通过连续培养制造异丙醇的方法

通过连续培养制造异丙醇的方法
【专利摘要】本发明提供了一种异丙醇制造方法，所述方法包括：一边向培养槽连续供给包含来自植物的原料的底物液、并且从该培养槽连续取出包含产物的培养液，一边培养具有通过基因重组导入或修饰了的异丙醇生产能力的异丙醇生产大肠杆菌，所述培养是在该大肠杆菌于异丙醇生产期间稳定生长的菌体生长条件下、并且维持所述培养槽内的菌体数目地进行的；使所述异丙醇生产大肠杆菌与来自植物的原料在所述培养槽内接触来生产异丙醇；以及，由从所述培养槽中取出的所述包含产物的培养液，回收通过异丙醇生产大肠杆菌生产的异丙醇。
【专利说明】通过连续培养制造异丙醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及异丙醇的制造方法。
【背景技术】
[0002]丙烯是聚丙烯等合成树脂或石油化学制品的重要的基础原料，被广泛应用于汽车用缓冲器或食品容器、膜、医疗设备等。
[0003]因为由来自植物的原料制造出的异丙醇可经脱水工序转化为丙烯，所以有希望作为碳中和的丙烯的原料。根据京都议定书，发达国家被赋予以全部发达国家计于2008年至2012年间使温室效应气体排放量与1990年相比削减5%的义务，在这种情况下，碳中和的丙烯由于其广泛适用性而对地球环境极其重要。
[0004]将来自植物的原料同化来生产异丙醇的微生物是已知的。
[0005]例如，国际公开2009/008377号中公开了使用为了以葡萄糖为原料生产异丙醇而经修饰的大肠杆菌，一边进行基于逐次添加底物液的半分批式培养一边生产异丙醇。其中记载了:该异丙醇生产大肠杆菌因为异丙醇选择性高，因而具有作为工业生产用生物催化剂的优异的性质。
[0006]对于通过培养方法以工业水平生产异丙醇，一直追求通过长时间的连续培养来进行高效生产。
[0007]为此，例如， 生物化学工学会志71(1)，pp.9-14，(1993)中，报道了使用从土壤分离的属于梭菌属的微生物进行的丁醇.异丙醇的连续培养。其中，虽然进行了 30天的连续培养，但是没有对该微生物进行基于基因重组的修饰，异丙醇的选择率为约25%，较低。
[0008]J.Biosc1.Bioeng.，110 (6)，pp.696-701，(2010)中，报道了基于长时间的半分批式培养的异丙醇生产，所述培养使用了为生产异丙醇而修饰的大肠杆菌。其中，通过气体剥离(gas stripping)将生成的异丙醇从培养液中导入至气体中，用水作为捕集液回收气体中含有的异丙醇。就培养槽而言，使用锥形瓶，通过装入瓶容量的1/10以下的极少量的培养液来增大比表面积，一边基于逐次添加的半分批式培养，一边生成异丙醇并蒸发培养液，因此培养液量降低，可实现240小时的长运转时间。
[0009]另一方面，J.1nd.Microbiol.Biotechnol, 33, pp.834-844, (2006)中报道了通过不通气进行的乙醇连续培养，其使用了为了生产产物乙醇的基因重组大肠杆菌。其中，通过利用液体循环型固定床的连续培养，实施了在向培养槽供给(feed)灭菌培养基、从培养槽取出培养液这样的一般性连续培养之外还使培养槽内液体循环的连续培养。
[0010]已知在使用大肠杆菌、通入氧气或含氧气体的需氧培养中，作为副产物生成乙酸，若乙酸的蓄积浓度变高，将导致大肠杆菌的生长抑制或目标产物的生产效率降低。因此，公知DO-Stat方法，该方法为了抑制乙酸的高度蓄积，而控制通气或搅拌速度，将培养槽内的溶解氧浓度控制为数ppm以使其不枯竭。Biotech.Bioeng.，36，pp.750-758，(1990)中报道了:关于乙酸的蓄积，在通常的半分批式培养中，第48小时的乙酸浓度为35g/L，通过利用DO-Stat方法的控制，第36小时的乙酸浓度为17g/L，经平衡DO-Stat(Balanced DO-Stat)方法则不产生乙酸，该方法中，除了控制溶解氧浓度之外，还通过控制半分批式培养中底物液的添加速度来控制培养槽中葡萄糖的浓度。

【发明内容】

[0011]但是，为了长时间的培养而增大比表面积的方法导致使用过大的培养槽，工业水平的规模是不现实的。另外，通常的半分批式培养中，虽然运转时间越长异丙醇的产量越多，但是因为培养液量持续增加，所以大型培养槽是必需的，工业化的情况下设备费、维持费、运转费显著提高，因此不适合通用化学品的制造。
[0012]即使从菌体生长的观点来看，已知在半分批式培养中，从16小时至48小时左右，菌体的生长几乎停止，随着培养时间进一步延长，异丙醇的生产速度降低。即使是J.Biosc1.Bioeng.，110(6), pp.696-701，(2010)中记载的技术，也报道了在 240 小时以后
即使添加浓缩营养培养基，异丙醇的生产也停止了。
[0013]另一方面,虽然异丙醇的生产中氧是必需的,但J.1nd.Microbi ol.Biotechnol, 33，pp.834-844，(2006)记载的技术中记载了如下内容:若由于氧从液体循环管路中使用的管透过，菌体的氧摄取速度成为lmmol/L/h，则没有被固定化的游离菌体具有的质粒从培养第二天以后开始脱离。一般已知质粒开始脱离后，不具有质粒的菌体的生长变为优势地位，不适合伴随长时间生长的培养。另外，为了抑制作为副产物生成乙酸，利用DO-stat方法、经平衡的DO-Stat方法等进行控制，必须组成复杂的控制程序，另外在多数情况下还必须使用高成本的纯氧。
[0014]因此，依然希望通过经济上有利的连续培养以良好的效率制造异丙醇。
[0015]本发明的目的是提供利用连续培养、简便且长时间地稳定地以高生产率制造异丙醇的异丙醇的制造方法。
`[0016]本发明的各方式提供以下的异`丙醇制造方法。
``[0017]项1、一种异丙醇制造方法，所述方法包括:
[0018]一边向培养槽连续供给包含来自植物的原料的底物液、并且从该培养槽连续取出包含产物的培养液，一边培养具有通过基因重组导入或修饰了的异丙醇生产能力的异丙醇生产大肠杆菌，所述培养是在该大肠杆菌于异丙醇生产期间稳定生长的菌体生长条件下、并且维持所述培养槽内的菌体数目地进行的，
[0019]使所述异丙醇生产大肠杆菌与来自植物的原料在所述培养槽内接触来生产异丙醇，和
[0020]由从所述培养槽中取出的所述包含产物的培养液，回收所述通过异丙醇生产大肠杆菌生产的异丙醇。
[0021]项2、项I所述的异丙醇制造方法，其中，所述菌体生长条件为:比生长速度为0.015/h 以上。
[0022]项3、项I或2所述的异丙醇制造方法,其中，所述培养以10mmol/L/h~250mmol/L/h的氧摄取速度进行。
[0023]项4、项I~3中任一项所述的异丙醇制造方法，其中，所述菌体生长条件为:比生长速度为0.02/h以上。
