专利名称：6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
6-氰基_(3R, 5R)- 二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法技术领域
本发明属于生物制药和绿色化学领域，具体涉及一种6-氰基-(3R，5R) - 二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
背景技术：
降胆固醇的他汀类药物是目前世界最畅销的药物大类。2010年世界最畅销药物——辉瑞公司的立普妥(商品名称Lipitor，年销售额119亿美元)有效活性成分为阿托伐他汀(atorvastatin) (Nature 2012, 485:185-194),而 6_ 氰基-(3R，5R)_ 二轻基己酸叔丁酯则是用于合成此类降胆固醇他汀类药物的关键手性中间体。目前可以通过化学法或酶法制备6-氰基-(3R, 5R) - 二轻基己酸叔丁酯(Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44:362-365 )。
美国专利US 2009/0216029 Al中公开了一种化学法工艺生产6_氰基-(3R，5R)- 二羟基己酸叔丁酯，具体是利用硼烷类化合物在-70摄氏度以下的条件下将 6_氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯还原。该工艺需要极端反应条件，易燃，能耗严重并且产品的立体异构纯度只能达到98%。
美国的科德克希思公司开发的合成路线则是利用源于酿酒酵母(Saccharomyce s cerevisiae)的基因工程改造的酮还原酶(ketone reductase, KRED)催化从6_氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基_(3R，5R)- 二羟基己酸叔丁酯的还原反应， 同时利用一种葡萄糖脱氢酶完成辅酶(NADPH)的再生反应。通过该工艺路线可以获得立体异构纯的6-氰基-(3R，5R)_ 二羟基己酸叔丁酯(de值大于99%) (W0 2008/042876 A2)， 但是该工艺需要两种酶联合作用才能完成辅酶循环，从而造成生产成本升高。同时反应中产生的葡萄糖酸会改变反应体系的PH值，需要通过补加碱溶液加以调控，增加了反应条件控制的难度，另溶解在反应体系中的副产物葡萄糖酸也大大增加了后处理工艺的难度。
本专利公开了一种利用重组酮还原酶(ketone reductase, KRED)催化从6_氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基-(3R，5R)_ 二羟基己酸叔丁酯的还原反应。只需要一种酶即可同时完成底物还原和辅酶再生循环，大大降低了生产成本。且反应条件温和，常温、常压、水相条件下即可进行，无需使用危险试剂。反应中产生的副产物丙酮易挥发，很容易从反应体系中除去，大大简化了后处理工作。发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的6-氰基_(3R，5R)- 二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案一种6-氰基_(3R，5R)- 二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成6-氰基-(3R，5R) - 二羟基己酸叔丁酯，其特征在于所述的生物催化剂为重组酮下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。还原酶，所述的重组酮还原酶的制备方法为将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35lO°C下摇床活化8 12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35lO°C下摇床扩大培养，培养至OD6tltl值达到O. 6^0. 8时，加入诱导剂，于25 33°C下继续培养8 12小时，离心， 收集沉淀物，加入磷酸缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8 12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-1(T-25°C，然后再冻干2Γ48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/ NADPH,所述的氢供体为异丙醇,所述的还原反应在pH为6. 5^7. 5的水相缓冲液中进行。
在反应起始时的反应体系中，重组酮还原酶与6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为1飞％，辅因子与6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为O. Γ0. 5%，所述的异丙醇相对所述的6-氰基_(5R)_羟基-3-氧代己酸叔丁酯的物质的量百分比为100 150%。。
所述的诱导剂为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
所述的辅因子为NADP/NADPH。
所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液。
所述的还原反应在pH为7. 5的水相缓冲液中进行。
所述的制备方法的实施过程如下在反应容器中依次加入底物6-氰基-(5R)-轻基-3-氧代己酸叔丁酯，异丙醇，所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入重组酮还原酶和辅因子，在25 35°C下，搅拌反应，利用LC-MS检测反应进程，待转化率达9(Γ99%时，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得6-氰基_(3R，5R)- 二羟基己酸叔丁酷广品。
根据本发明，除重组酮还原酶外，其余原料均可商购获得。
本发明的有益效果在于本发明方法只需要一种重组酮还原酶即可同时完成底物还原和辅酶再生循环，大大降低了生产成本，且反应条件温和，常温、常压、水相条件下即可进行，无需使用危险试剂。反应中产生的副产物丙酮易挥发，很容易从反应体系中除去，大大简化了后处理工作。
附图I为转化率随反应时间变化图。
具体实施例方式本发明的反应式如下
权利要求
1.一种6-氰基-(3R，5R) - 二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成6-氰基_(3R，5R)- 二羟基己酸叔丁酯，其特征在于所述的生物催化剂为重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶的制备方法为将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35 40°C下摇床活化8 12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35lO°C下摇床扩大培养，培养至OD6tltl值达到O. 6^0. 8时，加入诱导剂，于25 33°C下继续培养8 12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8 12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-1(T-25°C，然后再冻干2Γ48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶，所述的重组酮还原酶能将异丙醇转化为丙酮，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH,所述的氢供体为异丙醇,所述的还原反应在pH为6. 5^7. 5的水相缓冲液中进行。
2.根据权利要求I所述的6-氰基-(3R，5R)- 二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于在反应起始时的反应体系中，重组酮还原酶与6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为1飞％，辅因子与6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量百分比为O. Γ0. 5%，所述的异丙醇相对所述的6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的物质的量百分比为100 150%。
3.根据权利要求I所述的6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于所述的诱导剂为异丙基_β -D-硫代半乳糖苷。
4.根据权利要求I所述的6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于所述的辅因子为NADP/NADPH。
5.根据权利要求I所述的6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求I所述的6-氰基_(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于所述的还原反应在pH为7. 5的水相缓冲液中进行。
7.根据权利要求I或2所述的6-氰基_(3R，5R)_二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于所述的制备方法的实施过程如下在反应容器中依次加入底物6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，异丙醇，所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入重组酮还原酶和辅因子，在25 35°C下，搅拌反应，利用LC-MS检测反应进程，待转化率达9(Γ99%时，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得6-氰基-(3R，5R) - 二羟基己酸叔丁酯产品。
全文摘要
一种6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和氢供体的存在下发生还原反应生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，所述的生物催化剂为重组酮还原酶，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氢供体为异丙醇，所述的还原反应在pH为6.5~7.5的水相缓冲液中进行。本发明方法只需要一种重组酮还原酶即可同时完成底物还原和辅酶再生循环，大大降低了生产成本，且反应条件温和，常温、常压、水相条件下即可进行，无需使用危险试剂。反应中产生的副产物丙酮易挥发，很容易从反应体系中除去，大大简化了后处理工作。
文档编号C12R1/19GK102978249SQ201210466628
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者鞠鑫, 乐庸堂 申请人:苏州汉酶生物技术有限公司