利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的培养基及方法

专利名称：利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的培养基及方法
技术领域：
本发明属于生物制造领域，更具体涉及一种利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的培养基及方法。
背景技术：
柑橘类果汁由于含有丰富的营养成分并具有保健功效，目前已成为消费量较大的果汁产品且在世界市场中占有67%左右的份额。当前国内生产的柑橘类水果用于加工的量仅为总量的5%，这使得国内果汁加工产业发展较为滞后。国际市场上销售的橙汁主要来自、巴西和美国，其中美国主要集中葡萄柚汁的生产。葡萄柚(Grapefruit)又称为西柚，起源于亚洲，主要产于亚、非和拉丁美洲等地。葡萄柚从植物分类学上与我国原产的柚十分相似，为芸香科柑桔属植物，与宽皮柑橘类、柠檬类、甜橙类构成世界柑橘四大类群。目前市场上主要的葡萄柚品种为Marsh、Duncan、Thompson三类。随着人们对葡萄柚独特风味和营养价值的认知，葡萄柚的消费量不断上升。但柑橘类果实的海绵层和种籽在加工成果汁过程中，会产生大量的苦味物质。此夕卜，柑桔属果实的果汁在静置过程中会出现“后苦味”现象。目前认为苦味是由两大类物质引起的一类是以柚皮苷(Naringin)为代表的黄酮类化合物，主要存在于葡萄柚等柚子果实中，在柚子皮以及果实囊衣中的柚皮苷含量可占到80%;另一大类是以柠檬苦素(Limonoids)为代表的三萜类衍生物，其中柠碱是产生“后苦味”现象的主要苦味物质。“后苦味”的形成是由于果实中存在柠碱酸盐A-环内酯，是一种非苦味物质的前体；在果汁加工过程中，果汁中的非苦味前体被相应的水解酶催化产生柠碱，而使得果汁变苦。当前去除柑桔类果汁苦味的方法主要为酶法脱苦，如利用柚苷酶和柠碱苦素酶脱苦；吸附脱苦法，如采用活性炭或醋酸纤维吸附柱；代谢脱苦法，如采用三乙胺衍生物或乙烯气体处理果实与果树。此外还有加热脱苦法、β-环糊精脱苦以及超临界CO2处理等。酶法脱苦技术是利用由微生物产生的不同的酶分别处理柚皮苷和柠碱，降低其在果汁中的含量，达到适宜的感官承受范围。由假单胞菌属和节杆菌属产生的柠碱苦素酶主要用于降解柠碱；曲霉发酵产生的柚苷酶则主要用于柚皮苷的降解。柚苷酶是由鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶构成，可将柚皮苷最终降解为无苦味的柚配质。由于酶法脱苦较为温和，节省能源，且克服了其它脱苦技术的缺点，保留了柑橘类果汁原有的风味和营养物质，因而成为当前果汁加工行业的研究热点。国内外学者对柠碱苦素酶的代谢通路及其脱苦路径的研究较为广泛深入，而对柚苷酶的研究则较少。

发明内容
本发明提供了一种利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的培养基及方法，以提闻袖昔酶的广量。本发明首先提供了一种利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的培养基，所述培养基为桔皮粉 2. 0-3. 0%,豆渣 O. 5-2. 5%,酵母膏 O. 2%, KH2PO4 I. 0%, Na2HPO4 O. 1%，MgSO4- 7H20 I. 0-2. 5mmol/L, FeCl3 0. 5-1. OmmoI/L, CaCl2 I. 0-5. OmmoI/L,培养基初始ρΗ5· 0-6. O0所述桔皮粉的制作方法为收集新鲜的桔皮，烘干，粉碎后过3(Γ120目筛网，得到桔皮粉。