专利名称：一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及乳酸菌发酵领域，特别涉及一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法。
背景技术：
随着水产养殖业的迅猛发展，乳酸菌制剂以其天然、无毒、无副作用、无污染、无残留、安全可靠的优越性越来越受到重视。作为一种有益的净化水质的“生物修复剂”，乳酸菌制剂在水产养殖业的应用越来越受到重视，其应用于水产养殖业主要集中于拌料投喂、发酵饲料及作为EM菌主导菌在水体泼洒。其中拌料投喂、发酵饲料研究集中于乳酸菌在水产动物肠胃栖息，及调节动物肠道菌群结构和对饲料结构的改变。泼洒调节水质与乳酸菌可以调节养殖水体、改善养殖环境，抑制病原菌，抗病害，提高免疫力、促进动物生长有着密切的关系。这些应用与乳酸菌以下特性关系密切:首先，乳酸菌能很好适应水产养殖环境。水产养殖在养殖期间环境温度变动范围为20-35°C、盐度变动范围为0-38、pH值变动范围为6.9-8.7，在这三者变动范围内乳酸菌均能较好生长。其次，乳酸菌大部分的菌种属耐氧性厌氧菌，在无氧、低氧或高氧条件下均生长，不仅不与养殖动物竞争氧气，而且还能在溶氧量较低的水体中下层大量生长繁殖，抑制病原菌滋生。另外，乳酸菌在使用上不受时间限制，暴雨、阴天、晴天、高温条件下都可以使用。此外，乳酸菌作为一种最早使用的益生菌，与其它菌种相比，其菌体和代谢产物都为有益物，无毒素，实际应用中具有较高的安全性。这些乳酸菌在水产上的应用上的这些优势使得乳酸菌在水产方面有着广泛的应用和研究。
但是，目前大部分的乳酸菌类微生态制剂包被的产品价格昂贵，使用成本非常高；而乳酸菌类微生态制剂水剂产品相对较便宜，但是大多数产品很不稳定，活菌数较低，储存周期很短，而且运输成本较高；固体和液体乳酸菌类微生态制剂产品目前大多数采用发酵罐进行发酵，一方面生产工艺要求严格，需要专业的技术人员才能操作；另一方面，发酵罐的成本较高。发明内容
本发明提出了一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，解决了现有技术中的不足，是一种培养设备及操作都很简单，而且储存时间和单一菌株发酵水剂相比很稳定的乳酸菌微生态制剂的制备方法。
本发明的技术方案是这样实现的:
一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2-5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂。
进一步的，所述纯 化选育出的乳酸菌菌株为四株。
其中，所述的乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株若干株，经过两次分离纯化后待用；将分离纯化后的若干株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在30°C -37°C温度下培养46-50小时后吸取菌液在5000rpm下离心10-15min，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD543nm的吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，一般吸光度在0.8-1.2之间时，把所有的稀释菌液按相同的体积比3-5%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，30°C _37°C下静置培养24-48h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD543nm，选出8-12株的OD543nm测定值高的菌株，这个OD543nm测定值在0.5-1.0之间；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为24-48h，温度为30°C _37°C，选出计数结果高的菌株，最终选出四株乳酸菌菌株分别保种，一般计数结果的活菌数在109CFU/mL都可以进行保种。
上述MRS液体培养基的重量份组成为:大豆蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-0.6份，葡萄糖1.5-2.5份，磷酸氢二钾0.1-0.3份，乙酸钠0.3-0.7份，柠檬酸三铵0.1-0.3份，硫酸镁0.05-0.06份，硫酸锰0.02-0.03份，吐温0.05-0.15份，蒸馏水99-101份。
上述的含碳酸钙的MRS固体培养基是在MRS液体培养基中按蒸馏水的重量加入1.5-1.8%的琼脂粉和1-1.2%的碳酸钙。
其中，所述的将进行纯化选育后选出的四株乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液为:将四株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线，进行平板划线所用的培养基为MRS固体培养基，灭菌后冷却至44-46°C在超净台中倒入平板中，待平板冷却凝固后按10倍梯度稀释法进行平板涂布计数，并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的MRS液体培养基中进行扩大培养，在30 V -37 V下培养36h-48h，然后将四种培养液按体积比例10%，30%, 30%, 30%混合，然后接种于灭菌的MRS液体培养基中，接种量为5-20%，在30°C -37°C下混合培养24-48h获得复合种子液。
其中，所述的将复合种子液接种发酵为:将复合种子液接种到液体发酵培养基中，待搅拌均匀后密封在室温下发酵3-5天，在密封发酵过程中每天搅拌两次，并释放气体，同时在发酵过程中抽样1-2次，用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率，并且测定pH值，当活菌数到达5X 108CFU/mL，杂菌率兰5%，pH值在3.0-4.0的条件下停止发酵，即得复合型乳酸菌微生态制剂。
