专利名称：一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法
技术领域：
本发明涉及改造大肠杆菌遗传组基因领域，确切地说是一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法。
背景技术：
近年来，重组蛋白药物市场发展迅猛，已成为一个重要的高新技术产业。其中重要的市场重组蛋白药物主要有人甲状旁腺激素，B淋巴细胞刺激因子，人表皮生长因子，Y 一干扰素，溶血酶素及各种抗体等。在各种重组蛋白的生产中，大肠杆菌仍然是使用最广泛的宿主系统。在大肠杆菌宿主系统中，根据重组蛋白合成后的空间定位，可分为胞内表达与分泌表达。大肠杆菌胞内表达的重组蛋白常形成包涵体，因不正常的空间折叠结构而无活性并沉淀。分泌表达又可分为周质空间表达和胞外表达，而胞外分泌表达的重组蛋白因 其氧化还原环境适宜于形成正常的蛋白空间结构，不形成包涵体，正常情况下为有活性可溶性蛋白，且分泌表达的蛋白很少受到蛋白酶降解。从而提高了活性蛋白的表达水平，降低分离成本。因此，胞外表达对于提高重组蛋白产量和纯度，简化下游工艺具有重要意义。大肠杆菌常缺乏天然的胞外分泌机制，大多数外源蛋白无法分泌到培养基中。胞外渗漏表达是指采用理、化及遗传方法使宿主细胞壁或细胞外膜发生缺失或损伤，从而使目标蛋白渗漏到胞外培养基中。胞外渗漏表达采用的方法可分为化学渗漏，即应用脂溶剂及其它化学试剂控制细胞渗漏；物理渗漏，即应用冻融等物理方法使细胞渗漏；生物渗漏，即应用抗生素等生物试剂使细胞膜或壁的合成受阻而导致渗漏；遗传渗漏，即使用遗传手段改变细胞壁或膜的通透性，使胞内蛋白部分选择性地渗漏至培养基中。遗传渗漏具有多种优势，如可选择性的分泌目标蛋白，无需专门的渗漏工艺，无有毒化学试剂添加等。故遗传渗漏常为目标蛋白渗漏表达的首选。目前报道的大肠杆菌胞外生产重组蛋白的方法常是通过理化诱变筛选遗传突变的胞外高产菌株。但该方法筛选过程复杂，机理不明，重复性差。理论上，遗传工程改造大肠杆菌可导致其细胞外膜或细胞壁缺陷，使其周质空间蛋白部分释放到培养基中。使用遗传工程突变的渗漏菌株进行胞外蛋白的生产鲜有报道。如大肠杆菌的7卻突变体可以将周质空间蛋白渗漏至培养基中而不显著影响菌株的正常生长，但目标蛋白的渗漏比率及其产量仍然有很大的提高空间。此外，共表达裂解蛋白Kil或BRP (细菌素释放蛋白)也能改变大肠杆菌细胞外膜的通透性，从而使周质空间蛋白释放到培养基中。
发明内容
本发明提供一种大肠杆菌外源蛋白发酵和胞外分泌同时进行的重组蛋白胞外表达的用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，通过遗传工程改造方法得到的细胞壁或膜双基因敲除的通透性增强的分泌型菌株，并将胞内合成的外源蛋白通过信号肽或融合蛋白导入到细胞周质空间，进而选择性地渗漏至培养基中，提高蛋白表达水平并降低分离成本成为本发明的目的。一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因取mrcB，imrcB琳Ipp的双敲除基因或其他基因组合的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10 250 bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的浓度为I 1000 ng/μ 的和arci ,或arci 和Ipp的双敲除基因或其它基因组合的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株；所述的其他基因组合指的是mrcA, mrdA, rodA, murC, rodZ中任意两个的组合。所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株含有的基因/^7和基因编码区发生了突变，或者基因/^7和基因的启动子区域发生了突变，从而使基因和基因《γΜ无法表达出相应Pal和MrcB蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal和MrcB蛋白产物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。
所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于
所述的双基因突变大肠杆菌的应用包括外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建、分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程；
所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建方法为将外源目标蛋白质基因先重组到分泌型质粒pET32a(+)中，随后克隆到所述的双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株中，进而得到外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株。所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株含有编码外源蛋白的重组基因质粒，该重组质粒中外源蛋白基因与定位于周质空间的信号肽编码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信号肽导入于周质空间进而渗漏到培养基中。所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程指的是在发酵培养基中使用外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株生产外源蛋白。所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的发酵培养基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02 O. 5% KH2PO4,0. I 2% Κ2ΗΡ04。本发明的原理为
