专利名称：一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种以蕲蛇为原料提取II型胶原蛋白的方法。
背景技术：
II型胶原(collagen type II, C II )是软骨基质的主要有机成分,是关节软骨中主要细胞外间质之一。近年来研究表明，类风湿性关节炎的发病与C II自身免疫反应有关[Deyl Z, Miksik I, Eckhardt A.Preparative procedures and purity assessment ofcollagen proteins [J].Chromatography B, 2003, 79(12): 245-275.Smolen JS, HayerS, Schett G, et al.Tmmunosenescence autoimmunity and Rheumatoid Arthritis[J].Autoimmunity and rheumatoid arthritis, 2004, 31 (1): 23-25.],用 C II 免疫某些动物可诱导出实验性关节炎[Sweeney SE, Firestein GS.Rheumatoid arthritis:regulation of synovial inflammation [J].1ntern J Biochemical Cell Bio, 2004,36(3): 372-378.]，口服C II诱导免疫耐受对类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)有显著的疗效[卢延旭，陈敏珠.可溶性鸡II型胶原对关节炎大鼠的免疫治疗作用[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9 (2): 180-183.]。因此，C II的提取纯化与鉴定的研究具有较大的价值，获得纯化的C II是进行相关研究的关键。虽然C II在人体含量较多，但临床取材可获得的数量有限；C II与蛋白多糖形成紧密的结合，难以用单纯的化学方法提取。目前所报道的方法，操作复杂，条件不一，结果存在差别。
发明内容
本发明目的是提供一种以蕲蛇为原料提取II型胶原蛋白的方法。本发明采用的技术 方案是:一种以蕲蛇为原料提取II型胶原蛋白的方法，所述方法包括:(I)蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4 6°C搅拌24 30h，离心，去上清，沉淀用4(T60 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4 5M，Tris-HCl浓度为40 60 mM ；(2)步骤(I)所得沉淀用0.5^1 M乙酸水溶液重悬，以6(Γ80%甲酸水溶液调节pH值为2 3，加入足量胃蛋白酶，4 6°C搅拌48飞0h，离心，弃去沉淀；(3)步骤(2)得到上清液滴加5 6M NaCl溶液至NaCl浓度为0.8 0.9 M，4 6°C静置12 24h，离心，去除上清液；(4)步骤(3)得到沉淀用足量0.05、.2 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用2(T30 mM Na2HPO4充分透析，所得沉淀再用足量0.05、.2M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.05、.2M乙酸溶液充分透析，所得液体真空干燥，得到所述II型胶原蛋白的粉末。蕲蛇为蜂科动物五步蛇Agkistrodon acutus (Giienther)的干燥体。性味甘、咸，温；有毒。归经归肝经。功能主治祛风，通络，止痉。用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼歪斜，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风疥癣。临床发现，蕲蛇是临床治疗风湿痹证的要药，对RA有明显的治疗作用[国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部[M],北京:中国医药科技出版社，2010:349.]，实验研究表明蕲蛇及II型胶原蛋白对RA都具有一定的治疗作用[Kyung-Su Park, Min-Jung Park, M1-La Cho, et al.Type IIcollagen oral tolerance; mechanism and role in collagen-1nduced arthritis andrheumatoid arthritis [J].Modern Rheumatology, 2009，6 (19): 581-589.]。