上述的液体发酵培养基的重量份组成为:蔗糖0.5-1份，酵母膏0.2-0.5份，乙酸钠0.2-0.5份，磷酸氢二钾0.05-1份，柠檬酸三铵0.1-0.5份，硫酸镁0.058-0.065份、硫酸锰0.020-0.025份，吐温0.05-0.1份，蒸馏水99-101份。
进一步的，上述的液体发酵培养基的重量份组成为:蔗糖0.8份，酵母膏0.4份，乙酸钠0.3份，磷酸氢二钾0.5份，柠檬酸三铵0.3份，硫酸镁0.06份、硫酸锰0.023份，吐温0.08份，蒸馏水100份。
上述液体发酵培养基的制备方法为:将酵母膏按比例加入自来水中蒸煮，待水开后继续蒸煮5分钟，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。
与现有技术相比， 本发明的有益效果是:
本发明从水产养殖动物肠道、养殖水体和底泥中筛选乳酸菌，通过不断地纯化，筛选到生长速度高，产酸能力强，温度适应范围宽的多株菌株进行复配发酵，发酵液含有比单菌株发酵更多的代谢产物及风味物质，通过复配发酵，菌株之间互相影响，形成的菌液稳定性更高，活性更好，储存时间更长。通过养殖试验发现，复合发酵液拌料对鱼类具有较好的诱食作用，同时提高养殖动物的免疫力。此外，用该复合乳酸菌发酵液泼洒养殖水体，发现对水质指标具有明显的改善作用，泼洒复合发酵液的氨氮的降低幅度是35.56%，而对照组的氨氮增加了 45.49%，而泼洒复合发酵液的亚硝酸盐的降低幅度是对照组的2倍。
(I)采用由多种不同来源形态不同的乳酸菌复配而成，形成了具有多样性、复杂而又稳定的乳酸菌群落，各个菌株能互利共存，优势互补，协同发挥作用，功能强大，在养殖水体中使用对水质指标的改善效果更好，是单一的乳酸菌制剂所无法实现的。
(2)本发明最大的特点是采用了简易的发酵设备，简易的发酵设备不但可以节约成本，而且操作简单。本发明没有采用目前广泛使用的发酵罐，而只是使用了塑料桶来发酵，没有复杂的发酵工序及操作说明，不但可以节约购买发酵罐的成本，而且在发酵过程中不需要加热，节约了电费；另外，该发酵工艺操作简单，对专业性操作知识要求较低，可以很好的为所有养殖用户所用。
(3)本发明的产品为水剂产品，但具有固体包被乳酸菌产品的稳定性且不需要喷雾干燥、包被等复杂工序及材料，在一定程度上节约了成本。
(4)本发明产品的代谢产物更加丰富。乳酸菌不是一个微生物分类学上的名称，细菌分类有数百个属，不同属甚至不同菌株之间的代谢产物都有较大的差异，所以共同发酵能够产生更加丰富的代谢产物，丰富的酶系、风味物质、有机酸、乳酸菌素等代谢产物使得产品的味道更好，营养更丰富。丰富的风味物质及有机酸使得在拌料使用时诱食效果更强，丰富的酶系可降解单一菌株没法降解的大分子蛋白质及产生更多的益生元，对养殖动物肠道的改善效果更佳。
(5)目前水剂乳酸菌制剂的最大的缺点是产品不稳定，长时间储存有益活菌数会迅速下降，导致使用效果不明显。而本产品的乳酸菌经过复配联合发酵，菌株之间互相影响，使得产品更加稳定，和一般的单菌株发酵液相比，储存时间至少延长30天。
(6)功 能更全面。根据资料及研究显示，乳酸菌在水产养殖中使用具有提高机体免疫力，促进养殖动物生长，抑制有害菌繁殖，促进藻类生长，降低氨氮亚盐，改善水质，降低水体有机物积累，减少耗氧的功能，但是一般来说单一的菌株发酵液只能发挥其中的一种功能，而复配产品菌株多，可以全面的发挥这些功能。
具体实施方式
下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1:
一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出三株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂:
(I)以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；
(2)将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出三株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株:
乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株，经过两次分离纯化后选出18株待用；将分离纯化后的18株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在32°C温度下培养46小时后吸取5ml菌液在5000rpm下离心15min，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD543mn的吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，当吸光度在1.1时，把所有的稀释菌液按相同的体积比例3%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，32°C下静置培养24h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD543nm,选出10株的OD543nm测定值高的菌株，这个OD543nm测定值在0.8时；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为·46h，温度为30°C，选出计数结果最高的菌株，最终选出三株乳酸囷囷株分别保种；
上述所用的MRS液体培养基的组成为:大豆蛋白胨lg，牛肉膏lg，酵母浸粉0.5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钾0.2g，乙酸钠0.5g，柠檬酸三铵0.2g，硫酸镁0.058g,硫酸锰0.025g,吐温 0.1g,蒸懼水 IOOg0
