专利名称：一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种探针及其设计方法，尤其是一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法。
背景技术：
氯离子是细胞内最重要阴离子。在神经系统，神经元内外氯离子浓度保持相对平衡状态，是维持神经元和局部环路形态和机能稳定的内环境基础。一旦氯离子失去平衡，将直接导致神经系统疾病产生。目前已经发现，氯离子失衡可导致是包括帕金森病、癫痫、缺血缺氧、阿尔茨海默病、脑震荡、神经病理性痛、脊髓损伤、糖尿病性神经病、精神分裂症和小脑共济失调等多种神经系统疾病的重要因素。氯离子是由细胞膜上的氯离子转运体负责运入或者运出细胞。目前为止共克隆得到8个氯离子转运体蛋白分子:包括2个NKCC蛋白、
4个KCC蛋白、I个NCC蛋白以及I个CIP蛋白。KCC2是神经系统内最重要的升高神经元内氯离子浓度的蛋白。KCC2全名为 钠离子钾离子浓度梯度驱动的氯离子内向转运体。KCC2的工作原理是:按1:1: 2的比例将I个钠离子和I个钾离子转运出胞体，而同时将2个氯离子转运入胞体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法。本发明的目的是通过以下技术方案来解决的:一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为:5' tt ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctgggattttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttcaggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggcaagaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcggagttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtgtttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatgtgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgggcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaaccagatgtgaattggggttc gtcaac3J 。所述探针的设计方法，按照如下步骤:(I)根据KCC2的Gene bank序列我们设计了 KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列；(2)构建KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备KCC2的cRNA原位杂交探针；(4)检测KCC2的cRNA探针的原位杂交。
所述步骤⑴中KCC2特异的引物是:上游引物是5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ；下游引物是5’GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。所述步骤(2)按照如下步骤进行:(a)将小鼠的cDNA用设计的弓丨物进行PCR扩增；(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接;(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。所述步骤(3)按照如下步骤进行:(a)步骤(2)的到的细菌测序正确后，经判断确认KCC2探针序列插入载体的顺序是反向的；(b)需要使用Xba I限制性内切酶对质粒进行酶切；(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。所述步骤(4)按照如下步`骤进行:(a)将小鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；(b)取材后进行脑组织的后固定:于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时；(c)将固定好的组织进行切片:将组织切成25 30 μ m组织切片，并将切好的切片保存与DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用；(d)将切好的组织片用DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5分钟；(e)将上述清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，每次5分钟；(f)将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育I小时；(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时；(h)杂交后用IxSSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟；⑴用2xSSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10分钟；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37°C , I 次，每次 3O 分钟；(k)用2xSSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；(I)用PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；(m)按1:2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Ant1-Digoxigenin -AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜；(η)将经过上步抗体孵育的组织片进行PBS的洗涤，于室温，清洗3次，每次10分钟；(ο)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15分钟；(P)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4飞小时，在此过程中观察切片呈色强度；(q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10分钟；
(r)将上述洗漆后切片表于载玻片上；(s)晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片，以备观察。本发明的有益效果是:本发明对活体动物建立模型后进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中KCC2基因的mRNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中KCC2基因mRNA水平的变化。本发明使用的KCC2的探针序列，对KCC2基因的显示有明确的特异性，实现了对KCC2基因mRNA水平的显示作用。
图1-A为脑部切片的40倍放大特异效果图；图1-B为脑部切片的400倍放大特异效果图。
具体实施例方式下面对本发明做进一步详细描述:KCC2基因cRNA原位杂交的探针的设计方法，按照如下步骤:(I)根据KCC 2的Gene bank序列我们设计了 KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列；(2)构建KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备KCC2的cRNA原位杂交探针；(4)检测KCC2的cRNA探针的原位杂交。探针的设计:根据KCC2的Gene bank序列我们设计了 KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列。KCC2特异的引物如下:上游引物是5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ；下游引物是5’GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。KCC2特异的探针序列:5' tt ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctgggattttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttcaggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggcaagaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcggagttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtgtttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatgtgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgggcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaaccagatgtgaattggggttc gtcaac 3’ 。KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒的构建:1.将小鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增。2.将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收。
3.将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接。4.将连接好的质粒转化细菌后，摇菌培养送金斯瑞公司进行测序。KCC2的cRNA原位杂交探针的制备:1.测序正确后，经判断确认KCC2探针序列插入载体的顺序是反向的。2.需要使用Xba I限制性内切酶对质粒进行酶切，3.将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收。4.用T7 RNA聚合酶对探针进行体外转录标记，体外转录的试剂盒(AmbionMEGAscript)是Ambion公司的产品。KCC2的cRNA探针的原位杂交检测:将小鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。取材后进行脑组织的后固定:于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时。将固定好的组织进行切片:将组织切成25 30 μ m组织切片，并将切好的切片保存与DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用。将切好的组织片用DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5分钟。1.将上述清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，每次5分钟。