本发明所说的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，主要包括构建特定的细胞膜和细胞壁改变的重组蛋白胞外表达的大肠杆菌生产菌株和在发酵培养基中使用该生产菌株生产外源蛋白。其特征在于使用预先设计的/^7基因和基因敲除引物进行PCR反应，得到两端为10 250 bp特定目标基因同源序列及中间为抗性筛选标记序列的高浓度(10 1000 ng/ml)/7a7基因和《TM基因打靶片段。并将其先后电转化导入到经过诱导的含PKD46的待突变大肠杆菌出发菌株中，从而实现和arc沒的双基因突变。其中所说的细胞膜和细胞壁改变的分泌型重组大肠杆菌生产菌株指'pal和mrcB, M^mrcB和Ipp的双敲除基因及其它基因组合(《rc儿mrdA, rodA, murC, rodZ等)编码区的核苷酸缺失或替换；或在基因的启动子区域的核苷酸缺失或替换的突变菌株。优选pal热mrcB双基因突变。有益效果
I、本发明构建的双敲除分泌型菌株提供了一种新的大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白途径，目标蛋白的渗漏比率和产量得到了进一步提高。2、本发明实现了重组蛋白发酵和胞外分泌同时进行。在发酵过程中，重组目标蛋白可以从胞内渗漏且不显著影响菌体的持续生长，降低了目标蛋白的胞内降解，提高重组蛋白表达；同时减少了重组蛋白的胞内过度积累，而降低了包涵体形成；消除了细胞破壁工艺，减少了热原污染；设计培养基组成，便于分离纯化，进而达到降低了生产成本，提高产品质量的目的。渗漏不仅简化了纯化重组蛋白的工艺，也提高了目标产物的表达水平。经检测，超过50%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%。3、本发明采用大肠杆菌的和fflrcS等双基因突变株为宿主和定位外源蛋白于 周质空间的载体，使得外源蛋白的表达和胞外积累同时进行。从而提高重组外源蛋白的表达，降低目标蛋白的胞内降解；减少重组外源蛋白的胞内积累，消除了包涵体的形成；取消了细胞破壁工艺，降低了热原，简化了分离纯化；进而达到降低生产成本，提高蛋白表达和产品质量的目的。经检测，超过50%的外源重组蛋白可渗漏到培养基中，表达水平为10 30%。
图I为双基因敲除突变株目标蛋白表达SDS-PAGE结果(目标蛋白重组硫氧还人甲状旁腺激素融合蛋白；泳道1-7为胞外蛋白，泳道8-14为胞内蛋白，M为标准蛋白)。泳道I为mrcA和/7^7双基因突变株；泳道2为mrcB和/7^7双基因突变株(实施例I);泳道3为Ipp和@7双基因突变株；泳道4为mrcA和Ipp双基因突变株；泳道5为Ipp和mrcBl基因突变株(实施例2);泳道6为阳性对照；泳道7为阴性对照；泳道8 ^kmrcA和/7^7双基因突变株；泳道9为mrcB和/7^7双基因突变株(实施例I);泳道10为Ipp和/7^7双基因突变株；泳道11为,CA和Ipp双基因突变株；泳道YZ为Ipp WmrcB双基因突变株(实施例2);泳道13为阳性对照；泳道14为阴性对照。(其他泳道的双基因突变组合包含于权利要求I之中)
具体实施例方式本发明所说的重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，包括以下步骤
A、双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株构建、即构建和双基因突变的分泌型菌
株
a、构建大肠杆菌基因突变的分泌型菌株
(1)使用预先设计的特定基因敲除引物，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，称为pa/基因打靶片段。打靶片段两端为10 250 bp(优选30 100 bp)的/^7基因同源序列，中间为氯霉素抗性标记序列。将其使用PCR产物纯化试剂盒得到高浓度10 1000 ng/μ (优选100 500 ng/H)pal基因打靶片段；
(2)利用I 100mmol/L (优选5 20 mmol/L)的L-阿拉伯糖诱导含敲除辅助质粒PKD46的大肠杆菌出发菌株O. 2 10 h (优选I 3 h)，再将诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将纯化后的高浓度/^7基因打靶片段电转化导入所得的诱导后的大肠杆菌出发菌株电转化感受态细胞之中，在含O. 5 50 mmol/L (优选2 25 mmol/L)的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复O. 2 20 h，使用抗性LB固体培养基筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法确定/7^7基因区域发生正确的替换突变后，即得基因突变菌株；具体步骤请参考文献(Datsenko and Wanner 2000 )；
h、pal ^mrcB双基因突变的分泌型菌株构建
(1)用步骤a所得/^7基因突变的分泌型菌株制备化学感受态细胞，后将其导入质粒PCP20,再涂布于含5 500 μδ/πι1 (优选10 200 Pg/ml)的Amp的抗性平板于温度20 450C (优选25 35°C )左右的条件下筛选出含质粒pCP20的单菌落重组子，再转接入LB液体培养基在温度30 50°C (优选35 45°C )条件下培养3 48 h (优选12 24 h)，之后将所得菌液进行稀释涂布，得到的单菌落再分别转接入LB抗性平板进行标记抗性测试，并用PCR法和测序法鉴定是否完成了抗性标记基因的剔除，经过确认的无标记/^7基因突 变菌株采用终浓度4 36%(优选8 18 %)的甘油于温度-5 -80°C (优选-10 _40°C )保藏，得pal和mrcB双基因突变的出发菌株；
(2)将所得的押7和双基因敲除的出发菌株划LB平板并在20 45°C(优选30 420C )活化，转接入LB液体培养基20 45°C (优选30 42°C )制备化学感受态细胞，后导入敲除辅助质粒PKD46，再将得到的菌液涂布于含5 500 μδ/πι1 (优选10 200 μδ/πι1)的Amp的抗性平板，于温度30 50°C (优选35 45°C )条件下筛选含质粒pKD46的单菌落重组子，使用酶切法鉴定该重组子是否含PKD46质粒，含pKD46质粒的菌种即为含pKD46的基因突变的分泌型菌株；
