专利名称：一个高效抽提茄科类种子rna的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体是从茄科类植物新鲜种子或者干种子中抽提RNA的方法。
背景技术：
人类食物的70%是直接来源于植物种子，种子还是植物遗传资源的主要载体。在种子形成、萌发和幼苗建成等领域的研究中，基因动态表达、cDNA文库构建、基因克隆、体外翻译等以RNA分子为基础的分子生物学研究需要足够量和高质量的RNA，因此高效、快速的RNA提取方法成为一种关键技术。RNA分子的种类和数量具有鲜明的时间性和空间性，研究中常常必须使用特定的研究材料。植物材料中所含有的多糖、蛋白质、脂肪和一些次生代谢物会在很大程度上干扰RNA的提取质量和回收效率。而植物种子的成分较其它植物组织更为复杂，种子中含有大量的多糖、储藏蛋白、脂肪，多数还含有酚、酮、甙等次生代谢物，这给高质量RNA的提取造成了较大难度。目前种子RNA提取方法主要有纤维柱法(Pramanik SK, ReynoldsTL， Maclsaac SAj et al Rapid and efficient purification of seed messengerRNA without phenol: chloroform extraction.Seed science research, 1993，3:137-139)、SDS法(Hosein F.1solation of high quality RNA from seeds and tubersof the Mexican yam bean {Pachyrhizus erosus).Plant Molecular Biology Reporter,2004，19:65a-65e)、CTAB法(温小杰，张佳寅，王省芬等.棉花组织总RNA的快速提取方法.分子植物育种，2004，2:147-150)、十二烷基肌氨酸钠/盐酸胍法(Shanna ADjGill PKj Singh P.RNA isolation from plant tissues rich in polysaccharides.Analytical Biochemistry, 2003，314:319-321)、高盐法(Suzuki Y，Kawazu T，KoyamaH.RNA isolation from siliques，dry seeds, and other tissues of ArabidopsisthaIiana.Biotechniques, 2004，37:542-544)、尿素/LiCl 法(Tai HHj Pelletier C，Beardmore T.Total RNA isolation from Picea mariana dry seed.Plant MolecularBiology Reporter, 2004，22:93a_93e)等。这些方法或是费用昂贵，或是操作步骤多、提取耗时长。本发明以十二烷基肌氨酸钠/盐酸胍法为基础，改进提取液组分，分别以番茄新鲜种子、番煎干种子、辣椒新鲜种子、辣椒干种子为材料，1 效提取1 质量的RNA，时间较短，获得率较高。适用于以番茄为例的茄科类种子。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的高效抽提茄科类种子RNA的方法，是以十二烷基肌氨酸钠/盐酸胍法为基础，能够有效降低所抽提RNA中酚类和蛋白质等杂质的含量，纯度较好。为后期针对茄科类植物的种子进行更全面的分子生物学分析奠定了基础。本发明目的通过如下技术方案实现:(1)样品前处理:茄科类植物的新鲜种子或干种子用质量百分比浓度为1015%的次氯酸钠消毒l(Tl5min (其中有效氯为3%)后，用灭菌水清洗3 4次，将种子切开，加入
液氮充分研磨成粉状；
(2)初次抽提:取研磨充分的样品8(Tl00mg，加入灭菌的提取液和苯酚各10(Tl20ul，充分涡旋，在冰水混合物中冰浴l(T20min，离心；