本发明还提供了一种利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的方法，以黑曲霉为出发菌株，对其进行发酵培养，采用的培养基为桔皮粉2. 0-3. 0%，豆渣O. 5-2. 5%，酵母膏 O. 2%, KH2PO4 I. 0%, Na2HPO4 O. 1%，MgSO4 7H20 I. 0-2. 5mmol/L, FeCl3 O. 5-1. OmmoI/L，CaCl2 I. 0-5. OmmoI/L,培养基初始ρΗ5· 0-6. O ;培养条件为接种量5. 0-9. 0%，培养温度30-33°C，装液量 30-50mL/250mL，摇床转速 180 r/min。本发明实施例中具体以黑曲霉S-05菌株(参考文献谈小芳等，黑曲霉S-05产柚苷酶的纯化与分离.食品与发酵工业，2010，36 (8):59-63.)为生产菌株，对其产酶培养基和发酵条件进行优化。优化后的产酶条件为桔皮粉(30目^120目)27g，豆渣5g，酵母骨 2g, KH2PO4 10g, Na2HPO4 lg, MgSO4 7H20 I. Ommol/L, FeCl3 I. Ommol/L, CaCl2 I. Ommol/L,蒸馏水lOOOmL，培养基初始pH5. 0 6. 0 ;接种量5. 0%，培养温度30°C，装液量30mL/250mL，摇床转速180 r/min。在上述条件下发酵，产酶水平可达到114. 68U/mL。本发明的显著优点虽然利用酶法脱苦已成为柑橘类果汁加工中的新兴研究方向，但国内尚未出现商品化的柚苷酶，主要还是依靠向美国、巴西等国家进口商品柚苷酶。国内学者为提高柚苷酶的活力做了一些研究，如产酶菌株的获取、产酶特性研究等方面，但获得的菌株产酶能力相对较弱。本发明通过建立了黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的工艺条件，以此来提高柚苷酶的产量，为柚苷酶的生产和应用打下基础；而且以桔皮粉和豆渣等农业废弃物为生产原料，变废为宝，实现了农副产品的高值化利用，减少了环境污染，具有重要的社会经济和环保生态效益。


图I各种碳源对产酶能力的影响。
图2桔皮粉添加量对产酶能力的影响。图3各种氮源对产酶能力的影响；其中SP:大豆蛋白；BP:豆饼粉；SR:豆渣；UR:尿素；CA:干酪素；SO:豆柏粉；PE:蛋白胨；PP:花生饼粉；AN: NH4NO3 ;AS:(NH4)2SO4 ;SN:NaNO3。图4豆洛添加量对产酶能力的影响。图5各种金属离子对产酶能力的影响。图6不同培养基初始pH对产酶能力的影响。图7接种量对产酶能力的影响。图8发酵温度对产酶能力的影响。图9装液量对产酶能力的影响。图10黑曲霉S-05菌株的pH和产酶曲线。
具体实施例方式以下采用黑曲霉S-05菌株(参考文献谈小芳等，黑曲霉S-05产柚苷酶的纯化与分离.食品与发酵工业，2010，36 (8):59-63.)为生产菌株，对其产酶培养基和发酵条件进行优化。I柚苷酶活力的测定方法
采用Davis法(改良法)测定酶活力。取2. OmL O. 2mol/L的醋酸缓冲液(pH4. O)与
2.O mL 400 μ g/mL的柚皮苷标准溶液混合,4(TC保温5 min ;加入I. O mL经适当稀释的粗酶液(将经液体发酵得到的发酵液于4°C、8000 r/min离心10 min，收集上清液作为粗酶液)，40°C水浴反应30 min;取O. 5 mL反应液与2. 5 mL柚皮苷显色液(90%—缩二乙二醇lmol/L NaOH溶液=5:1)混合后30°C水浴20 min，在420 nm处测定吸光值。空白组以I. O mL的蒸馏水代替。柚苷酶活力单位⑶定义在400C、pH4. O条件下，每min每mL酶液所能降解的
