专利名称：一种漆酶基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
一种漆酶基因及其编码的蛋白和应用技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种漆酶基因及其编码的蛋白和应用。
背景技术：
三苯甲烷类染料是一种多苯环化合物，使用面较广，用量也较大，其产量被列为第三大主要染料。其中某些染料及中间降解产物具有“三致”作用。且这类染料中的一部分难以降解，常常导致常规的生物处理系统处理效果不够理想。行之有效的染料废水处理方法和技术是改善生态环境、保证食品安全和维护人类健康的重要保证。生物法即通过筛选或构建具有高效性能的特定微生物菌株用于染料废水的脱色，是一种经济、有效且适于大规模废水处理的技术。
生物方法对染料的脱色主要通过降解和生物吸附两方面发挥作用，降解是由微生物分泌胞外氧化酶-木质素降解酶系统进行脱色，包括漆酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶等；而吸附主要是通过菌体的自身结构与染料等大分子物质相契合所致。因此，对用于染料的生物脱色方法通常以微生物和酶为载体进行研究。
目前研究发现的染料脱色酶主要有漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)，它们对底物的降解具有广谱性，对染料的脱色及降解效果明显，具有很好的应用前景。漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，广泛存在于自然界中，主要包括植物漆酶和真菌漆酶，蛋白质数据库和细菌基因组序列分析的结果证明漆酶也广泛存在于细菌中。 漆酶作为一种生物制剂，具有高效、专一、作用条件温和等特点，在纸浆生物漂白、染料的脱色及其废水净化、污染物质脱毒与降解等方面有着巨大的应用潜力。而且，在还原介质的存在下，可进一步的扩大漆酶的底物范围。采用漆酶直接对染料进行脱色降解，以及利用漆酶介体系统，漆酶染料中间体和固定化漆酶对染料降解的研究已引起了国内的脱色降解效果。然而，大量关于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌门 (Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)及半知菌类(Imperfect fungi)等真菌，其中最 主要的是担子菌门中的白腐真菌。但是真菌较细菌生长缓慢、发酵周期长、生长温度和PH 范围狭窄等特性，必然导致真菌在产酶数量、酶学性质等多方面体现出劣势。细菌漆酶比真菌漆酶有更多的优点，如存在Cu2+抗性、不需糖基化、热稳定性好及酶活性的最适pH值范围广等。因此，细菌漆酶的研究对漆酶应用的环境条件和领域的扩展具有十分重要的意义。 而目前关于细菌漆酶的研究很少，更多具有高效脱色能力细菌漆酶及其基因有待于进一步发掘和研究。发明内容
本发明的目的是针对现有技术的现有缺陷，提供一种漆酶基因及其克隆方法。
本发明的另一目的是提供该漆酶基因生产重组漆酶的方法。
本发明的又一目的是提供该漆酶基因的应用
本发明的目的可通过如下技术方案实现
一种漆酶基因fmb_L103，其开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述的漆酶基因fmb-L103编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所/Jn ο
本发明所述的漆酶基因fmb-L103的克隆方法，提取死亡谷芽孢杆菌 (BaciIlusvallismortis)fmb-103菌株基因组,根据Genebank数据库中已登录的芽孢杆菌漆酶基因No.⑶972592.1设计引物对F-1/R-1，从fmb_103菌株基因组中扩增获得SEQ ID NO.1所示的漆酶基因开放阅读框；其中所述的死亡谷芽孢杆菌fmb-103，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCC No. 6198 ;所述的引物对序列为F-1 SEQ ID NO. 3，R-1 SEQ ID NO. 4。
一种生产重组漆酶fmb_rL103的方法，包含以下步骤
(I)克隆权利要求1所述的漆酶基因；
(2)漆酶基因原核表达载体构建；
(3)重组漆酶在大肠杆菌中的表达。
其中，所述的克隆权利要求1所述的漆酶基因包含以下步骤(I)提取保藏号为 CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103的基因组DNA ；⑵以F-2和R-2为上、下游引物， fmb-103的基因组DNA为模板，PCR扩增漆酶基因；(3)回收纯化目标PCR产物；其中，所述的引物F-2序列为SEQ ID NO. 5，引物R-2序列为SEQ ID NO. 6。
所述的漆酶基因原核表达载体构建是将上一步纯化所得的目标PCR产物与原核表达载体pET-23a连接得到重组载体pET-23a-fmb-L103。
本发明所述的漆酶基因fmb_L103在三苯甲烷类染料脱色中的应用。
其中，所述的三苯甲烷类染料优选孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。
按照本发明所述的方法生产的重组漆酶fmb-rL103在三苯甲烷类染料脱色中的应用。
其中，所述的三苯甲烷类染料为孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。
有益效果
本发明人从已筛选到的具芽孢漆酶活性的死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis) fmb-103基因组中，克隆获得一种新型的原核漆酶基因fmb_L103,并实现了在大肠杆菌表达宿主菌BL21 (DE3)pLysS的异源高效表达。重组酶fmb_rL103可高效地催化三苯甲烷类染料孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝的降解。