(3)所得含pKD46的/7^7基因突变菌株于20 45°C(优选30 42°C)的条件下制备电转化感受态细胞，再将其通过I 100 mmol/L (优选5 20 mmol/L)的L-阿拉伯糖诱导O. 2 10 h (优选I 3 h)，后将纯化后高浓度的基因打靶片段导入其中，纯化后高浓度的 TM基因打靶片段的制备方法同步骤a，在含O. 5 50 mmol/L (优选2 25mmol/L)的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复0. 2 20 h，使用抗性平板在温度30 50°C (优选35 45°C )筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法鉴定基因区域发生了替换突变，确认后的突变菌种发生了两次同源重组，即为/^7和双基因突变的分泌型菌株；
B、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建(人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株的构建)
将合成的人甲状旁腺激素hPTH基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pET32a-/7iA仏转化到^mrcB双基因突变的分泌型菌株得到分泌型重组菌株，即产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株。C、分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程
先使用含5 500 μδ/πι1 (优选25 100 Pg/ml)的Amp的LB固体培养基活化该工程菌株，3 72 h (优选12 36 h)后挑单菌落接种到带有3 300 ml (优选10 50 ml)的含5 500 Pg/ml (优选10 200 Kg/ml)的Amp的LB种子培养基的250 ml摇瓶中，在温度20 45 °C (优选30 42°C)，转速50 500 rpm (优选150 300 rpm)的条件下培养3 72 h (优选12 36 h)，再将O. I 10 ml (优选O. 5 5 ml)的该菌液接种到带有 3 300 ml (优选 10 50 ml)含 5 500 μδ/πι1 (优选 10 200 Pg/ml)的 Amp 的 TB液体发酵培养基的250 ml摇瓶中，当培养基中菌体浓度达到在0D600为O. 05 I. 8 (优选O. 2 O. 8)时加入终浓度为O. 05 5 mmol (优选O. 2 O. 8 mmol)的IPTG，诱导发酵I 24 h (优选2 12 h)后终止发酵。得到发酵液于常温下离心分离，收集上清液即得重组蛋白粗提物。其中所说的LB种子培养基为0. I 5%胰蛋白胨、O. 05 5%酵母提取粉以及O. 05 5%NaCl ；
TB液体发酵培养基为0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02 O. 5% KH2PO4,0. I 2% K2HPO4 ；
LB固体培养基为0. 5 5%的琼脂，O. I 5%胰蛋白胨、O. 05 5%酵母提取粉以及
0.05 5%NaCl。本发明采用和fflrcS双基因突变的大肠杆菌作为外源蛋白质宿主菌株,定位于周质空间的载体作为重组目标蛋白表达质粒。所用原料均为市售品。本发明实现了重组蛋白发酵和胞外分泌同时进行。在发酵过程中，重组目标蛋白可以从胞内渗漏且不显著影响菌体的持续生长，降低了目标蛋白的胞内降解，提高重组蛋白表达；同时减少了重组蛋白的胞内过度积累，而降低了包涵体形成；消除了细胞破壁工艺，减少了热原污染；设计培养基组成，便于分离纯化，进而达到降低了生产成本，提高产品质量的目的。渗漏不仅简化了纯化重组蛋白的工艺，也提高了目标产物的表达水平。经检测，超过50%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%。下面结合实施例对本发明作进一步阐述，其目的是更好理解本发明内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明匀采用如下材料
I)菌种
宿主为Escherichia coli JM109 (DE3),敲除辅助质粒pKD46,抗性标记基因质粒pKD3和pKD4，抗性标记基因剔除质粒pCP20。pal基因敲除引物palH+PF和palH+PR，pal基因鉴定引物PalTl和palT2。基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，fflrM基因鉴定引物mrcBTl和 mrcBT2。2)培养基
种子培养基1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取粉以及O. 5%NaCl ；
发酵培养基1. 2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取粉，O. 5%甘油，O. 231%KH2P04，
1.254%K2HP04 ；
固体培养基1. 5%的琼脂，1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取粉以及O. 5%NaCl ；
SOC 培养基2% 胰蛋白胨，O. 5% 酵母提取粉，O. 05%NaCl，2. 5 mM KCl 10 mM MgC12，20
mM葡萄糖。所用试剂均为市售品。实施例I
一种重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，包括以下步骤
Lpal和双基因突变的分泌型菌株的构建包括以下步骤a、构建/7a7基因突变的分泌型菌株
(1)使用预先设计的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp的基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2小时，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的/^7基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物PalTl和palT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变的分泌型菌株； b、构建和《TM双基因突变的分泌型菌株