[0024]根据本发明，能提供利用连续培养，简便且长时间地稳定地以高生产率制造异丙醇的异丙醇的制造方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1为可用于本发明的连续培养槽的一个例子的概略结构图。
[0026]图2为表示本发明的实施例1及比较例I中的培养槽内的培养液中的菌体质量的经时变化的图。
[0027]图3为表示本发明的实施例1及比较例I中的异丙醇生产质量的经时变化的图。
[0028]图4为表示本发明的实施例2~实施例4及比较例2中的培养槽内的培养液中的菌体质量的经时变化的图。
[0029]图5为表示本发明的实施例2~实施例4及比较例2中的异丙醇生产质量的经时变化的图。
[0030]图6为表示本发明的实施例2~实施例4及比较例2中的质粒脱离率的经时变化的图。
[0031]图7为表示本发明的实施例5~实施例10中的OUR与异丙醇收率的相关关系的图。
[0032]图8为表示本发明的实施例5~实施例10中的OUR与异丙醇生产速度的相关关系的图。
[0033]图9为表示本发明的实施例5、实施例7及实施例9中的异丙醇生产质量的经时变化的图。
[0034]图10为表示本发明的实施例5中的培养槽内的溶解氧的经时变化的图。
[0035]图11为表示本发明的实施例7中的培养槽内的溶解氧的经时变化的图。
[0036]图12为表示本发明的实施例9中的培养槽内的溶解氧的经时变化的图。
[0037]图13为表示本发明的实施例11中的培养槽内的培养液中的菌体质量的经时变化的图。
[0038]图14为表示本发明的实施例11中的异丙醇生产质量的经时变化的图。
[0039]图15为表示本发明的实施例11中的质粒脱离率的经时变化的图。
【具体实施方式】
[0040]本发明的异丙醇制造方法为下述异丙醇制造方法，所述方法包括:
[0041]一边向培养槽连续供给包含来自植物的原料的底物液、并且从该培养槽连续取出包含产物的培养液，一边培养具有通过基因重组导入或修饰了的异丙醇生产能力的异丙醇生产大肠杆菌，所述培养是在该大肠杆菌于异丙醇生产期间稳定生长的菌体生长条件下、并且维持所述培养槽内的菌体数目地进行的，
[0042]使所述异丙醇生产大肠杆菌与来自植物的原料在所述培养槽内接触来生产异丙醇，和
[0043]由从所述培养槽中取出的所述包含产物的培养液，回收所述通过异丙醇生产大肠杆菌生产的异丙醇。
[0044]根据本发明，一边连续进行向培养槽内供给底物液及从培养槽内取出包含产物的培养液，一边在如下条件下并且维持所述培养槽内的菌体数地培养所述异丙醇生产大肠杆菌，所述条件为:维持具有通过基因重组导入或修饰了的异丙醇生产能力的异丙醇生产大肠杆菌的菌体数、并且该大肠杆菌于异丙醇生产期间稳定生长的菌体生长条件。即，由于一边在维持菌体数的同时在规定的菌体生长条件下连续培养异丙醇生产大肠杆菌，一边生产异丙醇，因此即使是使用了异丙醇生产大肠杆菌的连续培养，也能简便且长时间地稳定地以闻生广率制造异丙醇。
[0045]对其进行进一步说明的话，例如，J.1nd.Microbiol.Biotechnol, 33，pp.834-844，(2006)中公开的技术记载了:为了使大肠杆菌稳定地保持质粒，必须要抑制氧摄取速度为0.6mmol/L/h以下,另外,利用使用大肠杆菌的氧摄取速度高的需氧培养而进行的长期连续培养迄今为止没有报道的例子。因为上述这些原因，暗示了在供给氧的需氧培养下使用基因重组大肠杆菌的话，不进行固定化的情况下，质粒脱离了的菌体经时增加，因此长时间连续培养时目标产物的生产速率降低。另外暗示了:使用经固定化的菌体的情况下，因为氧和菌体的接触性降低，所以进行氧为必需的需氧培养时，目标产物的生产速度降低。
[0046]另外，例如，Biotech.Bioeng.，36，pp.750-758，(1990)中公开的技术中，进行了使用大肠杆菌的、运转时间2天的基于需氧的半分批式培养。虽然其没有与氧摄取速度相关的记载，但其使用发酵罐以Ivvm通入空气或纯氧，搅拌转数为最大1350rpm，本领域技术人员能够容易地推测氧摄取速度高。其中记载，培养2天左右基本上没有质粒脱离的影响，但需氧培养下由于乙酸高度蓄积导致生长阻碍、目标产物的生产速度降低，因此必须要通过DO-Stat方法、经平衡的DO-Stat方法等控制溶解氧浓度。
[0047]与这些相对地，本发明中，并非着眼于在向培养槽投入异丙醇生产大肠杆菌的最初，而是着眼于从培养开始起规定时间后的异丙醇生产期间的异丙醇生产大肠杆菌的行为，调整该时期的培养条件为菌体稳定生长的条件。由此即使不进行利用DO-Stat方法、经平衡的DO-Stat方法的对培养槽内溶解氧浓度、葡萄糖浓度的复杂控制，也不会降低需氧培养中异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产率，能通过简便的培养方法经过长时期地制造异丙醇。
[0048]可通过进一步将通气.搅拌条件调整为适合异丙醇生产的范围内，更高效地制造异丙醇。
[0049]本发明中使用“~”表示的数值范围表示将“~”的前后记载的数值分别作为最小值和最大值而含有的范围。
[0050]本说明书中“步骤”这样的词语不仅包含独立的步骤，即使与其他步骤无法明确区分的情况下只要能达到本步骤的预期目的，也包含在该词语内。
[0051]另外，本发明中，提到组合物中各成分的量的情况下，对应组合物中各成分的物质存在多种的情况下，只要没有特别说明，其指组合物中存在的该多种的物质的总量。
[0052]下面，针对本发明进行说明。
[0053]本发明中的异丙醇生产大肠杆菌是具有用于生产异丙醇的异丙醇生产系统的大肠杆菌。因为大肠杆菌本来没有生产异丙醇的系统，所以本发明中的异丙醇生产大肠杆菌是具有利用基因重组等导入或修饰过的异丙醇生产能力的大肠杆菌。上述异丙醇生产系统只要是使作为对象的大肠杆菌生产异丙醇的系统，就可以是任意系统。另外，异丙醇生产系统的至少一部分可利用基因重组被导入或被修饰。利用基因重组的导入或修饰可使用公知的方法，例如可举出对基因组的同源重组、利用质粒的导入等。[0054]本发明中的异丙醇生产大肠杆菌优选是强化了参与异丙醇的生产的酶活性的大肠杆菌。所谓“利用基因重组”包括针对本来的基因的碱基序列通过具有不同序列的外来的碱基序列的插入、或基因的某部分的置换、缺失或它们的组合而发生碱基序列上的改变的所有情形，例如，可以是发生突变而得到的情形。
[0055]关于本发明中的异丙醇生产大肠杆菌，进一步优选的是，乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性这4种酶活性被从菌体外赋予或在菌体内使这4种酶表达增强、或上述两者。