上述的含碳酸钙的MRS固体培养基是在MRS液体培养基中按蒸馏水的重量加入1.5%的琼脂粉和1.0%的碳酸钙；即:大豆蛋白胨lg，牛肉膏lg，酵母浸粉0.5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钾0.2g，乙酸钠0.5g，柠檬酸三铵0.2g，硫酸镁0.058g,硫酸锰0.025g,吐温0.lg，蒸懼水100g、琼脂粉1.5g、碳酸I丐1.0g。
(3)将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液:
将三株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线，进行平板划线所用的培养基为MRS固体培养基，灭菌后冷却至45°C在超净台中倒入平板中，待平板冷却凝固后按10倍梯度稀释法进行平板涂布计数，并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的MRS液体培养基中进行扩大培养，在32°C下培养36h，然后将三种培养液按体积比例20%，40%，40%混合，然后接种于灭菌的MRS液体培养基中，接种量为10%，在36°C下混合培养46h获得复合种子液；
(4)将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂:
将复合种子液接种到液体发酵培养基中，待搅拌均匀后密封在室温下发酵3.5天，在密封发酵过程中每天搅拌两次，并释放气体，同时在发酵过程中抽样2次，用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率，并且测定pH值，当活菌数到达5 X 108CFU/mL，杂菌率=5%，PH值在3.5的条件下停止发酵，即得复合型乳酸菌微生态制剂。
上述的液体发酵培养基的组成为:蔗糖0.5g，酵母膏0.3g，乙酸钠0.2g，磷酸氢二钾0.08g,柠檬酸三铵0.2g，硫酸镁0.06g、硫酸锰0.02g,吐温0.08g,蒸馏水IOOgo
上述液体发酵培养基的制备方法为:先将酵母膏加入自来水中蒸煮，待水开后继续蒸煮5分钟，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。
实施例2:
—种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出四株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂:
(I)以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；
(2)将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出四株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株:
乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株，经过两次分离纯化后选出20株待用；将分离纯化后的20株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在37°C温度下培养48小时后吸取5ml菌液在5000rpm下离心lOmin，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD543mn的吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，当吸光度在0.8时，把所有的稀释菌液按相同的体积比例5%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，36°C下静置培养48h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD543nm,选出12株的OD543nm测定值高的菌株，这个OD543nm测定值在0.6时；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为28h，温度为35°C，选出计数结果最高的菌株，最终选出四株乳酸囷囷株分别保种；
上述所用的MRS液体培养基的组成为:大豆蛋白胨1.5g，牛肉膏0.5g，酵母浸粉0.3g，葡萄糖1.5g，磷酸氢二钾0.1g,乙酸钠0.3g，柠檬酸三铵0.3g，硫酸镁0.052g,硫酸锰0.023g，吐温 0.05g,蒸馏水 99g。
上述的含碳酸钙的MRS固体培养基是在MRS液体培养基中按蒸馏水的重量加入1.8%的琼脂粉和1.1% 的碳酸钙；即:大豆蛋白胨1.5g，牛肉膏0.5g，酵母浸粉0.3g，葡萄糖1.5g，磷酸氢二钾0.1g,乙酸钠0.3g，柠檬酸三铵0.3g，硫酸镁0.052g，硫酸猛0.023g,吐温0.05g,蒸馏水99g、琼脂粉1.782g、碳酸钙1.089g。
(3)将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液:
将四株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线，进行平板划线所用的培养基为MRS固体培养基，灭菌后冷却至44°C在超净台中倒入平板中，待平板冷却凝固后按10倍梯度稀释法进行平板涂布计数，并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的MRS液体培养基中进行扩大培养，在36°C下培养46h，然后将四种培养液按体积比例10%，30%, 30%, 30%混合，然后接种于灭菌的MRS液体培养基中，接种量为15%，在35°C下混合培养36h获得复合种子液；