(1)用所得/^7基因突变菌株制备化学感受态细胞，后将其导入质粒pCP20，再涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板于30°C条件下筛选出含质粒pCP20的单菌落重组子，再转接入LB液体培养基在39°C条件下培养15小时，之后将所得菌液进行稀释涂布，得到的单菌落再分别转入LB抗性平板进行标记抗性测试，并用PCR法和测序法鉴定是否完成了抗性标记基因的剔除，经过确认的无标记/^7基因突变菌株采用终浓度13%甘油于-20°C保藏，得pal和双基因敲除的出发菌株；
(2)将所得的^mrcB双基因敲除的出发菌株划LB平板37°C左右活化，转接入LB液体培养基37°C左右制备化学感受态细胞，后导入敲除辅助质粒pKD46，再将得到的菌液涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板，于30°C条件下筛选含质粒pKD46的单菌落重组子，使用酶切法鉴定该重组子是否含PKD46质粒，含pKD46质粒的菌种即为含pKD46的基因突变的分泌型菌株；
(3)所得含pKD46的单基因突变菌株于30°C条件下制备电转化感受态细胞，再将其通过IOmmol L-阿拉伯糖诱导2小时，后将纯化后高浓度的特定打靶片段导入其中，纯化后高浓度的特定打靶片段的制备方法同实施例1，再将其经过在含5 mmol L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时左右后，使用抗性平板37°C筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法鉴定基因区域发生了替换突变，确认后的突变菌种发生了两次同源重组，即为^mrcB双基因突变的分泌型菌株；
B、重组蛋白发酵
将合成的人甲状旁腺激素hPTH基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pET32a-/7iA仏转化到^mrcB双基因突变的分泌型菌株得到分泌型重组菌株，即产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株。先使用含50μ8/πι1的Amp的LB平板活化该工程菌株，22小时后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，37°C 200转摇床培养18小时，再将该菌液接种到带有30ml含50μδ/πι1的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为
O.I左右，200转摇床培养8小时后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4小时后终止发酵，即得，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。经检测，超过50%的重组蛋白渗漏到培养基中。
实施例2
一种重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，包括以下步骤
k,mrcB和Ipp双基因突变的分泌型菌株的构建包括以下步骤
a、构建T/7/7基因突变的分泌型菌株
(1)使用预先设计的7卻基因敲除引物IppH+PF和IppH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物， 得到基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp的Ipp基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2小时，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物IppTl和1ρρΤ2进行PCR法和测序法确定Ipp基因区域发生替换突变后，即得Ipp基因突变的分泌型菌株；
b、构建《TM和Ipp双基因突变的分泌型菌株
(1)用所得Ipp基因突变菌株制备化学感受态细胞，后将其导入质粒PCP20，再涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板于30°C条件下筛选出含质粒pCP20的单菌落重组子，再转接入LB液体培养基在39°C条件下培养15小时，之后将所得菌液进行稀释涂布，得到的单菌落再分别转入LB抗性平板进行标记抗性测试，并用PCR法和测序法鉴定是否完成了抗性标记基因的剔除，经过确认的无标记Ipp基因突变菌株采用终浓度13%甘油于-20°C保藏，得mrcB和Ipp双基因敲除的出发菌株；
(2)将所得的和Ipp双基因敲除的出发菌株划LB平板37°C左右活化，转接入LB液体培养基37°C左右制备化学感受态细胞，后导入敲除辅助质粒pKD46，再将得到的菌液涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板，于30°C条件下筛选含质粒pKD46的单菌落重组子，使用酶切法鉴定该重组子是否含PKD46质粒，含pKD46质粒的菌种即为含pKD46的Ipp基因突变的分泌型菌株；
(3)所得含pKD46的单基因突变菌株于30°C条件下制备电转化感受态细胞，再将其通过IOmmol L-阿拉伯糖诱导2小时，后将纯化后高浓度的特定打靶片段导入其中，纯化后高浓度的特定打靶片段的制备方法同实施例1，再将其经过在含5 mmol L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时左右后，使用抗性平板37°C筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法鉴定基因区域发生了替换突变，确认后的突变菌种发生了两次同源重组，即为和Ipp双基因突变的分泌型菌株；
B、重组蛋白发酵