[0056]本发明中的硫解酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(1.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.3.1.9、催化从乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA的反应的酶的总称。
[0057]本发明中的乙酰乙酸脱羧酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(1.U.B.)酶委员会报告的酶编号4.1.1.4、催化从乙酰乙酸生成丙酮的反应的酶的总称。
[0058]本发明中的异丙醇脱氢酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(1.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.80、催化从丙酮生成异丙醇的反应的酶的总称。
[0059]本发明中的CoA转移酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(1.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.8.3.8、催化从乙酰乙酰CoA生成乙酰乙酸的反应的酶的总称。
[0060]本发明中，作为具有异丙醇生产系统的异丙醇生产大肠杆菌的例子，可例示W02009/008377号中记载的pIPA/B株或plaaa/B株。另外，该大肠杆菌包括如下株:在参与异丙醇生产的酶中，CoA转移酶活性和硫解酶活性的增强是通过强化该大肠杆菌的基因组上的各基因的表达来进行的，异丙醇脱氢酶活性和乙酰乙酸脱羧酶活性的增强通过用质粒强化各基因的表达进行(有时称为Pla/B:1atoDAB株)。
[0061]本发明中，可使用使异丙醇生产率更有效地提高的重组大肠杆菌，作为这样的大肠杆菌的例子，可举出失活的GntR活性、失活的葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性、失活的磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)活性和强化的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性。通过为上述组合，与除此之外的各因子或酶的组合相比，可以令人惊异地提高异丙醇生产率。
[0062]本发明中的葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)是指，分类为依据国际生物化学联合会(1.U.B.)酶委员会报告的酶编号5.3.1.9、催化从D-葡萄糖-6-磷酸生成D-果糖-6-磷酸的反应的酶的总称。
[0063]本发明中的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)是指，分类为依据国际生物化学联合会(1.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.49、催化从D-葡萄糖-6-磷酸生成D-葡萄糖酸-1，5-内酯-6-磷酸的反应的酶的总称。
[0064]作为本发明中使用的葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码硫解酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列而合成出的合成DNA序列。
[0065]本发明中的磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)是指，分类为依据国际生物化学联合会(1.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.44、催化从6 —磷酸-D-葡糖酸生成D-核酮糖-5-磷酸和C02的反应的酶的总称。
[0066]作为这样的异丙醇生产大肠杆菌的优选方式,可以举出使上述pIPA/B株、PIaaa/B株或pla/B:: atoDAB株的GntR活性失活的株,或使pla/B:: atoDAB株的GntR活性和葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)活性失活、使葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性强化的株，或使pla/B::atoDAB株的GntR活性和葡萄糖_6_磷酸异构酶(Pgi)活性和磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)活性失活、使葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性强化的株等。
[0067]本发明的异丙醇制造方法是利用使用了上述异丙醇生产大肠杆菌的连续培养从来自植物的原料生产异丙醇的方法。
[0068]所述异丙醇制造方法具体而言包括:
[0069]一边向培养槽中连续供给包含来自植物的原料的底物液、并且从该培养槽连续取出包含产物的培养液，一边培养所述异丙醇生产大肠杆菌，所述培养是在该大肠杆菌于异丙醇生产期间稳定生长的菌体生长条件下、并且维持所述培养槽内的菌体数目地进行的(下文中称为“培养步骤”)，
[0070]使所述异丙醇生产大肠杆菌与来自植物的原料在所述培养槽内接触来生产异丙醇(下文中称为“生产步骤”)，和
[0071]由从所述培养槽中取出的所述包含产物的培养液，回收所述通过异丙醇生产大肠杆菌生产的异丙醇(下文中称为“回收步骤”)。
[0072]上述制造方法中的异丙醇生产大肠杆菌的培养在使上述异丙醇生产大肠杆菌维持菌体数的同时稳定生长的菌体生长条件下进行。菌体数的维持通过底物液的供给和培养液的取出以及在菌体生长条件下的培养来达成。由此，即使在异丙醇生产期间上述大肠杆菌的生长能力也被维持，结果，即使连续培养也能维持异丙醇的生产。
[0073]上述制造方法中，为了通过连续培养进行异丙醇的生产，在培养槽内使上述异丙醇生产大肠杆菌与来自植物的原料接触而生产异丙醇的上述生产步骤与上述培养步骤同时进行。但是，用于培育或维持 不依赖于上述菌体生长条件的异丙醇生产大肠杆菌的单纯培养，可以不与上述生产步骤同时进行。
[0074]另外，因为上述回收步骤为从由上述培养槽取出的上述包含产物的培养液中回收通过异丙醇生产大肠杆菌生产的异丙醇的步骤，所以其可以与上述培养步骤及生产步骤同时进行，也可不与培养步骤及生产步骤同时进行。
[0075]上述培养步骤在培养初期的菌体浓度达到能稳定地维持菌体数的菌体浓度后进行。
