液与等体积异丙醇(4°C预冷)混勻,然后IOOOOr / min离心5min,弃上清。沉淀用lmL70%乙醇(4°C预冷)洗漆(颠倒、离心Imin),自然风干,加入40uL TE溶解，-20°C保存备用。 引物设计设计了一对引物可以通过聚合酶链式反应获取MTG基因的全序列，如SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2 所示Pf:CTCAACGAAAGCGCTCCGGCCGCTTC ；Pr:CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGC。PCR反应体系及反应条件将上述获得的基因组DNA和引物混合，按如下条件进行PCR 反应=Taq 酶反应液(2 倍浓度)25 y L、引物 Pf (2. 5mmol/mL) 2 y L、引物 Pr (2. 5mmol/mL) 2 ii L、DNA2 u L及无菌水。94°C变性I分钟、55 °C退火30秒、72°C 2分钟，一共40个循环。电泳检测PCR纯度，结果如图3所示，左边泳道是分子量标准DNA，右边泳道为PCR片段电泳结果。PCR片段大小在IOOObp与2000bp之间，与理论值1058bp —致。实施例4突变MTG基因的测序向实施例3中的PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置5分钟。12000rmp离心10分钟，弃尽上清；用70%的乙醇洗沉淀一次。干燥，用50 y L无菌水溶解沉淀。按如下体系反应无菌水溶解的PCR产物I y L、pUC19-T载体(Takara公司)0. 5 y L、连接酶0. 5 u L、缓冲液(10倍浓度)5 ii L及无菌水43 u L，混匀，16°C反应20分钟。将上述反应后的产物取5 iiL，加入到IOOii L大肠杆菌DH5 a感受态细胞(Takara公司)，4°C反应30分钟，42°C反应90秒，加入LB培养基，37°C培养I小时，将菌液涂布与LB平板上。待菌落形成后，送测序公司测序。测序结果如图4所示，与野生型MTG基因相比较，实验获得的2#突变株的MTG基因发生了突变，其中，第28位的G突变为T，第721位的C突变为G，第850位的A突变为G，第851位的G突变为T，如SEQ ID NO. 4所示。这些突变直接导致了 MTG氨基酸序列中第10位氨基酸Xaa由丙氨酸突变为丝氨酸，第241位氨基酸Yaa由脯氨酸突变为丙氨酸，第284位氨基酸Zaa由丝氨酸突变为缬氨酸，如SEQ ID NO. 5所示。实施例5MTG蛋白的一般纯化发酵培养基和菌株同实施例2，将茂源链霉菌孢子接种到装有30mL发酵培养基的，培养28小时。在4°C离心机中12000rmp离心30分钟，去除菌体和固体杂质，获得20mL培养基上清。加入40mL无水乙醇，4°C放置I小时。4°C离心机中12000rmp离心30分钟，弃尽上清，收集沉淀。将沉淀置于安倍瓶，冷冻干燥机中冻干36小时，即得到初步提纯的野生型MTG蛋白。
将突变的茂源链霉菌孢子接种到装有30mL发酵培养基的，培养24小时。其他操作步骤同上，纯化得到突变MTG蛋白。实施例6本发明突变MTG蛋白的精细纯化将实施例5中得到的蛋白利用离子交换柱进行蛋白精细纯化。填料为DEAE-825，平衡液为0. 05M的tris缓冲液，pH7. 4。流动相为pH6. 0的0. lmol/L磷酸二氢钠缓冲液。收集各个组分，电泳检测，得到纯度较好的MTG蛋白。将该组分脱盐后冻干。电泳结果如图5所示，左边泳道显示的是分子量标准蛋白质，右边泳道显示的是纯化后的MTG蛋白。实验结果显示该蛋白大小与预期37. 9kDa的分子量大小一致，而且纯度很高，电泳只有单一的条带，纯度大于99%。实施例6不同温度下突变MTG蛋白的比活性测定 将纯化得到的野生型MTG蛋白和本发明突变MTG蛋白分别在25 °C、37 °C >45 V、55°C、75°C下测定酶活。测定酶活所用方法同实施例I所述。测活使用的溶液在反应前分别在对应的温度下预热2分钟。实验结果如图6所示，在不同反应温度下，本发明突变MTG的比酶活表现出了与野生型MTG完全不同的走势。