将合成的人甲状旁腺激素hPTH基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pET32a-/7iA仏转化到和Ipp双基因突变的分泌型菌株得到分泌型重组菌株，即产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株。先使用含50μ8/πι1的Amp的LB平板活化该工程菌株，22小时后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，37°C 200转摇床培养18小时，再将该菌液接种到带有30ml含50μδ/πι1的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O.I左右，200转摇床培养8小时后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4小时后终止发酵，即得，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。经检测，超过50%的重组蛋白渗漏到培
养基中。 实施例3
一种重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，包括以下步骤
k.pal和双基因突变的分泌型菌株的构建包括以下步骤
a、构建基因突变的分泌型菌株
(1)使用预先设计的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp的基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR 产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2小时，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的/^7基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物PalTl和palT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变的分泌型菌株；
b、构建和《TM双基因突变的分泌型菌株
(1)用所得/^7基因突变菌株制备化学感受态细胞，后将其导入质粒pCP20，再涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板于30°C条件下筛选出含质粒pCP20的单菌落重组子，再转接入LB液体培养基在39°C条件下培养15小时，之后将所得菌液进行稀释涂布，得到的单菌落再分别转入LB抗性平板进行标记抗性测试，并用PCR法和测序法鉴定是否完成了抗性标记基因的剔除，经过确认的无标记/^7基因突变菌株采用终浓度13%甘油于-20°C保藏，得pal和双基因敲除的出发菌株；
(2)将所得的^mrcB双基因敲除的出发菌株划LB平板37°C左右活化，转接入LB液体培养基37°C左右制备化学感受态细胞，后导入敲除辅助质粒pKD46，再将得到的菌液涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板，于30°C条件下筛选含质粒pKD46的单菌落重组子，使用酶切法鉴定该重组子是否含PKD46质粒，含pKD46质粒的菌种即为含pKD46的基因突变的分泌型菌株；
(3)所得含pKD46的单基因突变菌株于30°C条件下制备电转化感受态细胞，再将其通过IOmmol L-阿拉伯糖诱导2小时，后将纯化后高浓度的特定打靶片段导入其中，纯化后高浓度的特定打靶片段的制备方法同实施例1，再将其经过在含5 mmol L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时左右后，使用抗性平板37°C筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法鉴定基因区域发生了替换突变，确认后的突变菌种发生了两次同源重组，即为^mrcB基因突变的分泌型菌株；
B、重组蛋白发酵
将合成的B淋巴细胞刺激因子BLyS基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pET32a-67_^s，转化到^mrcB双基因突变的分泌型菌株得到分泌型重组菌株，即产B淋巴细胞刺激因子的分泌型重组菌株。先使用含5(^g/ml的Amp的LB平板活化该工程菌株，22小时后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，37°C 200转摇床培养18小时，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8小时后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4小时后终止发酵，即得，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。经检测，超过50%的重组蛋白渗漏到培养基中。 实施例4
一种重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，包括以下步骤
k,mrcB和Ipp双基因突变的分泌型菌株的构建包括以下步骤
a、构建T/7/7基因突变的分泌型菌株 (1)使用预先设计的7卻基因敲除引物IppH+PF和IppH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp的Ipp基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2小时，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物IppTl和1ρρΤ2进行PCR法和测序法确定Ipp基因区域发生替换突变后，即得Ipp基因突变的分泌型菌株；
b、构建《TM和Ipp双基因突变的分泌型菌株
(1)用所得T/7/7基因突变菌株制备化学感受态细胞，后将其导入质粒PCP20，再涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板于30°C条件下筛选出含质粒pCP20的单菌落重组子，再转接入LB液体培养基在39°C条件下培养15小时，之后将所得菌液进行稀释涂布，得到的单菌落再分别转入LB抗性平板进行标记抗性测试，并用PCR法和测序法鉴定是否完成了抗性标记基因的剔除，经过确认的无标记Ipp基因突变菌株采用终浓度13%甘油于-20°C保藏，得mrcB和Ipp双基因敲除的出发菌株；