柚皮苷含量。酶活力(U/mL)=(NXaX5) / (TX0.5)
其中，N—酶液稀释倍数；a—柚皮苷降解量(μ g/mL) ；T一反应时间。2产酶培养基的优化
优化前的培养基组成(g/1000 mL蒸馏水)柚皮苷1.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g, MgSO4 7H20
I.O g, KH2PO4 I. O g，Na2HPO4 O. I g，KCl 0.5 g, NaCl 0.2 g, CaCl2 0. I g，酵母膏 2.0 g,pH 5. 0 6· 0。2. I碳源种类对产酶的影响
以优化前的培养基为基础培养基，分别以2. 5%(w/v)的麸皮、葡萄糖、蜂蜜、玉米淀粉、桔皮粉、可溶性淀粉、果糖、小麦面粉、蔗糖、红糖和柚皮苷作为碳源配制成液体产酶培养基(装液量70mL/250mL)。每瓶按10% (v/v)的接种量接入单孢子悬液(OD6tltl=O. 4)，30°C、180r/min培养4d,测定各发酵液酶活，以确定最佳碳源。各种碳源种类对黑曲霉S-05菌株产柚苷酶能力的影响结果如图I所示，以最高酶活力(柚皮苷为碳源发酵得到的柚苷酶活力)为100%，其余与之相比得到相对酶活力。由图I可直观看出以桔皮粉、柚皮苷作为碳源对黑曲霉S-05菌株产酶能力有显著影响，其中柚皮苷尤为显著，此时所产酶的活力最大；以桔皮粉为碳源时，菌株所产酶的相对活力也可维持在85. 9%。柚皮苷作为碳源诱导黑曲霉S-05菌株产柚苷酶效果虽显著，但使用成本较为昂贵；而桔皮粉获得相对简易且成本低廉，产酶能力与柚皮苷诱导相近，从降低生产成本角度出发，选择桔皮粉作为最佳碳源。2. 2碳源添加量对产酶的影响
确定最优碳源以后，选择桔皮粉的添加量范围为O. 3%-5. 4%(间隔为O. 3%) (w/v)，每瓶70mL/250mL，按 10%(v/v)的接种量接入单孢子悬液(OD6tltl=O. 4)，30°C、180 r/min 培养 4d，测定各发酵液酶活，以确定最佳碳源添加量。以最高酶活力(2. 7%桔皮粉作为碳源发酵得到的柚苷酶活力)为100%，其余与之相比得到相对酶活力。从图2可确定桔皮粉的最适添加量为2.7%。当桔皮粉添加量低于2. 7%时产酶能力较低，可能是由于黑曲霉S-05菌株缺乏充足的碳源使得生长受到限制；当桔皮粉浓度超过2. 7%时培养基较为粘稠，这可能使得整个培养过程中溶氧量受到限制，从而影响菌体生长，进而使产酶能力下降。、
2. 3氮源种类对产酶的影响
在碳源和碳源添加量优化的基础上，进一步考察有机氮源(大豆蛋白、蛋白胨、豆柏、豆饼粉、尿素、干酪素、花生饼粉、豆渣)、无机氮源(NH4N03、(NH4)2SO4^NaNO3)对黑曲霉S-05菌株产酶的影响，氮源添加量均为O. 5%(w/v)，结果如图3所示。以豆渣为氮源发酵得到的柚苷酶的酶活力为100%，其余与之相比得到相对酶活力。SP:大豆蛋白；BP:豆饼粉；SR:豆渣；UR:尿素；CA:干酪素；SO:豆柏粉；PE:蛋白胨；PP:花生饼粉；AN: NH4NO3 ；AS: (NH4)2SO4 ;SN: NaNO3
从图3可知，各种氮源对黑曲霉S-05菌株产酶能力影响各不相同。豆渣、(NH4)2SO4对产酶能力影响最为显著，豆柏粉次之；蛋白胨、花生饼粉的效果较差。从考虑生产成本出发，选用豆渣作为最佳的氮源。2. 4豆渣添加量对产酶的影响