本发明突变MTG最佳反应温度在45°C左右，而野生型MTG最佳反应温度在55°C左右，本发明MTG最佳反应温度明显低于野生型MTG0而且，在25°C _75°C下，本发明MTG比酶活均显著高于野生型。在37°C时本发明MTG比酶活达到了 41U/mg，比野生型MTG酶活高了 51. 9%。此外，在55°C以上的高温条件下野生型MTG活性急剧下降而本发明MTG仍保留较高酶活。65°C _75°C时本发明MTG仍保留较高酶活，而此时野生型MTG几乎已经失活。可见，比野生型MTG相比较，本发明突变MTG具有显著良好的酶活力以及耐热稳定性。实施例7本发明突变MTG蛋白与明胶的作用(I)不同浓度的本发明MTG和野生型MTG与明胶的相互作用将含有20%低熔点明胶的溶液加热至60°C并剧烈搅拌，然后将溶液置于37°C保温过夜备用，制备得到明胶溶液。在50mL上述明胶溶液中分别加入0. lmg、ImgUOmg野生型MTG (对照组)、本发明MTG (实验组)，测定粘度。粘度测试在每次粘度计测试中，将上述加入MTG的明胶溶液置于烧杯中，追踪混合的明胶-MTG溶液经历胶凝时的粘度。通过记录每个测试组达到最大粘度的30%和90%所需的时间来比较不同的测试组，所述最大粘度能够在比速下且具有用于那个测试的特定转自的粘度计记录。本实验采用具有T-E“t-bar”转子的DV II+PR0数字粘度计(Brolkfield公司)转子最大可记录粘度是10 X 106cP,因此，30%和90%点分别为3 X 106cP和9 X 106cP。整个反应过程测试溶液都浸没在37°C水浴中。NT表示10分钟后仍未达到预定粘度。结果如表I所示，在相同MTG酶浓度下本发明突变MTG的胶凝效果远远优于野生型MTG，且随着酶浓度提高，凝胶效果也随之极大地提高。实验结果还表明，在较低浓度(0. Img)时，本发明仍然可以使明胶凝固，而野生型不能使明胶凝固。表I本发明突变MTG和野生型MTG对凝胶时间的影响
权利要求
1.一种微生物酰胺转氨酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，其中，第10位上的氨基酸为丝氨酸、组氨酸或苏氨酸；第241位上的氨基酸为甘氨酸、苏氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸为缬氨酸、酪氨酸或丙氨酸。
2.如权利要求I所述的微生物酰胺转氨酶，其特征在于，所述第10位上的氨基酸为丝氨酸或苏氨酸；所述第241位上的氨基酸为丙氨酸或甘氨酸；所述第284位上的氨基酸为缬氨酸或酪氨酸。
3.如权利要求I所述的微生物酰胺转氨酶，其特征在于，其酶活性的反应温度在25-75摄氏度之间。
4.如权利要求3所述的微生物酰胺转氨酶，其特征在于，其酶活性的反应温度在25-45摄氏度之间。
5.如权利要求3所述的微生物酰胺转氨酶，其特征在于，其酶活性为在25摄氏度时的酶活性不低于35U。
6.一种微生物酰胺转氨酶的应用，其特征在于，将如权利要求I所述的微生物酰胺转氨酶在25-75摄氏度下交联明胶。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述微生物酰胺转氨酶在25-45摄氏度下交联明胶。
8.—种微生物酰胺转氨酶的应用，其特征在于，将如权利要求I所述的微生物酰胺转氨酶与明胶交联用于止血。
全文摘要
本发明提供一种新的微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，第10位上的氨基酸为丝氨酸、组氨酸或苏氨酸；第241位上的氨基酸为甘氨酸、苏氨酸或丙氨酸；第284位上的氨基酸为缬氨酸、酪氨酸或丙氨酸。所述微生物谷氨酰胺转胺酶在常温下具有强比活力，用于交联明胶，可用作止血材料。
文档编号C12R1/465GK102719411SQ201210202170
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者刘明耀, 金明飞, 高红亮 申请人:华东师范大学