本发明选择蕲蛇为原料，用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析和透析处理等步骤，制备出高纯度(纯度96.93%)的II型胶原蛋白，采用SDS-PAGE、紫外全波长扫描、HPLC和质谱对其进行了纯度分析和鉴定。所述蕲蛇粉末粒径不大于2_。步骤(2 )中胃蛋白酶加入量为300 800 U/g蕲蛇粉末。步骤(I)中所述蕲蛇粉末与盐酸胍-Tris-HCl混合溶液用量之比为IOOg:1000 5000mL。步骤(2)中步骤(I)所得沉淀与乙酸水溶液用量之比为100g:100(T3000mL。具体的，所述方法如下:(I)蕲蛇粉碎至粒径为2mm，粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4°C搅拌24h，4°C、14000Xg离心lh，去上清，沉淀用50 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4M，Tris-HCl浓度为50 mM, pH7.5 ；(2)步骤(I)所得沉淀用0.5 M乙酸水溶液重悬，以70%甲酸水溶液调节pH值为2.8，加入胃蛋白酶，4°〇搅拌4811，41:、1400(^8离心111，弃去沉淀；所述胃蛋白酶加入量为300^800 U/g蕲蛇粉末；
(3)步骤(2)得到上清液滴加5M NaCl溶液至NaCl浓度为0.8 0.9 M，46°C静置12h，4°C、14000Xg离心lh，去除上清液；(4)步骤(3)得到沉淀用0.1 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20 mM Na2HPO4于4°C下充分透析，所得沉淀再用0.1M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.1M乙酸溶液于4°C下充分透析，所得液体真空干燥，得到所述II型胶原蛋白的粉末。本发明的有益效果主要体现在:本发明方法操作简单，制得II型胶原蛋白纯度高。
图1为本发明方法流程图；图2为靳蛇II型父原蛋白成品照片；图3为II型胶原蛋白质SDS-PAGE电泳图；图4为蕲蛇II型胶原蛋白HPLC分析图；图5为蕲蛇与牛II型胶原蛋白质紫外全波长扫波图谱；图6为蕲蛇与牛II型胶原蛋白质谱图；上图为蕲蛇II型胶原蛋白，下图为牛II型胶原蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:方法如下:1、将蕲蛇(购自黄山市蛇类科学研究所)粉碎成粒径2 mm的粉末；2、将150克蕲蛇粉末置于2000 mL的4 M盐酸胍-50 mM的Tris-HCl混合溶液(pH7.5)中混悬，温度控制在4°C，搅拌24 h ；4°C, 14000Xg离心I h，去上清液，沉淀用50mM的Tris-HCl溶液洗去盐酸胍，4°C，14000 X g离心I h，去上清液；3、上步得到的沉淀用20倍沉淀体积的0.5 M乙酸重悬，并用70%的甲酸调节pH至
2.8，向混悬液中加入5g胃蛋白酶(购自无锡中天食品添加剂有限公司，单位酶活15000U/g)，4°C轻轻搅拌48 h ； 4、离心去除沉淀:4°C，14000Xg，离心I h，弃去沉淀(如果离心后由于粘稠度过高，分离不完全，可以用适量0.5 M乙酸稀释后重新离心)；5、沉淀C II:向上一步得到的上清液中缓慢滴加5 M的NaCl，致使其终浓度为0.89M，然后4°C静置12 h，以充分沉淀C II ;然后4°C，14000Xg，离心I h，去除上清，得到沉淀的 C II ;6、将上一步得到的沉淀用100 mL的0.1 M乙酸4°C搅拌12 h，使其充分溶解；然后转入透析袋中(MWC0=50，000)，20 mM Na2HPO4溶液(pH 9.4) 4°C反复透析多次，透析袋中II型胶原蛋白形成沉淀。7、将上步获得的II型胶原蛋白沉淀用100 mL 0.1 M乙酸溶解，然后转入透析袋中(MWCO=IO, 000)，用0.1 M乙酸，4°C充分透析以除去盐离子；8、冷冻干燥:将透析后的液体低温冷冻真空干燥，得到蕲蛇II型胶原蛋白冻干粉(图 2)。所得蕲蛇II型胶原蛋白与牛II型胶原蛋白作对照进行SDS-PAGE电泳观察分子量与纯度，结果见图3。显示本发明所提取蕲蛇II型胶原蛋白纯度较高(经HPLC方法测得纯度96.93%)，分子量大约为130KD。所得蕲蛇II型胶原蛋白采用HPLC方法经峰归一化法检测纯度，按以下色谱条件进行:BioS 印-SEC-S2000 (7.8 mmX300 mm, 5 μ m)色谱柱，流动相为 0.15 mol/L 磷酸二氢钾缓冲液化诉4.7)，流速1.0 ml/min，UV检测波长210 nm，柱温为室温。结果见图4，经本方法检测蕲蛇II型胶原蛋白纯度较高(为96.93%)。所得蕲蛇II型胶原蛋白与牛II型胶原蛋白作对照进行全波长扫描，结果见图5。显示蕲蛇II型胶原蛋白与牛II型胶原蛋白紫外吸收图谱相近，最大吸收波长均为223 nm。所得蕲蛇II型胶原蛋白与牛II型胶原蛋白作对照进行蛋白质质谱分析，结果见图