在确定以豆渣为最适氮源后，分别以O. 5 %、2·5 %、4·5 %、6·5 %、8· 5 %、10.5 %(w/v)的豆渣添加量进行实验，确定最佳豆渣添加量，如图4所示。以O. 5%豆渣作为氮源发酵得到的柚苷酶的活力为100%，其余与之相比得到相对酶活力。由图4可知，当豆渣添加量维持在O. 5%-2. 5%时，黑曲霉S_05菌株产酶能力较高；当豆渣添加量超过2. 5%后，豆渣添加量的不断增大使得培养基含水量越来越低，从而使得液体培养基的溶氧量急剧下降，影响菌体产酶。因此，确定豆渣的最适添加量为O. 5-2. 5%。2. 5金属离子对产酶的影响
金属离子主要以无机盐的形式添加入培养基中。无机盐提供微生物除碳源、氮源之外的其它所需离子。单因素实验结果如图5所示，以空白组(不添加金属离子)酶活力为100%，其余与之相比得到相对酶活力。由图5可知，Mg2+、Fe3+、Ca2+的添加可以促进黑曲霉S-05菌株合成柚苷酶。Mg2+最佳添加浓度为5mmol/L ;Fe3+添加量不超过lmmol/L ;而Ca2+添加浓度范围为l 10mmol/L。因此选取Mg2+的添加浓度为l-5mmol/L，Fe3+的添加浓度为0-lmmol/L，Ca2+的添加浓度为1-lOmmol/L，设计正交表L9(34)优化三种金属离子的配比。正交实验因素表以及正交设计表，见表1、2、3 (以配方7发酵得到的柚苷酶的酶活力为100%，其余与之相比得到相对酶活力)。表I实验因素和水平表
权利要求
1.ー种利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的培养基，其特征在于所述培养基为桔皮粉 2. 0-3. 0%，豆渣 0. 5-2. 5%，酵母膏 0. 2%, KH2PO4 I. 0%, Na2HPO4 0. 1%，MgSO4. 7H20.1. 0-2. 5mmol/L, FeCl3 0. 5-1. OmmoI/L, CaCl2 I. 0-5. OmmoI/L,培养基初始 pH5. 0-6. O。
2.根据权利要求I所述的利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的培养基，其特征在于所述桔皮粉的制作方法为收集新鲜的桔皮，烘干，粉碎后过3(T120目筛网，得到桔皮粉。
3.ー种利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的方法，其特征在干以黑曲霉为出发菌株，对其进行发酵培养，采用的培养基为桔皮粉2. 0-3. 0%，豆渣0. 5-2. 5%，酵母膏.0.2%, KH2PO4 I. 0%, Na2HPO4 0. 1%，MgSO4. 7H20 I. 0-2. 5mmol/L, FeCl3 0. 5-1. OmmoI/L, CaCl2.1.0-5. Ommol/L，培养基初始pH5. 0-6. 0 ;培养条件为接种量5. 0-9. 0%，培养温度30_33°C，装液量 30-50mL/250mL，摇床转速 180 r/min。
全文摘要
本发明属于生物制造领域，更具体涉及一种利用黑曲霉发酵桔皮粉和豆渣生产柚苷酶的培养基及方法。所述培养基为桔皮粉2.0-3.0%，豆渣0.5-2.5%，酵母膏0.2%，KH2PO41.0%，Na2HPO40.1%，MgSO4.7H2O1.0-2.5mmol/L，FeCl30.5-1.0mmol/L，CaCl21.0-5.0mmol/L，培养基初始pH5.0-6.0。培养条件为接种量5.0-9.0%，培养温度30-33℃，装液量30-50mL/250mL，摇床转速180r/min。本发明提高了柚苷酶的产量，为柚苷酶的生产和应用打下基础。
文档编号C12N9/24GK102732491SQ20121023579
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者叶秀云, 杨捷, 林娟, 蔡梅华, 陈增 申请人:福州大学