(3)二次抽提:离心后吸取上清液，按每毫升上清液添加50(T6(K)ul三氯甲烷/异戊醇混合液的比例在上清液中加入三氯甲烷/异戊醇混合液，充分涡旋，离心收集最上层的上清液，然后按每毫升上清液添加50(T600ul苯酚/三氯甲烷混合液的比例在上清液中加入苯酚/三氯甲烷混合液，再抽提一次，离心，收集上清液；
(4)沉降:按每毫升上清液中添加Iml异丙醇的比例在上清液中加入预冷至-20°C的异丙醇，混匀静置5 10min，离心，弃上清液，加入n.5ml 75%的乙醇清洗，离心弃去乙醇后，即得胶体状RNA ；
(5)溶解:胶体状RNA，干燥5 IOmin后用50ul焦磷酸二乙酯(DEPC)溶液溶解，检测浓度后置于_20°C备用。本发明中所述提取液包括1%的十二烷基肌氨酸钠(Saracosyl)、IOOmM的Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、280mM的NaCl、10mM的EDTA(乙二胺四乙酸)、IOul/ml的P -巯基乙醇，提取液的PH值为8.5。本发明中三氯甲烷/异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为23: f 25:1。本发明中苯酚/三氯甲烷混合液中苯酚与三氯甲烷的体积比为1:广1.2:1。对本发明方法抽提的总RNA利用琼脂糖电泳检测，结果显示抽提的茄科类植物新鲜种子或者干种子RNA的18S rRNA和28S rRNA主条带清晰，RNA降解少、完整性好。点样孔无蛋白质污染，28S rRNA上方也没有DNA污染带，RNA纯度也较好。紫外分光光度计分别检测所抽提总RNA的OD26tZOD28tl和0D26(i/0D23(i比值，结果表明RNA的0D26(l/0D28(l比值在1.9^2.0之间，OD26tZOD23tl比值大于1，说明该方法提取的番茄和辣椒各类种子的纯度较好，酚类和蛋白质等杂质少。通过对总RNA做RT-PCR检测，用茄科类看家基因P-Actin为内参基因设计引物进行扩增，扩增的条带单一而且清晰。表明此法提取的RNA质量好，可以进行RNA反转录和RT-PCR等试验。本发明为抽提种子总RNA提供了一种新的方法，应用本方法提取种子总RNA，从加入提取液到完成所有操作仅需4个步骤，少于前人抽提种子RNA的步骤；RNA的抽提质量(28s、18s、5s RNA和mRNA等)都较高。RT-PCR等分子生物学实验证实，使用该方法提取的种子RNA质量较好，完全能够满足相应的分子生物学实验操作。本方法具有操作简便、获得率高和提取的RNA质量好等特点，具有较强的实用性和可靠性。
图1是本发明中番茄和辣椒新鲜种子和干种子总RNA琼脂糖凝胶电泳图谱，图中I是番爺新鲜种子总RNA, 2是辣椒新鲜种子总RNA, 3是番爺干种子总RNA, 4是辣椒干种子总 RNA ；
图2是本发明使用茄科类内参基因P -Actin检验种子RNA的RT-PCR电泳检测图；图中M是DNA marker DL2000,4分别是从番爺新鲜种子、番爺干种子、辣椒新鲜种子、辣椒干种子中抽提的RNA反转录后扩增P -Actin的结果。
具体实施例方式下面结合附图，用本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明保护范围不局限于所述内容；本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明均为市购常规试剂。实施例1:高效抽提番茄新鲜种子RNA的方法，具体操作如下:
(1)分别取番茄新鲜种子、番茄干种子、辣椒新鲜种子、辣椒干种子共四份材料，将这四份材料分别用质量百分比浓度为10%的次氯酸钠浸泡15min，用灭菌水清洗3次，将种子切开，弃掉胚乳，取18个半粒(IOOmg)用液氮研磨成粉状；
(2)在研磨后样品中加入IOOul灭菌的提取液(1%Saracosyl, IOOmM Tris-HCl, 280mMNaCl, IOmM EDTA，I Ou I/ml的3 -巯基乙醇，PH 8.5)，然后加入IOOul苯酚，充分涡旋，在冰水混合物中放置10 min,4°C, IOOOOg离心5min ；