6。肽段质谱图显示蕲蛇II型胶原蛋白与牛II型胶原蛋白相比具有相似肽段，具有II型胶原蛋白结构特征。
权利要求
1.一种以蕲蛇为原料提取II型胶原蛋白的方法，所述方法包括: (1)蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4 6°C搅拌24 30h，离心，去上清，沉淀用40-60 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4 5M，Tris-HCl浓度为40 60 mM ； (2)步骤(I)所得沉淀用0.5^1 M乙酸水溶液重悬，以60-80%甲酸水溶液调节pH值为2 3，加入足量胃蛋白酶，4 6°C搅拌48-60h，离心，弃去沉淀； (3)步骤(2)得到上清液滴加5 6MNaCl溶液至NaCl浓度为0.8 0.9 M，4 6°C静置12 24h，离心，去除上清液； (4)步骤(3)得到沉淀用足量0.05、.2 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20-30 mM Na2HPO4充分透析，所得沉淀再用足量0.05-0.2M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.05-0.2M乙酸溶液充分透析，所得液体真空干燥，得到所述II型胶原蛋白的粉末。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述蕲蛇粉末粒径不大于2mm。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中胃蛋白酶加入量为300-800U/g蕲蛇粉末。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述蕲蛇粉末与盐酸胍-Tris-HCl混合溶液用量之比为1OOg:1000-5000mL。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中步骤(I)所得沉淀与乙酸水溶液用量之比为 100g:1000-3000mL。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下: Cl)蕲蛇粉碎至粒径为2mm，粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液混悬，4°C搅拌24h，4°C、14000Xg离心lh，去上清，沉淀用50 mM Tris-HCl溶液洗涤除去盐酸胍；所述盐酸胍-Tris-HCl混合溶液中盐酸胍浓度为4M，Tris-HCl浓度为50 mM, pH7.5 ； (2)步骤(I)所得沉淀用0.5 M乙酸水溶液重悬，以70%甲酸水溶液调节pH值为2.8，加入胃蛋白酶，4°C搅拌48h，4°C、14000Xg离心lh，弃去沉淀；所述胃蛋白酶加入量为300^800 U/g蕲蛇粉末； (3)步骤(2)得到上清液滴加5MNaCl溶液至NaCl浓度为0.8 0.9 M，46°C静置12h，4°C、14000 Xg离心lh，去除上清液； (4)步骤(3)得到沉淀用0.1 M乙酸溶解，转入截留分子量50000道尔顿的透析袋中、用20 mM Na2HPO4于4°C下充分透析，所得沉淀再用0.1M乙酸溶解，转入截留分子量10000道尔顿的透析袋中、用0.1M乙酸溶液于4°C下充分透析，所得液体真空干燥，得到所述II型胶原蛋白的粉末。
全文摘要
本发明提供了一种以蕲蛇为原料提取Ⅱ型胶原蛋白的方法。所述方法包括将蕲蛇粉末用盐酸胍-Tris-HCl混合溶液除去蛋白多糖；除去多糖后收集沉淀，用乙酸溶液溶解沉淀；溶液采用胃蛋白酶酶解释放Ⅱ型胶原蛋白；酶解液离心后取上清进行盐析充分沉淀Ⅱ型胶原蛋白；离心收集沉淀Ⅱ型胶原蛋白离心并用乙酸再次溶解，溶解液透析除胃蛋白酶和其他杂蛋白；透析袋中Ⅱ型胶原蛋白再次使用乙酸溶解并透析除去盐离子；将透析后的袋内液体低温冷冻真空干燥，得到蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白。本发明的有益效果主要体现在本发明方法操作简单，制得Ⅱ型胶原蛋白纯度高。
文档编号C12P21/06GK103088096SQ20121059158
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者丁兴红, 谷恒存, 丁志山, 蒋福升, 范永升 申请人:浙江中医药大学