图1重组fmb-103漆酶基因表达载体构建过程
图2重组fmb-103漆酶fmb_rL103对孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝的降解效果图
其中，CK.染料；A.漆酶+染料；B. ABTS+染料；C. 丁香醛+染料；D.乙酰丁香酮+ 染料；E. fmb-rL103+ABTS+ 染料；F. fmb_rL103+ 丁香醛 + 染料；G. fmb-rL103+ 乙酰丁香酮 + 染料。
生物材料保藏信息
死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCC No. 6198。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1:死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis) fmb-103漆酶基因的克隆
离心收集死亡谷芽抱杆菌(Bacillusvallismortis) fmb-103 菌体(CGMCC No. 6198)，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis) fmb-103 的基因组 DNA。
根据Genebank数据库中已登录的芽孢杆菌漆酶基因(No.⑶972592.1)设计两个引物
上游引物F-1 :5’-ATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3’ (SEQ ID NO. 3)；
下游引物R-1 :5，-TTATTTATGGGGATCAGTTATATC-3，(SEQ ID NO. 4)；
在50 μ I体系中，引物终浓度各为ΙμΜ，dNTPs终浓度为O. 2mM，fmb-103菌株基因组 DNA10ng，2U Pfu DNA 聚合酶。扩增程序为 94°C 3min ;30X (94°C 40s，53°C 50s， 72°C 90s) ；72°C IOmin0琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与 TaKaRapMD 19-simp Ie-T vector 连接，转化 Ε· coli DH5 α，涂 于含有 IPTG、X_gal、氨苄青霉素的LB平板，37°C培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序，用计算机软件DNAMAN分析测序结果，得到一个序列如SEQ ID NO.1 所示的长度为1542bp的ORFJP fmb-103漆酶基因(fmb_L103)，编码一个由514个氨基酸组成的蛋白质，序列如SEQ ID NO. 2所示。
实施例2 :死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103漆酶基因原核表达载体的构建(附图1)
根据获得的漆酶基因序列，设计两个引物，上游引物加上SacI识别序列，下游引物加上XhoI识别序列(下划线部分为限制酶识别序列)
上游引物F-2:5'-CGCGAGCTCATGACACTTGAAAMTTTGTGGATGC~3/ (SEQ ID NO. 5),
下游引物R_2:5' ~CCGCTCGAGTTATTTATGGGGATCAGTTATATC~3/ (SEQ ID NO. 6)，
按照下列PCR体系加入各成分，扩增LOX基因
10XF/y PCR buffer10 μ M上游引物 10 μ M下游引物 2. 5mM dNTPs fmb-103菌株基因组DNA ddH3010 μ I 10 μ I 10μ I 8μ I IOng up to 100 μ IPfu DNA聚合酶5U
PCR 程序为94°C 3min ；30X (94°C 40s ；53°C 50s ；72°C 90s) ；72°C IOmin0
用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加Sac1、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddH20重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET_23a连接，转化大肠杆菌DH5a。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。
实施例3 :死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb_103漆酶基因在大肠杆菌中的表达
将含有fmb_L103表达质粒pET-23a-fmb-L103转化大肠杆菌表达宿主菌株 BL21 (DE3)pLysS，在37°C培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30°C培养过夜，按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基，350C 180rpm振荡2_3小时至0D600约为O. 6时加IPTG (终浓度 100yg/ml)诱导。1. 5小时后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，获得重组死亡谷芽抱杆菌(Bacillus vallismortis)漆酶(fmb_rL103)的粗酶液。
漆酶活性测定采用2，2’ -连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)法稍作改动反应体系总体积3mL，包括2. 45mL O. 2mol/L pH 5. O柠檬酸-磷酸盐缓冲液、O. 5mL 6mmol/L ABTS及50 μ I用pH 5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液适当稀释的酶粗提液，45°C测定反应的前3min内反应液在420nm处吸光值OD的增加量，以灭活酶液做空白对照。将每分钟内生成I μ mol反应物所需的酶量定义为一个酶活力单位。漆酶酶活计算公式漆酶活力 (U)= V总 X AOD/(V mX ε X AtXl(Te) X 总酶酶液稀释倍数；其中，ε =3. 6 X 104mol/cm ； At 3min ；A0D 3min内吸光度OD的变化值；V@ :酶反应中，反应液的总体积;V酶:酶反应中，酶液的体积。实验重复3次，取平均值。