(2)将所得的和Ipp双基因敲除的出发菌株划LB平板37°C左右活化，转接入LB液体培养基37°C左右制备化学感受态细胞，后导入敲除辅助质粒pKD46，再将得到的菌液涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板，于30°C条件下筛选含质粒pKD46的单菌落重组子，使用酶切法鉴定该重组子是否含PKD46质粒，含pKD46质粒的菌种即为含pKD46的Ipp基因突变的分泌型菌株；
(3)所得含pKD46的单基因突变菌株于30°C条件下制备电转化感受态细胞，再将其通过IOmmol L-阿拉伯糖诱导2小时，后将纯化后高浓度的特定打靶片段导入其中，纯化后高浓度的特定打靶片段的制备方法同实施例1，再将其经过在含5 mmol L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时左右后，使用抗性平板37°C筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法鉴定基因区域发生了替换突变，确认后的突变菌种发生了两次同源重组，即为和Ipp双基因突变的分泌型菌株；
B、重组蛋白发酵将合成的B淋巴细胞刺激因子BLyS基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pET32a47jGs，转化到和Ipp双基因突变的分泌型菌株得到分泌型重组菌株，即产B淋巴细胞刺激因子的分泌型重组菌株。先使用含5(^g/ml的Amp的LB平板活化该工程菌株，22小时后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，37°C 200转摇床培养18小时，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8小时后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4小时后终止发酵，即得，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。经检测，超过50%的重组蛋白渗漏到培养基中。实施例5
一种重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，包括以下步骤
Lpal和双基因突变的分泌型菌株的构建包括以下步骤 a、构建基因突变的分泌型菌株
(1)使用预先设计的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp的基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2小时，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的/^7基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物PalTl和palT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变的分泌型菌株；
b、构建和《TM双基因突变的分泌型菌株
(1)用所得/^7基因突变菌株制备化学感受态细胞，后将其导入质粒pCP20，再涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板于30°C条件下筛选出含质粒pCP20的单菌落重组子，再转接入LB液体培养基在39°C条件下培养15小时，之后将所得菌液进行稀释涂布，得到的单菌落再分别转入LB抗性平板进行标记抗性测试，并用PCR法和测序法鉴定是否完成了抗性标记基因的剔除，经过确认的无标记/^7基因突变菌株采用终浓度13%甘油于-20°C保藏，得pal和双基因敲除的出发菌株；
(2)将所得的^mrcB双基因敲除的出发菌株划LB平板37°C左右活化，转接入LB液体培养基37°C左右制备化学感受态细胞，后导入敲除辅助质粒pKD46，再将得到的菌液涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板，于30°C条件下筛选含质粒pKD46的单菌落重组子，使用酶切法鉴定该重组子是否含PKD46质粒，含pKD46质粒的菌种即为含pKD46的基因突变的分泌型菌株；
(3)所得含pKD46的单基因突变菌株于30°C条件下制备电转化感受态细胞，再将其通过IOmmol L-阿拉伯糖诱导2小时，后将纯化后高浓度的特定打靶片段导入其中，纯化后高浓度的特定打靶片段的制备方法同实施例1，再将其经过在含5 mmol L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时左右后，使用抗性平板37°C筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法鉴定fflrM基因区域发生了替换突变，确认后的突变菌种发生了两次同源重组，即为^mrcB双基因突变的分泌型菌株；
B、重组蛋白发酵
将合成的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因SvOM片断，经测序正确后将其克隆到表达质粒pET32a(+)中，得到分泌型质粒ρΕΤ32&-·5 ^Β，转化宿主菌/7a7和双基因突变的分泌型菌株。即得产咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的分泌型重组菌株。先使用含5(^g/ml的Amp的LB平板活化该工程菌株，22小时后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，37°C 200转摇床培养18小时，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8小时后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4小时后终止发酵，即得，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。经检测，超过50%的重组蛋白渗漏到培养基中。