[0076]培养初期的“能稳定地维持菌体数的菌体浓度”为连续培养开始后能维持上述大肠杆菌的生长的菌体浓度即可，无特别的限制，例如相当于以干燥质量计为2.4g干燥细胞/L的菌体浓度就足够了。
[0077]本发明中的“连续培养”是指如《发酵工学的基础》(P.F.St anbury著，学会出版中心，1988 年，pl4 ~pl5, [Principles of Fer mentation Technology (Stanbury, PeterF.; Whitaker, Allan)])中所记载的那样,通过将上述底物液连续供给至培养槽(下文中有时称为“给料”(feed))、连续地取出包含产物的培养液的方法，培养菌体，通过该菌体生产目标产物。此时，通过从培养槽取出与被供给的底物液等量的培养液，培养槽内的液量成为基本恒定的液量。
[0078]给料的方法没有特别限制，可举出以恒定速度给料的chemo stat方法、为了减少碳源(来自植物的原料)的损失而间断给料的方法等。作为间断给料的方法，例如可举出pHstat方法。该pHstat方法为下述方法:供给碳源(来自植物的原料),其暂停时，以培养槽内的碳源(来自植物的原料)枯竭导致PH的上升及溶解氧浓度的上升、排气二氧化碳浓度的降低作为指标，再度开始给料。
[0079]对于本发明中的“连续供给”或“连续取出”这样的词语，只要培养槽内的液量被维持为基本恒定，任意形式的给料方法都被包括在内。需要说明的是，“培养槽内的液量基本恒定”表示:与异丙醇制造开始时的培养槽内的液量进行比较时的液量变化为O容量％~10容量％的范围内，从连续运转的稳定性的观点来看优选为O容量％~5容量％的范围内。
[0080]本文中，“异丙醇生产期”指菌体生长达到稳定状态后异丙醇被生产的时期。上述培养步骤根据菌体的生长状况被分为:制造刚开始后的菌体几乎不生长繁殖的诱导期、和之后的对数生长期。本发明中，“菌体生长达到稳定状态”表示在上述对数生长期中伴随上述培养液的取出而被取出的菌体量与新生长出的菌体量为平衡状态。这样的菌体生长达到稳定状态的时候，培养槽内的菌体浓度成为恒定。菌体生长达到稳定状态的时间根据培养开始时的菌体浓度及菌的状态、培养液的容量以及被供给的碳源的浓度而不同，在培养开始时的菌体浓度为0.08g干燥细胞/L、碳源浓度为2g/L、使培养液的容量为0.5L的情况下，一般在培养开始后24~48小时达到稳定状态，因此异丙醇生产期可以为培养开始后24小时以后，可优选为48小时以后。
[0081]菌体生长条件表示达到对数生长期之后用于使菌体生长的条件。即，在培养槽内的培养系统中，至少需要将上述异丙醇生产大肠杆菌的菌体密度、上述底物液浓度及上述产物浓度均维持在不抑制异丙醇生产大肠杆菌的生长的范围内。异丙醇生产大肠杆菌的菌体密度的过量或死亡数目的增加、底物液浓度的过量、及产物浓度的过量中的至少一种产生的情况下，异丙醇生产大肠杆菌的生产停滞或被抑制，因此不能维持异丙醇生产大肠杆菌的生长。结果，培养系统整体中的异丙醇生产能力受损。
[0082]作为上述菌体生长条件，从维持稳定状态的观点来看，优选为使比生长速度为0.015/h以上的条件。比生长速度为0.015/h以上时，存在能够简便且有效地调整异丙醇生产大肠杆菌的菌体密度、底物液浓度及产物浓度，维持培养系统内的异丙醇生产大肠杆菌的生长能力的倾向。作为上述比生长速度，从提高异丙醇的生产速度的观点来看，更优选为0.02/h以上，进一步优选为0.025/h以上，特别优选为0.03/h以上。另外，比生长速度的上限值没有特别限制，但从大肠杆菌的传代时间来考虑的话，优选为4/h以下，更优选为l/h以下，进一步更优选为0.5/h以下，特别优选为0.2/h以下。需要说明的是，作为由上述优选的上限值和优选的下限值构成的数值范围，也可以是上述任意的上限值与任意的下限值的组合。
[0083]上述比生长速度为相对于菌体的生长速度(=相对于单位菌体质量、单位时间而言菌体增加的质量)，如《发酵工学的基础》(P.F.Stanbury著，1988年，pl4~pl5)所述，在稳定状态以式I表示。本发明中的比生长速度适用该式I。
[0084](式1)
[0085]μ =F/V
[0086]μ=比生长速度(IT1)
[0087]F:底物液的供给速度(L/h)~培养液的取出速度(L/h)
[0088]V:培养槽中的液量(L)
[0089]根据式1，作为上述底物液的供给速度和上述培养液的取出速度，根据培养槽中的液量而有所不同，例如，培养槽中的液量为IL的情况下，可以为0.015L/h~4L/h，从提高异丙醇的生产速度的观点来看，优选为0.02L/h~4L/h，更优选为0.025L/h~lL/h。同样地，例如，培养槽中的液量为Im3的情况下，可以为0.015m 3A~4m3/h，从提高异丙醇的生产速度的观点来看，优选为0.02m3/h~4m3/h,更优选为0.025m3/h~lm3/h。
[0090]作为上述培养槽的容量(大小)，没有特别限制，可适用通常用于物质生产的培养槽。另外，向培养槽填充的液体的液量可根据使用的培养槽的容量适当地设定。
[0091]需要说明的是，比生长速度在异丙醇生产期中在上述范围内即可。异丙醇生产期以外的时期中，比生长速度没有特别限制，可以与上述范围相同，也可以不同。与上述范围不同的范围的情况下，例如，可以为0.015/h以下。
[0092]另外，作为保持稳定状态的比生长速度以外的条件，可举出底物液的糖浓度、培养槽内的温度、PH等，但只要能维持稳定状态则无特别限制，为本领域技术人员能够容易类推的条件即可。 [0093]本发明中，异丙醇生产期中的菌体数没有特别限制，但从高效生产异丙醇的观点来看，培养槽内的菌的总质量优选为Ig干燥细胞/L~30g干燥细胞/L，更优选为3g干燥细胞/L~20g干燥细胞/L。“菌体数的维持”是指，达到成为规定的菌体数的稳定状态后，菌体数的变化率为30%以内，优选为20%以内的变化率。菌体数可使用如下文所述用分光光度计在660nm的波长处进行测定、以10D660=0.3g干燥细胞/L计算出的菌体浓度。
[0094]本发明的制造方法中，从生产异丙醇的效率的观点来看，优选需氧培养。本发明中，需氧培养表示在存在空气或氧的状态下进行的培养，其指存在使得菌体的氧摄取速度为lmmol/L/h以上的氧的状态。氧摄取速度(oxygene uptake rate:0UR)表示相对于单位时间、单位培养液而言的菌体消费的氧的量。OUR使用通过排气分析法从下述式2求出的数值。
[0095](式2)
[0096]0UR=7.22 X 106/V X (QiPiYiZT1-Q0P0YyT0)
[0097]V:培养槽中的液量(L)
[0098]Qi及0。:空气入口及出口处的空气流量(L/min)
[0099]Pi及P。:空气入口及出口处的气压(MPa)
[0100]Ti及1；:空气入口及出口处的绝对温度(K)