2.将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育I小时。3.将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时。4.杂交后用IxSSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟。5.用2xSSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10分钟。6.用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37°C，I 次，每次 30 分钟。7.用2xSSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟。8.用PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟。9.按1:2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Ant1-Digoxigenin -AP抗体,对洗涤后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜。10.将经过上步抗体孵育的组织片进行PBS的洗涤，于室温，清洗3次，每次10分钟。11.用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15分钟。12.将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4飞小时，在此过程中观察切片
呈色强度。13.当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10分钟。14.将上述洗涤后切片表于载玻片上。15.晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片，以备观察。参见图1-A和图1-B，图中显示本发明的特异性效果。图中所示组织切片为对小鼠脑进行灌注、取材、切片后，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中KCC2基因的mRNA发生特异性的结合，探针标记后的KCC2基因的mRNA显示为蓝色斑点。为了更好地观察结果，切片中所有神经元(即神经系统细胞)均被衬染为棕色。图1-A为脑部切片的40倍放大。可见，脑内(具体是黑质部分)所有神经元上均可见蓝色颗粒，即可见探针标记的KCC2基因的mRNA。图1-A中的黑框部位再继续放大，显示为图1_B ;图1-B是脑部切片的400倍放大。图1-B可见，星号即为棕色衬染的神经元，黑色箭头所指即为探针标记的KCC2基因的mRNA。由以上图1-A和1-B的染色结果可以发现，本发明所采用的探针能够实现方便、准确地观察到组织中KCC2基因mRNA水平。本发明使用的KCC2的探针序列，对KCC2基因的显示有明确的特异性，实现了对KCC2基因mRNA水平的显示作用。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例 揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为: 5’ 11 ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctgggattttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttcaggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggcaagaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcggagttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtgtttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatgtgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgggcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaaccagatgtgaattggggttc gtcaac 3’ 。
2.如权利要求1所述探针的设计方法，其特征在于: (1)根据KCC2的Genebank序列设计KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列； (2)构建KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序； (3)制备KCC2的cRNA原位杂交探针； (4)检测KCC2的cRNA探针的原位杂交。
3.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(I)中KCC2特异的引物是:上游引物是 5’CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3’ ； 下游引物是 5，GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3’。
4.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(2)按照如下步骤进行: (a)将小鼠的cDNA用KCC2特异的引物进行PCR扩增； (b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； (c)将回收后的产物于4°C与多克隆位点两端具有T7、SP6启动子的载体进行连接； (d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。
5.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)按照如下步骤进行: (a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认KCC2探针序列插入载体的顺序是反向的； (b)需要使用XbaI限制性内切酶对质粒进行酶切； (c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； (d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。
6.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(4)按照如下步骤进行: (a)将小鼠用0.4%戍巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉,用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0.0lmol/L DEPC-PBS是2.9克磷酸氢二钠,0.29克磷酸二氢钠,9.0克氯化钠用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为0.1%的DEPClml过夜放 置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至IOOOml ;所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠，2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml ；(b)取材后进行脑组织的后固定:于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小时； (c)将固定好的组织进行切片:将组织切成25 30μπι组织切片，并将切好的切片保存与0.0lmol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱备用； (d)将切好的组织片用0.0lmol/L的DEPC-PBS清洗I次，室温，每次5_10分钟； (e)将上述清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，每次5-10分钟；所述5x SSC是由.20x SSC用超纯水稀释的，20x SSC为一种缓冲液； (f)将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55°C，在杂交炉孵育1-2小时；所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺,2.5ml的20x SSC溶液,200 μ I的50x DenhardtJ s溶液，50 μ I的浓度为200mg/ml的Heperine溶液，100 μ I的浓度为10mg/ml的tRNA溶液，.100 μ I的浓度为10%的CHAPS溶液，100 μ I的浓度为10%的Tween-20溶液，100 μ I的浓度为0.5mol/L的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H2O混合配置而成； (g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55°C，在杂交炉中孵育16-20小时；所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为1.0ug/ml的cRNA探针配置成的； (h)杂交后用IxSSC洗涤杂交的组织切片，37°C，2次，每次10分钟； (i)用2xSSC洗涤上述的组织切片，37°C，2次，每次10-15分钟；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 处理，37°C，I 次，每次 30-40 分钟； (k)用2x SSC洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟； (I)用0.01mol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，I次，每次10分钟；所述0.01mol/LPBS是2.9克磷酸氢二钠，0.29克磷酸二氢钠，9.0克氯化钠用超纯水定容至IL配置的磷酸缓冲液； (m)按1:2000的抗体效价,在PBS溶液中加入Ant1-Digoxigenin - AP抗体,对洗漆后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜； (η)将经过上步抗体孵育的组织片进行PBS的洗涤，于室温，清洗3次，每次10-15分钟； (ο)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15-20分钟；所述TS9.5为是由终浓度为摩尔浓度为0.lmol/LTris-HCl、PH9.5，摩尔浓度为0.lmol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/L MgCL2用超纯水配制而成； (P)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4飞小时，在此过程中观察切片呈色强度；所述NBT-BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液； (q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10-15分钟； (r)将上述洗涤后切片表于载玻片上； (s)晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片，以备观察。
全文摘要
本发明公开了一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法，本发明通过对动物建立模型后进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中KCC2基因的mRNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中KCC2基因mRNA水平的变化。本发明使用的KCC2的探针序列，对KCC2基因的显示有明确的特异性，实现了对KCC2基因mRNA水平的显示作用。
文档编号C12N15/11GK103074331SQ20121033266
公开日2013年5月1日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者杨雁灵, 王亚云, 魏燕燕, 郭保霖, 隋秉东, 郑晨曦, 李云庆 申请人:中国人民解放军第四军医大学