实施例6
一种重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，包括以下步骤
k,mrcB和Ipp双基因突变的分泌型菌株的构建包括以下步骤
a、构建T/7/7基因突变的分泌型菌株
(1)使用预先设计的7卻基因敲除引物IppH+PF和IppH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp的Ipp基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2小时，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物IppTl和1ρρΤ2进行PCR法和测序法确定Ipp基因区域发生替换突变后，即得Ipp基因突变的分泌型菌株；
b、构建《TM和Ipp双基因突变的分泌型菌株
(1)用所得Ipp基因突变菌株制备化学感受态细胞，后将其导入质粒PCP20，再涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板于30°C条件下筛选出含质粒pCP20的单菌落重组子，再转接入LB液体培养基在39°C条件下培养15小时，之后将所得菌液进行稀释涂布，得到的单菌落再分别转入LB抗性平板进行标记抗性测试，并用PCR法和测序法鉴定是否完成了抗性标记基因的剔除，经过确认的无标记Ipp基因突变菌株采用终浓度13%甘油于-20°C保藏，得mrcB和Ipp双基因敲除的出发菌株；
(2)将所得的和Ipp双基因敲除的出发菌株划LB平板37°C左右活化，转接入LB液体培养基37°C左右制备化学感受态细胞，后导入敲除辅助质粒pKD46，再将得到的菌液涂布于含5(^g/ml的Amp的抗性平板，于30°C条件下筛选含质粒pKD46的单菌落重组子，使用酶切法鉴定该重组子是否含PKD46质粒，含pKD46质粒的菌种即为含pKD46的Ipp基因突变的分泌型菌株；
(3)所得含pKD46的单基因突变菌株于30°C条件下制备电转化感受态细胞，再将其通过IOmrnol L-阿拉伯糖诱导2小时，后将纯化后高浓度的特定打靶片段导入其中，纯化后高浓度的特定打靶片段的制备方法同实施例1，再将其经过在含5 mmol L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2小时左右后，使用抗性平板37°C筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法鉴定基因区域发生了替换突变，确认后的突变菌种发生了两次同源重组，即为和Ipp双基因突变的分泌型菌株；
B、重组蛋白发酵
将合成的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因SvOM片断，经测序正确后将其克隆到表达质粒pET32a (+)中，得到分泌型质粒pETSZa-sra ，转化宿主菌和Ipp双基因突变的分泌型菌株。即得产咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的分泌型重组菌株。先使用含5(^g/ml的Amp的LB平板活化该工程菌株，22小时后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，37°C 200转摇床培养18小时，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8小时后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4小时后终止发酵，即得，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。经检测，超过50%的重组蛋白 渗漏到培养基中。序列表
mrcB, mrcA, Ipp ,pal基因敲除引物
mrcBH+PF agaacagaaaatcgggcttttgcgcctgaatattgcggagaaaaagcatgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCmrcBH+PF ctcgccatccggtatttcacgcttagatgttaattactaccaaacatatcATGGGAATTAGCCATGGTCCIppH+PF acttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCIppH+PR gtgcgccatttttcacttcacaggtactattacttgcggtatttagtagcATGGGAATTAGCCATGGTCCpalH+PF gccgtatctgtgataataattaattgaatagtaaaggaatcattgaaatgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCpalH+PR tgtctgaagttactgctcatgcaattctcttagtaaaccagtaccgcacgATGGGAATTAGCCATGGTCCrodZH+PF gatggttcaccggcatctcaattctcatttaaacgtacctgcagcgaatgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCrodZH+PR catgaaaaatctcccgcgttacccgtctgttactgcgccggtgattgttcATGGGAATTAGCCATGGTCCmrdAH+PF cttatcaccgtgagtgataagggagctttgagtagaaaacgcagcggatgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCmrdAH+PR tgtttttttattcggattatccgtcatgattaatggtcctccgctgcggcATGGGAATTAGCCATGGTCCmrcAH+PF