[0101]yi&y。:空气入口及出口处的氧的摩尔分率
[0102]需要说明的是，基于上述式2求出OUR时，空气流量、气压、绝对温度的值在空气入口及出口处仅存在能忽略的程度的差异时，也可适用在一处的测定值。另外，本发明中提及的压力及气压指绝对压力。
[0103]因为菌体量和相对菌体的氧消费量在培养期间有所变化，因此OUR随通气量、搅拌转速、温度、压力、PH等而变动。因此，为了将OUR调节为上述范围内，适当地调节空气流量、气压等即可。本领域技术人员能够基于上述式2进行适当调整，以实现目标OUR。
[0104]本发明中，优选OUR 为 10mmol/L/h ~250mmol/L/h,更优选为 20mmol/L/h ~200mmol/L/h,更优选 SOmmoI /Τ,/h ~200mmol/L/h,进一步更优选 100mmol/L/h ~180mmol/L/h。OUR为lOmmol/L/h以上时，存在能进一步减少乳酸、有机酸等有机酸、乙醇等副产物的倾向，OUR为250mmol/L/h以下时,存在能进一步减少二氧化碳等副产物的倾向。结果,OUR在10mmol/L/h以上、250mmol/L/h以下的范围时，存在由于副产物的生成量减少，从而异丙
醇收率及异丙醇生产速度提高的倾向。
[0105]上述本发明为了更高效地生产异丙醇，培养时的各条件优选为以下条件:
[0106](I)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.02L/h~4L/h，上述比生长速度为0.02/h以上、4/h以下，OUR为20mmol/L/h~200mmol/L/h。
[0107](2)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.02L/h~lL/h，上述比生长速度为0.02/h以上、l/h以下，OUR为20mmol/L/h~200mmol/L/h。
[0108](3)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.02L/h~0.5L/h,上述比生长速度为0.02/h以上、0.5/h以下，OUR为20mmol/L/h~200mmol/L/h ο
[0109](4)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.02L/h~0.5L/h,上述比生长速度为0.02/h以上、0.5/h以下，OUR为50mmol/L/h~200mmol/L/h ο
[0110](5)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.02L/h~0.5L/h，上述比生长速度为0.02/h以上、0.5/h以下，OUR为IOOmmoI/L/h~180mmol/L/h ο
[0111](6)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.02L/h~0.2L/h,上述比生长速度为0.02/h以上、0.2/h以下，OUR为20mmol/L/h~200mmol/L/h ο
[0112](7)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.02L/h~0.2L/h,上述比生长速度为0.02/h以上、0.2/h以下，OUR为50mmol/L/h~200mmol/L/h ο
[0113](8)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.02L/h~0.2L/h，上述比生长速度为0.02/h以上、0.2/h以下，OUR为IOOmmoI/L/h~180mmol/L/h ο
[0114](9)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.025L/h~lL/h，上述比生长速度为0.025/h以上、0.2/h以下，OUR为20mmol/L/h~200mmol/L/h0
[0115](10)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.025L/h~lL/h，上述比生长速度为0.025/h以上、0.2/h以下，OUR为50mmol/L/h~200mmol/L/h0
[0116](11)培养槽中的液量为IL时，底物液的供给速度及培养液的取出速度为0.025L/h~I L/h,上述比生长速度为0.025/h以上、0.2/h以下，OUR为I OOmmo I/L/h~180mmol/L/h ο
[0117]能将上述(I)的培养条件适用于使用以下任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中:
[0118](a) pIPA/B 株、plaaa/B 株，
[0119](b) pla/B::atoDAB 株的 GntR 活性失活的株，
[0120](c) pla/B::atoD AB株的GntR活性和葡萄糖_6_磷酸异构酶(Pgi)活性失活、葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性强化的株，及
[0121](d)pIa/B::atoDAB株的GntR活性和葡萄糖_6_磷酸异构酶(Pgi)活性和磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)活性失活、葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Zwf)活性强化的株。
[0122]另外同样地，能将上述(2)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中，能将上述(3)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中，能将上述(4)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中，能将上述(5)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中。
[0123]另外同样地，能将上述(6)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中，能将上述(7)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中，能将上述(8)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中，能将上述(9)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中，能将上述(10)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中，能将上述(11)的培养条件适用于使用上述(a)~(d)中的任何的异丙醇生产大肠杆菌的异丙醇生产中。