(4)将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂:
将复合种子液接种到液体发酵培养基中，待搅拌均匀后密封在室温下发酵4天，在密封发酵过程中每天搅拌两次，并释放气体，同时在发酵过程中抽样2次，用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率，并且测定pH值，当活菌数到达5 X 108CFU/mL，杂菌率=5%，pH值在4.0的条件下停止发酵，即得复合型乳酸菌微生态制剂。
上述的液体发酵培养基的组成为:蔗糖0.Sg,酵母膏0.4g，乙酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.5g，柠檬酸三铵0.3g，硫酸镁0.06g、硫酸锰0.023g,吐温0.08g,蒸馏水IOOgo
上述液体发酵培养基的制备方法为:先将酵母膏加入自来水中蒸煮，待水开后继续蒸煮5分钟，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。
实施例3:
一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出五株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂:
(I)以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；
(2)将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出五株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株:
乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株，经过两次分离纯化后选出22株待用；将分离纯化后的22株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在35°C温度下培养50小时后吸取5ml菌液在5000rpm下离心12min，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD543mn的吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，当吸光度在0.9时，把所有的稀释菌液按相同的体积比例4%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，35 0C下静置培养36h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD543nm,选出8株的OD543nm测定值高的菌株，这个OD543nm测定值在1.0时；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为28h，温度为35°C，选出计数结果最高的菌株，最终选出五株乳酸囷囷株分别保种；
上述所用的MRS液体培养基的组成为:大豆蛋白胨0.8g，牛肉膏0.8g，酵母浸粉0.4g，葡萄糖2.5g，磷酸氢二钾0.1g,乙酸钠0.1g,柠檬酸三铵0.1g,硫酸镁0.052g,硫酸锰0.03g,吐温 0.12g,蒸懼水 IOlg0
上述的含碳酸钙的MRS固体培养基是在MRS液体培养基中按蒸馏水的重量加入1.6%的琼脂粉和1.1%的碳酸钙；即大豆蛋白胨0.Sg，牛肉膏0.Sg，酵母浸粉0.4g，葡萄糖2.5g，磷酸氢二钾0.1g,乙酸钠0.7g，柠檬酸三铵0.lg，硫酸镁0.052g，硫酸锰0.03g,吐温0.12g，蒸馏水101g、琼脂粉1.616g、碳酸钙1.lllg。
(3)将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液:
将五株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线，进行平板划线所用的培养基为MRS固体培养基，灭菌后冷却至46 °C在超净台中倒入平板中，待平板冷却凝固后按10倍梯度稀释法进行平板涂布计数，并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的MRS液体培养基中进行扩大培养，在36°C下培养40h，然后将五种培养液按体积比例12%，22%，22%，22%，22%混合，然后接种于灭菌的MRS液体培养基中，接种量为20%，在33°C下混合培养24h获得复合种子液；
(4)将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂:
将复合种子液接种到液体发酵培养基中，待搅拌均匀后密封在室温下发酵3天，在密封发酵过程中每天搅拌两次，并释放气体，同时在发酵过程中抽样2次，用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率，并且测定pH值，当活菌数到达5 X 108CFU/mL，杂菌率=5%，pH值在3.0的条件下停止发酵，即得复合型乳酸菌微生态制剂。
上述的液体发酵培养基的组成为:蔗糖1.0g,酵母膏0.5g，乙酸钠0.5g，磷酸氢二钾0.8g，柠檬酸三铵0.5g，硫酸镁0.065g、硫酸锰0.025g,吐温0.lg，蒸馏水IOlgo
上述液体发酵培养基的制备方法为:先将酵母膏加入自来水中蒸煮，待水开后继续蒸煮5分钟，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:它以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2-5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂。