gcgtttgtttataaactgcccaaatgaaactaaatgggaaatttccagtgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCmrcAH+PR actgaaaaggcgccgaagcgcctttttaatcagaacaattcctgtgcctcATGGGAATTAGCCATGGTCCrodAH+PF ctgcctgcggaaaatccagcggttgccgcagcggaggaccattaatcatgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCrodAH+PR cgagccactgcttacgcattgcgcacctcttacacgcttttcgacaacatATGGGAATTAGCCATGGTCCmurCH+PF cgatgccttttgcatcgtatgaatttaagaagttaatggcgtaaagaatgGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCmurCH+PR aggtcccacccaacaggaccgcgattttatcagtcatgttgttcttcctcATGGGAATTAGCCATGGTCC
(注小写字母代表特异基因的同源序列) mrcAf mrcB，pal，Ipp基因鉴定引物
mrcBTl ITCGAGCACAAATTTTGAGAG mrcBT2 CAACCAGATGAAAAGAAAGG IppTI CAGCGTTCGATGCTTCTTT lppT2 GTTTCGGTGAGCAGTGGAG pIlTI GTGCGCCACAACGTATTAC pIlT2 AAGTTGTTGCTGGAGTTGG redZTl TAAAGCGGTCTGATAGCCA redZT2 GCCTTGATTTGATTGACCG mrdATl CAAGAATGCGGACATCAAG mrdAT2 CCATCAGTGGTACGGCTATT mrcATl CTGCCCAAATGAAACTAAATG mrcAT2 |tTGCTGGAAGACCCTGACT
权利要求
1.一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因取mrcB，imrcB琳Ipp的双敲除基因或其他基因组合的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10 250 bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的浓度为I 1000 ng/μ 的热mrcB,或mrcB热Ipp的双敲除基因或其它基因组合的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株；所述的其他基因组合指的是mrcA, mrdA, rodA, murC, rodZ中任意两个的组合。
2.根据权利要求I所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株含有的基因/^7和基因 编码区发生了突变，或者基因和基因的启动子区域发生了突变，从而使基因和基因无法表达出相应Pal和MrcB蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal和MrcB蛋白产物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。
3.根据权利要求I所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于 所述的双基因突变大肠杆菌的应用包括外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建、分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程； 所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建方法为将外源目标蛋白质基因先重组到分泌型质粒pET32a(+)中，随后克隆到所述的双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株中，进而得到外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株。
4.根据权利要求3所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株含有编码外源蛋白的重组基因质粒，该重组质粒中外源蛋白基因与定位于周质空间的信号肽编码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信号肽导入于周质空间进而渗漏到培养基中。
5.根据权利要求3所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程指的是在发酵培养基中使用外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株生产外源蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于所述的发酵培养基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5% 甘油，O. 02 O. 5% KH2PO4,0. I 2% K2HPO4。
全文摘要
本发明公开了一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10～250bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株。本发明提高重组外源蛋白的表达，降低目标蛋白的胞内降解；减少重组外源蛋白的胞内积累，消除了包涵体的形成；取消了细胞破壁工艺，降低了热原，简化了分离纯化；进而达到降低生产成本，提高蛋白表达和产品质量的目的。
文档编号C12N15/70GK102827860SQ201210286769
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者童望宇, 陈昭元, 谢丽 申请人:安徽大学