采用上述方法测得pET-23a-fmb_L103转化BL21 (DE3)pLysS后的工程菌，重组漆酶的产量为12000U/ml发酵液。
实施例4 :重组死亡谷芽抱杆菌(Bacillus vallismortis) fmb-103漆酶 (fmb-rL103)的分离纯化
采用NTA (镍柱，GE公司产品)亲和层析法对实例3中获得的fmb_rL103粗酶液进行分离纯化。样品中加5mM咪唑(终浓度)，增强吸附柱。
上样前，用20mM咪唑平衡层析柱。样品过三次柱材料，达到fmb_rL103与亲和柱材料充分结合的目的。
上样结束后，用IOOmM咪唑洗脱(分别用10个柱床体积)，收集洗脱液测酶活。上述纯化制备的重组漆酶fmb-rL103酶活为3. 6U/mg蛋白。
实施例5 :重组漆酶(fmb_rL103)对染料的降解
fmb-rL103对染料的脱色能力采用比色法测定。测染料降解前后在最大吸收波长处的吸光值，苯胺蓝、亮绿、孔雀石绿和靛蓝的最大吸收波长分别为585nm、627nm和617nm。 降解前后的吸光值分别为Ap A2，其脱色率用下述公式计算
脱色率(％) = (A1-A2) /A1X 100%利用芽孢漆酶催化染料脱色降解的反应体系总体积4mL,包括0. lmol/L的介体ABTS、丁香醒或乙酰丁香酮,0. 2mol/LpH6. O的醋酸-醋酸钠缓冲液，5U/mL fmb-rL103和50mg/L的染料(雀石绿、亮绿或苯胺蓝)，以不加酶为对照， 于37°C下静置反应48h。三种介体对脱色反应效果图如附图2所示，重组fmb-103漆酶 fmb-rL103分别在与3种介质(ABTS、丁香醛、乙酰丁香酮)共同作用下，对染料的脱色效率见表I。
表I
权利要求
1.一种漆酶基因fmb-L103，其特征在于其开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的漆酶基因编码的蛋白质，其特征在于氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.权利要求1所述的漆酶基因的克隆方法，其特征在于提取死亡谷芽孢杆菌(BaciIlusvallismortis)fmb-103菌株基因组,根据Genebank数据库中已登录的芽孢杆菌漆酶基因No.⑶972592.1设计引物对F-1/R-1，从fmb_103菌株基因组中扩增获得SEQ IDNO.1所示的漆酶基因开放阅读框；其中所述的死亡谷芽孢杆菌fmb-103，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年06月08日，保藏号为CGMCCNo. 6198 ;所述的引物对序列为F-1 SEQ ID NO. 3，R-1 SEQ ID NO. 4。
4.一种生产重组漆酶fmb-rL103的方法，其特征在于包含以下步骤 (1)克隆权利要求1所述的漆酶基因； (2)漆酶基因原核表达载体构建； (3)重组漆酶在大肠杆菌中的表达。
5.根据权利要求4所述的生产重组漆酶fmb-rL103的方法，其特征在于所述的克隆权利要求I所述的漆酶基因包含以下步骤⑴提取保藏号为CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢杆菌fmb-103的基因组DNA ；⑵以F-2和R-2为上、下游引物，fmb-103的基因组DNA为模板，PCR扩增漆酶基因；(3)回收纯化目标PCR产物；其中，所述的引物F-2序列为SEQ IDNO. 5，引物 R-2 序列为SEQ ID NO. 6。
6.根据权利要求4所述的生产重组漆酶fmb-rL103的方法，其特征在于所述的漆酶基因原核表达载体构建是将上一步纯化所得的目标PCR产物与原核表达载体pET-23a连接得到重组载体 pET-23a-fmb-L103。
7.权利要求1所述的漆酶基因在三苯甲烷类染料脱色中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的三苯甲烷类染料为孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。
9.按照权利要求4所述的方法生产的重组漆酶fmb-rL103在三苯甲烷类染料脱色中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的三苯甲烷类染料为孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种漆酶基因及其编码的蛋白和应用。一种漆酶基因fmb-L103，其开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的漆酶基因fmb-L103编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的漆酶基因fmb-L103在三苯甲烷类染料脱色中的应用。本发明人从已筛选到的具芽孢漆酶活性的死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)fmb-103基因组中，克隆获得一种新型的原核漆酶基因fmb-L103，并实现了在大肠杆菌表达宿主菌的异源高效表达。重组酶fmb-rL103可高效地催化三苯甲烷类染料孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝的降解。
文档编号C12N15/10GK102994524SQ201210466079
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者陆兆新, 张充, 吕凤霞, 别小妹 申请人:南京农业大学