(3)离心后吸取上清液到1.5ml的离心管中，按每毫升上清液添加500ul三氯甲烷/异戊醇混合液的比例在上清液中加入的三氯甲烷/异戊醇混合液(体积比为24:1)，充分涡旋，4°C，IOOOOg离心5min， 溶液会分为三层，吸取最上层的上清液于新的1.5ml离心管中，然后按每毫升上清液添加500ul苯酚/三氯甲烷混合液的比例在上清液中加入苯酚/三氯甲烷混合液(体积比为1:1)再抽提一次，4°C，IOOOOg离心，收集上清液；
(4)按每毫升上清液中添加Iml异丙醇的比例在上清液中加入预冷至_20°C的异丙醇，轻柔混匀后静置5min，4°C，IOOOOg离心5min，弃上清液，用Iml质量百分比浓度为75%的乙醇清洗，离心弃去乙醇后，即得胶体状RNA，RNA干燥IOmin后用50ul焦磷酸二乙酯溶液溶解，-20°C备用。采用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示所抽提种子RNA的18S rRNA和28S rRNA主条带清晰，表明RNA降解少、完整性好(见图1)，点样孔看不到蛋白质污染，28S rRNA上方也没有DNA污染带，表明RNA纯度也较好。质量较高的RNA 的 OD260/OD230 >2.0，OD260/OD280 =1.8 2.0。通过使用 Nd-1OOO 紫外分光光度计(NanoDrop技术，威尔明顿，德国)来检测所抽提总RNA的0D26(l/0D23(l和OD26tl/OD280比值，结果表明RNA的OD260/OD230值在2.05 2.26之间，OD260/OD280值为1.93 2.00之间，说明该方法抽提番茄和辣椒新鲜种子和干种子的RNA纯度都比较好，酚类和蛋白质等杂质少(见表I)。表1:茄科植物种子的紫外分光光度计检测结果
样品OD260/OD230OD2sd/ODso
番茄新鲜种子IB10
^辣椒新鲜种子in197
番茄干种子Z05L95
辣椒干种子126193
分别取所抽提种子的总RNA反转录的cDNA第一链为模板，用番茄看家基因P-Actin为内参基因设计引物进行扩增。图2表明，扩增的条带单一而且清晰，片段长度与目的片段长度一致。表明此法提取的RNA质量好，可以进行RNA反转录和RT-PCR等试验。实施例2:高效抽提番茄新鲜种子RNA的方法，具体操作如下:
(1)取番茄新鲜种子材料，用质量百分比浓度为15%的次氯酸钠浸泡lOmin，用灭菌水清洗4次，将种子切开，弃掉胚乳，加入液氮充分研磨成粉状；
(2)在研磨后样品80mg中加入IlOul灭菌的提取液(1%Saracosyl, IOOmM Tris-HCl,280mM NaCl, IOmM EDTA，I Ou I/ml的P -巯基乙醇，PH 8.5)，然后加入IlOul苯酚，充分涡旋，在冰水混合物中放置15 min,4°C, IOOOOg离心5min ；
(3)离心后吸取上清液到1.5ml的离心管中，按每毫升上清液添加600ul三氯甲烷/异戊醇混合液的比例在上清液中加入三氯甲烷/异戊醇混合液(体积比为23:1)，充分涡旋，4°C，IOOOOg离心5min，溶液会分为三层，吸取最上层的上清液于新的1.5ml离心管中，按每毫升上清液添加600ul苯酚/三氯甲烷混合液的比例在上清液中加入苯酚/三氯甲烷混合液(体积比为1.1:1)再抽提一次，4°C，IOOOOg离心，收集上清液；
(4)按每毫升·上清液中添加Iml异丙醇的比例在上清液中加入预冷至_20°C的异丙醇，轻柔混匀后静置10min，4°C，IOOOOg离心5min，弃上清液，用1.5ml质量百分比浓度为75%的乙醇清洗，离心弃去乙醇后，即得胶体状RNA，RNA干燥5min后用50ul焦磷酸二乙酯溶液溶解，_20°C备用；结果显示本实施例提取的RNA的OD26tZOD23tl值为2.13，OD260/OD280值为1.94。实施例3:高效抽提辣椒干种子RNA的方法，具体操作如下:
(1)取辣椒干种子材料，用质量百分比浓度为12%的次氯酸钠浸泡12min，用灭菌水清洗3次，将种子切开，弃掉胚乳，加入液氮充分研磨成粉状；
(2)在研磨后样品90mg中加入120ul灭菌的提取液(1%Saracosyl, IOOmM Tris-HCl,280mM NaCl, IOmM EDTA，I Ou I/ml的P -巯基乙醇，PH 8.5)，然后加入120ul苯酚，充分涡旋，在冰水混合物中放置20 min,4°C, IOOOOg离心5min ；
(3)离心后吸取上清液到1.5ml的离心管中，按每毫升上清液添加550ul三氯甲烷/异戊醇混合液的比例在上清液中加入三氯甲烷/异戊醇混合液(体积比为25:1)，充分涡旋，4°C，IOOOOg离心5min，溶液会分为三层，吸取最上层的上清液于新的1.5ml离心管中，按每毫升上清液添加550ul苯酚/三氯甲烷混合液的比例在上清液中加入苯酚/三氯甲烷混合液(体积比为1.2:1)再抽提一次，40C，IOOOOg离心，收集上清液；
(4)按每毫升上清液中添加Iml异丙醇的比例在上清液中加入预冷至_20°C的异丙醇，轻柔混匀后静置8min，4°C，IOOOOg离心5min，弃上清液，用1.2ml质量百分比浓度为75%的乙醇清洗，离心弃去乙醇后，即得胶体状RNA，RNA干燥6min后用50ul焦磷酸二乙酯溶液溶解，_20°C备用；结果显示本实施例提取的RNA的OD26tZOD23tl值为2.09，OD260/OD280值为1.96。
权利要求
1.一种高效抽提茄科类种子RNA的方法，其特征在于按如下步骤进行: 取茄科类植物的新鲜种子或干种子用质量百分比浓度为1(T15%的次氯酸钠消毒l(Tl5min后，用灭菌水清洗3 4次，将种子切开，加入液氮充分研磨成粉状； 取研磨后的样品8(Tl00mg，加入灭菌的提取液和苯酚各10(Tl20ul，充分涡旋，在冰水混合物中冰浴l(T20min，离心； 离心后吸取上清液，按每毫升上清液添加50(T600ul三氯甲烷/异戊醇混合液的比例在上清液中加入三氯甲烷/异戊醇混合液，充分涡旋，离心收集最上层的上清液，然后按每毫升上清液添加50(T600ul苯酚/三氯甲烷混合液的比例在上清液中加入苯酚/三氯甲烷混合液，再抽提一次，离心，收集上清液； 按每毫升上清液中添加Iml异丙醇的比例在上清液中加入预冷至_20°C的异丙醇，混匀静置5 10min，离心，弃上清液，加入r1.5ml质量百分比浓度为75%的乙醇清洗，离心弃去乙醇后，即得胶体状RNA，干燥5 10min后用焦磷酸二乙酯溶液溶解，检测浓度后置于-20°C备用。
2.根据权利要求1所述高效抽提茄科类种子RNA的方法，其特征在于:提取液包括1%的十二烷基肌氨酸钠、IOOmM 的 Tris-HCl、280mM 的 NaCl、10mM 的 EDTA、10ul/ml 的 ￠-巯基乙醇，提取液的PH值为8.5。
3.根据权利要求1所述高效抽提茄科类种子RNA的方法，其特征在于:三氯甲烷/异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为23: f 25:1。
4.根据权利要求1所述高效抽提茄科类种子RNA的方法，其特征在于:苯酚/三氯甲烷混合液中苯酚与三氯甲烷的体积比`为1:广1.2:1。
全文摘要
本发明公开了一种高效提取茄科类种子RNA的方法，该方法在于RNA抽提操作步骤难度较低、效率较高，此发明不仅可以用来抽提番茄等茄科类植物的新鲜种子，还可以抽提其干种子，它解决了常规方法提取茄科类种子时蛋白质残留量过高和RNA降解严重的难题，本发明方法可以直接用于抽提茄科类种子的RNA，具有技术易于掌握、应用性能高的优点。
文档编号C12N15/10GK103074330SQ20131005991
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者韩芹芹, 高凯, 宋玉竹, 张金阳 申请人:昆明理工大学