[0124]上述生产步骤中使用的上述来自植物的原料只要是从植物得到的碳源、是来自植物的原料，就没有特别限制。本发明中，来自植物的原料是指根、茎、干、枝、叶、花、种子等器官、包含它们的植物体、及上述植物器官的分解产物，进而，在从植物体、植物器官、或它们的分解产物得到的碳源中，可在微生物培养时作为碳源利用的物质也包含在来自植物的原料中。
[0125]上述来自植物的原料中包含的碳源中，通常可举出淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类、及大量含有上述成分的草木质分解产物、纤维素水解物等、及它们的组合，进而，植物油来源的甘油或脂肪酸也可包含在本发明中的碳源中。
[0126]作为本发明中的来自植物的原料的例子，可以优选举出谷物等农作物，玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等，及它们的组合，作为上述原料的使用形态，为未加工品、榨汁、粉碎物等，没有特别限定。另外，也可以为仅是上述碳源的形态。
[0127]作为异丙醇生产大肠杆菌的培养中使用的培养基，只要是含有碳源、氮源、无机离子、及为了使微生物生产异丙醇而需要的有机微量元素、核酸、维生素类等的通常使用的培养基，就没有特别限制。
[0128]在进行本发明的培养时，对pH、温度条件没有特别限制，例如，可一边将pH和温度适当地控制在pH4~9、优选pH6~8、温度20 V~50°C、优选25°C~42 V、压力O~5MPa、优选O~3MPa的范围内，一边进行培养。
[0129]被供给至培养槽的底物液可以仅是包含成为碳源的来自植物的原料的溶液，还可以是包含成为碳源的来自植物的原料的溶液与上述培养基的混合液。为了进行更有效率的培养，优选将包含上述来自植物的原料的培养基作为底物液供给。本发明中进行连续培养的培养槽内的溶液有时统称为“培养液”。
[0130]被供给至培养槽内的情况下，关于底物液中的来自植物的原料的量，从该原料的溶解度的观点来看，以碳源计可以为60质量％以下，从异丙醇生产率的观点来看，可以为5质量％~50质量％。
[0131]向上述培养液中通气体的通气量没有特别限制，当在通气培养槽中进行培养、仅使用空气作为气体时，通常为0.02vvm~3.0vvm (vvm:通气容量〔mL〕/液容量〔mL〕/时间〔分钟〕)，优选为0.1vvm~2.0vvm0根据培养装置的种类不同，用于调整为适合的OUR的通气量有所不同，例如作为用鼓泡塔(BubbIe Column)进行培养时的通气量的一个例子，可举出调整为0.02vvm~10.0vvm0
[0132]需要说明的是，本发明的异丙醇的制造方法，在用于生产异丙醇的培养步骤之前，也可包括预培养步骤，上述预培养步骤用于使使用的异丙醇生产大肠杆菌为适当的菌数或适度的活性状态。预培养步骤只要是利用对应于异丙醇生产细菌的种类的通常使用的培养条件所进行的培养即可。
[0133]上述回收步骤从由上述培养槽取出的上述包含产物的培养液(下文中也称“取出液”)中回收通过异丙醇生产大肠杆菌生产的异丙醇。由此，能够从取出后的上述包含产物的培养液中回收作为产物的异丙醇。
[0134]作为回收上述取出液中包含的异丙醇的方法，没有特别限制，例如可采用下述方法:通过离心分离等从上述取出液中除去菌体，之后通过蒸馏或膜分离等通常的分离方法分离异丙醇。被回收的异丙醇为水溶液的状态的情况下，本异丙醇的制造方法除了回收步骤之外还可包括脱水步骤。异丙醇的脱水可通过常规方法进行。
[0135]另外，上述培养步骤也可以是一边向上述含有异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物中供给气体、一边培养异丙醇生产大肠杆菌、使用该大肠杆菌生成异丙醇的步骤。这种情况下的回收步骤包括:收集通`过供给气体而从上述培养液中挥发的气体中的异丙醇的气态异丙醇收集步骤和从被收集的气态异丙醇中分离异丙醇的回收步骤两者。
[0136]作为气态异丙醇的收集方法的例子，可举出利用冷凝器的冷凝、通过涤气器(scrubber)或捕获管的捕集、通过异丙醇吸附能力高的过滤器(例如活性纤维过滤器)等的吸附等。作为收集后分离异丙醇的回收方法的例子，可直接利用上述回收方法，可基于收集方法进行适当地选择。
[0137]需要说明的是，该方式中，与气态异丙醇的收集步骤一起，还可包括收集液态异丙醇的步骤。该情况下，上述回收步骤可包括不仅回收气态异丙醇、还回收液态异丙醇的步骤。
[0138]作为为了一边向上述混合物中供给气体一边培养异丙醇生产大肠杆菌而可适用的装置，可以举出下述装置，其具有:培养槽、连接于培养槽并向培养槽内的混合液的内部供给气体的供给通路、及连接于上述培养槽并回收培养槽内的气体的回收通路。
[0139]作为这样的装置，可举出例如国际公开第2009/008377号说明书的图1所示的生
产装置。
[0140]在上述生产装置中，在收纳有含有异丙醇生产细菌和来自植物的原料的培养基的培养槽上，连接有用于从装置外部注入气体的注入管，能够向培养基通气。
[0141]另外，在培养槽上通过连接管连接有捕获槽，上述捕获槽容纳有作为捕集液的捕获液(trap solution)。此时，向捕获槽移动的气体或液体与捕获液接触而发生起泡。
[0142]由此，在培养槽中通过通气培养而生成的异丙醇由于通气而蒸发，易于从培养基中分离，并且在捕获槽中被捕获液捕集。结果，能够以进一步精制的形态连续且简便地生产异丙醇。
[0143]另外，本发明的异丙醇生产大肠杆菌，也可同时生产作为异丙醇的前体的丙酮。优选在利用公知的方法将得到的丙酮精制后，通过使用公知的方法(例如日本专利第2786272号公报记载的方法)将丙酮转化为异丙醇。由此，可进一步提高从糖原料向异丙醇的转化效率。
[0144]图1中显示了可适用于本发明的制造装置的一个例子。需要说明的是，图1中，10为制造装置、12为发酵槽、48为底物液槽、50为泵、54为控制器、56为取出液槽、58为泵、62为捕获槽。
[0145]制造装置10具有用于收纳菌体和来自植物的原料、进行异丙醇的生产的作为通气搅拌槽的培养槽12。制造装置10具有用于从空气入口向培养槽12的内部供给空气的质量流量计14、及用于将槽内的空气从排气口排出的冷凝器16。在冷凝器16与排气口之间，连接有槽内压力计18与排气分析计20，它们分别能测定槽内的压力和出口的氧摩尔分压。另外，排气口被引导至捕获槽62的内部，在收纳于捕获槽62的内部的捕获液中开口。培养槽12分别配置有温度传感器22、溶解氧传感器24及pH传感器26。另外，培养槽12配置有作为搅拌机的圆盘润轮桨(disk turbine blade) 28,圆盘润轮桨28通过磁性搅拌器44而被搅拌、控制。