2.根据权利要求1所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述纯化选育出的乳酸菌菌株为四株。
3.根据权利要求2所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述的乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株若干株，经过两次分离纯化后待用；将分离纯化后的若干株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在300C _37°C温度下培养46-50小时后吸取菌液在5000rpm下离心10_15min，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD543nmW吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，把所有的稀释菌液按相同的体积比3-5%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，30°C _37°C下静置培养24_48h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD543nm，选出的OD543nm测定值高的菌株；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为24-48h，温度为300C _37°C，选出计数结果高的菌株，最终选出4株乳酸菌菌株分别保种。
4.根据权利要求3所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述MRS液体培养基的重量份组成为:大豆蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-0.6份，葡萄糖1.5-2.5份，磷酸氢二钾0.1-0.3份，乙酸钠0.3-0.7份，柠檬酸三铵0.1-0.3份，硫酸镁0.05-0.06份，硫酸锰0.02-0.03份，吐温0.05-0.15份，蒸馏水99-101份。
5.根据权利要求4所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述的含碳酸钙的MRS固体培养基是在MRS液体培养基中按蒸馏水的重量加入1.5-1.8%的琼脂粉和1_1.2%的碳酸隹丐 。
6.根据权利要求2所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述的将进行纯化选育后选出的四株乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液为:将四株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线，挑取单菌落接入灭菌的MRS液体培养基中进行扩大培养，在30°C _37°C下培养36h-48h，然后将四种培养液按体积比例10%，30%, 30%, 30%混合，然后接种于灭菌的MRS液体培养基中，接种量为5-20%，在30°C _37°C下混合培养24_48h获得复合种子液。
7.根据权利要求6所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述平板划线所用的培养基为MRS固体培养基。
8.根据权利要求2所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述的将复合种子液接种发酵为:将复合种子液接种到液体发酵培养基中，待搅拌均匀后密封在室温下发酵3-5天，在密封发酵过程中每天搅拌两次，并释放气体，同时在发酵过程中抽样1-2次，用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率，并且测定pH值，当活菌数到达5X108CFU/mL,杂菌率=5%，pH值在3.0-4.0的条件下停止发酵，即得复合型乳酸菌微生态制剂。
9.根据权利要求8所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述液体发酵培养基的重量份组成为:蔗糖0.5-1份，酵母膏0.2-0.5份，乙酸钠0.2-0.5份，磷酸氢二钾0.05-1份，柠檬酸三铵0.1-0.5份，硫酸镁0.058-0.065份、硫酸锰0.020-0.025 份，吐温 0.05-0.1 份，蒸馏水 99-101 份。
10.根据权利要求9所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述液体发酵培养基的重量份组成为:蔗糖0. 8份，酵母膏0.4份，乙酸钠0.3份，磷酸氢二钾·0.5份，柠檬酸三铵0.3份，硫酸镁0.06份、硫酸锰0.023份，吐温·0.08份，蒸馏水100份。
全文摘要
本发明提出了一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法，属于乳酸菌发酵领域。它以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2-5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂，与现有技术相比，本发明的有益效果是它是一种培养设备及操作都很简单，而且储存时间和单一菌株发酵水剂相比很稳定的乳酸菌微生态制剂的制备方法。
文档编号C12N1/20GK103146611SQ20131008067
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者薛爱琴, 罗国强, 苏艳秋, 顾继锐 申请人:通威股份有限公司