[0146]另外，培养槽12的周围具有带式加热器38，内部具有冷却棒36，于冷却棒36连接有循环冷却装置40、冷却水通路控制用电磁阀42。于培养槽12的外层设有填充有pH调节剂的中和剂槽30。中和剂槽30具有天平34。中和剂槽30可经由泵32向培养槽12供给pH调节剂。
[0147]培养槽12具有控制全局的控制器54。控制器54与温度传感器22、溶解氧传感器24及pH传感器26连接，可从各传感器输入培养槽12内的反应液中温度、DO (溶解氧)及PH各信息。另外，控制器54与带式加热器38和冷却水通路控制用电磁阀42连接。控制器54能根据来自各种传感器的信息，使带式加热器38、冷却水通路控制用电磁阀42运行而控制温度，并且通过运行泵32而控制pH。
[0148]另外，制造装置10具有底物液槽48及取出液槽56。底物液槽48及取出液槽56分别具有天平52、60。底物液槽48收纳底物液，底物液槽48经由泵50被连接至培养槽12。底物液从底物液槽48经由泵50供给至培养槽12。根据控制器54的设定，供给的方法可为che mo stat、pH stat等各种给料控制,泵50根据来自控制器54的信号而运行。
[0149]取出液槽56经由泵58被连接至培养槽12，通过泵58的运行，培养液从培养槽12中被取出，并被引导、收纳至取出液槽56。取出口固定于培养槽内的固定位置，培养槽内的液面被控制为恒定。
[0150] 捕获槽62中被填充水(捕获液)，被维持为用于将气化的异丙醇液化的规定温度，例如为5°C。通过冷凝器16的运行而将通过通气、搅拌而从培养槽12内挥发的异丙醇从培养槽12引导至捕获槽62，在捕获槽62中将其捕获。
[0151]本发明中，在异丙醇生产期中在使菌体稳定生长的条件下并且维持菌体数地进行连续培养，因此，能够长时间地生产异丙醇，较之基于半分批式培养的异丙醇生产可以更高效地生产异丙醇。就本发明的异丙醇生产能力而言，例如可实现240h以上的连续培养。该情况下，例如，可实现0.7g/L/h以上的生产速度，优选1.0g/L/h以上的生产速度。[0152]实施例
[0153]以下记载本发明的实施例，但本发明不受它们的限制。关于生产异丙醇的大肠杆菌也不限于实施例中使用的菌体，只要是生产异丙醇的大肠杆菌，就没有特别限制。
[0154]需要说明的是，只要没有特别说明，记载中的“％”是质量基准。
[0155][异丙醇生产大肠杆菌的制作]
[0156]< B::atoDAB 株的制作>
[0157]大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的全碱基序列是公知的(Genbank登录号(Genbank accession number)U00096),也报道了编码大肠杆菌 MG1655 株的 CoA 转移酶 α亚基的基因(以下有时简称为atoD)的碱基序列。即，atoD记载于GenBank登录号U00096中记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2321469~2322131。
[0158]作为为了使上述基因表达而需要的启动子的碱基序列，可使用GenBank登录号X02662的碱基序列信息中397-440记载的来自大肠杆菌的甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下有时称为GAPDH)的启动子序列。为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，利用PCR法由cgctcaattgcaatgattgacacgattccg (序列号I)、及acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg (序列号 2)进行扩增，用限制性酶 MfeI 及 EcoRI 消化得到的DNA片段，从而得到约IOObp的编码GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段与通过将质粒PUC19 (GenBank登录号X02514)用限制性酶EcoRI消化进而用碱性磷酸酶处理而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5 α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。
[0159]将得到的菌落中的10个分别在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37°C下培养一夜，回收质粒，选出在用限制性酶EcoRI及KpnI进行消化时GAPDH启动子未被切除的质粒，进而确认DNA序列，将GAPDH启动子被正确地插入的质粒作为pUCgapP。用限制性酶EcoRI及KpnI消化得到的pUCgapP。
[0160]进而，为了获得atoD，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，利 PCR..法自 cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac (j^ ^lJ 3)> Jk.gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg (序列号4)进行扩增，用限制性酶EcoRI及KpnI消化得到的DNA片段，从而得到约690bp的atoD片段。将该DNA片段与之前用限制性酶EcoRI及KpnI消化过的pUCgapP混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5 α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体回收质粒，确认atoD被正确插入，将该质粒命名为pGAPatoD。
[0161]需要说明的是, 大肠杆菌MG1655株可由美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)获得。
[0162]如上所述，也报道了大肠杆菌MG1655株的基因组DNA中的atoD的碱基序列。使用基于大肠杆菌MG1655株的atoD的5’附近区域的基因信息制成的gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc (序列号 5)和 tactgcagcgttccagcaccttatcaacc (序列号6)，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增了约1.1kbp的DNA片段。
[0163]另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的GAPDH启动子的序列信息制成的ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列号7)、和基于大肠杆菌MG1655株的atoD的序列信息制成的序列号4的引物，将之前制成的表达载体pGAPatoD作为模板进行PCR，得到包括GAPDH启动子和atoD的约790bp的DNA片段。
[0164]将如上所述得到的片段分别用限制性酶PstI和Xbal、XbaI和KpnI进行消化，将该片段与用PstI和KpnI消化温度敏感性质粒pTH18csl (GenBank登录号AB019610) (Hashimoto-Gotoh, T.，Gene, 241，185-191 (2000)〕而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至DH5a株，得到在含有lOyg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30°C下生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有10μ g/ml氯霉素的LB液体培养基中在30°C下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。将该质粒转化至大肠杆菌B株(ATCC11303)中，在含有10 μ g/ml氯霉素的LB琼脂板上在30°C下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10 μ g/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30°C下培养一夜。将得到的培养菌体涂布于含有10 μ g/ml氯霉素的LB琼脂板上，在42°C下进行培养，得到菌落。将得到的菌落在不含抗生素的LB液体培养基中在30°C下培养2小时，涂布于不含抗生素的LB琼脂板上，得到在42°C下生长繁殖的菌落。
[0165]从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在不含抗生素的LB琼脂板和含有10 μ g/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，通过PCR从上述克隆的染色体DNA扩增含有GAPDH启动子和atoD的约790bp片段，选择atoD启动子区域被GAPDH启动子置换的株，将满足以上条件的克隆命名为大肠杆菌B:: atoDAB。
[0166]需要说明的是，大肠杆菌B株(ATCC11303)可由作为细胞.微生物.基因库的美国典型培养物保藏中心获得。
[0167]<质粒pl*a *z的制作>
[0168]梭状芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因(adc)记载于GenBank登录号M55392，异丙醇脱氢酶基因(IPAdh)记载于GenBank登录号AF157307。
[0169]作为为了使上述的基因簇表达而需要的启动子的碱基序列，可使用GenBank登录号X02662的碱基序列信息中397-440记载的来自大肠杆菌的甘油醒3-磷酸脱氢酶(以下有时称为GAPDH)的启动子序列。
[0170]为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，利用 PCR 法由 cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg (序列号 8)、及cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg (序列号 9)进行扩增，用限制性酶 Ndel、SphI 消化得到的DNA片段，从而得到约IIObp对应于GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段与通过将质粒pBR322 (GenBank登录号J01749)用限制性酶NdeI及SphI消化而得到的片段混合，用连接酶连接，然后，转化至大肠杆菌DH5ci株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μ g/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37°C下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒 pBRgapP。
[0171]为了得到经密码子修饰的异丙醇脱氢酶基因(IPAdh*)，基于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B-593的异丙醇脱氢酶基因的氨基酸序列，设计经密码子修饰的异丙醇脱氢酶基因，利用DNA合成制成了以下的DNA片段(序列号10)。序列记述如下。
【权利要求】
1.一种异丙醇制造方法，所述方法包括: 一边向培养槽连续供给包含来自植物的原料的底物液、并且从该培养槽连续取出包含产物的培养液，一边培养具有通过基因重组导入或修饰了的异丙醇生产能力的异丙醇生产大肠杆菌，所述培养是在该大肠杆菌于异丙醇生产期间稳定生长的菌体生长条件下、并且维持所述培养槽内的菌体数目地进行的， 使所述异丙醇生产大肠杆菌与来自植物的原料在所述培养槽内接触来生产异丙醇，和 由从所述培养槽中取出的所述包含产物的培养液，回收通过异丙醇生产大肠杆菌生产的异丙醇。
2.如权利要求1所述的异丙醇制造方法，其中，所述菌体生长条件为:比生长速度为0.015/h 以上。
3.如权利要求1或2所述的异丙醇制造方法，其中，所述培养以10mmol/L/h~250mmol/L/h的氧摄取速度进行。
4.如权利要求1~3中任一项所述的异丙醇制造方法，其中，所述菌体生长条件为匕生长速度为 0.02/h以上。
【文档编号】C12N15/09GK103717746SQ201280038780
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年8月9日 优先权日:2011年8月11日
【发明者】柴本宽子 申请人:三井化学株式会社