一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法
【专利摘要】本发明提供了一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法，包括步骤：Q1：原生质体的制备;Q2：原生质体的再生；Q3：原生质体的紫外诱变；Q4：将制备好的原生质体悬液按照下列步骤进行离子注入诱变处理；Q5：分别以Q3步骤处理完成和Q4步骤处理培养长出的菌落作为具有不同遗传背景的亲本，进行基因组改组处理；Q6：杂合再生子代菌丝体的培养；Q7：杂合子代原生质体制备及原生质体融合;Q8：子代原生质体多轮融合与再生:按照上述Q1-Q7进行后继子代的多轮反复融合与再生,筛选得到了柔红霉素产量得到大幅提高的突变株。
【专利说明】一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程制药【技术领域】，特别涉及一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方 法。
【背景技术】
[0002] 蒽环类抗生素 （Anthracycl ines )是一类重要的抗肿瘤药物，它们均由蒽环酮的发 色团通过糖苷键和一种或几种不同的糖连接而成。大多数蒽环类的抗生素具有很强的骨髓 抑制和心脏毒性而不能应用于临床，只有柔红霉素-阿霉素型蒽环类抗生素成为临床上最 有应用价值的抗肿瘤药物，包括柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、洋红霉素等。柔红霉素在临床 上主要用以治疗急性白血病,对急性淋巴细胞性白血病和急性粒细胞性白血病，柔红霉素 可作为首选药物，柔红霉素还可以治疗淋巴肉瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤等。
[0003] 柔红霉素（Daunorubicin，DNR)，又称道诺霉素（Daunomycin)，是某些链霉 菌的次级代谢产物，例如波赛链霉菌（Streptomyces peucetius)，天蓝淡红链霉菌 (S. coeruleorubidus)，灰色链霉菌，链霉菌C5等等。目前工业上采用微生物发酵法生产柔 红霉素，国外主要使用的菌种是波赛链霉菌；国内主要使用的是正定变种HB1482。
[0004] 由于柔红霉素是具有细胞毒性的抗肿瘤抗生素，初始的柔红霉素产生菌的发酵单 位一般较低，导致生产成本很高，并不能立即作为工业化生产用菌。对柔红霉素产生菌进行 包括分子育种、常规诱变育种在内的选育工作，是提高柔红霉素发酵产量、降低生产成本的 最有效的途径之一。
[0005] 为了提高柔红霉素产生菌的发酵产量，国内外研究者做了大量研究工作。如采用 柔红霉素筛选耐受菌株以提高菌株的蒽环类抗生素的产抗能力（斯图兹曼·恩格沃，《链 霉菌的次生代谢调控及柔红霉素的产生》《细菌学杂志》，刊号：1992, 174,页数：144-154) 携带dnrl基因的高拷贝表达质粒转化野生型柔红霉素产生菌，提高转化子的柔红霉素产 抗水平；以SIPI1482为出发菌株，采用紫外诱变和自身耐药等复合处理，获得高产突变株 SIPI-89068,其发酵产柔红霉素产量水平提高了 3-4倍(李莉，许文思，《柔红霉素产生菌 SIPI89068的选育及发酵》，《中国抗生素》杂志，刊号：1993, 18(4):页数：306-307)等。
[0006] 由于抗肿瘤抗生素产生菌的菌种选育有相当大的难度，通过上述工作，不同菌种 的柔红霉素发酵产量虽然有了不同程度的提高，但与其他种类的抗生素发酵水平相比，仍 然有相当大的差距。
[0007] 近年来随着分子生物学的快速发展，在单个基因水平、基因组水平对柔红霉素的 生物合成途径等有了越来越多的认识，使组合利用新技术及传统诱变手段对柔红霉素产生 菌进行菌种选育，进而获得高产柔红霉素菌种成为可能。
【发明内容】
[0008] 针对现有柔红霉素发酵产量不高的上述缺陷和问题，本发明实施例的目的是提供 一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法，通过紫外诱变，离子注入诱变，结合基因组改组，获 得高产柔红霉素的菌种。
[0009] 为了达到上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
[0010] 一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，包括以下步骤：
[0011] Q1 :原生质体的制备，包括以下分步骤：
[0012] Q11 :取培养菌丝体，以5000-7000转/分钟的速率，离心5-8分钟后得沉淀，加生 理盐水进行洗涤，再次离心后弃澄清部分,并以漩涡振荡的方式分散菌丝体；
[0013] Q12 :在Q11步骤中处理后的悬浮菌丝体中加入生理盐水，再加入溶菌酶溶液，用 移液枪吹吸5次混匀后，于30°水浴中进行酶解，每隔10分钟，用移液器吹吸3次，90分 钟后终止酶解；
[0014] Q13 :以2000转/分钟的速率，离心5分钟上述Q12步骤结束后的处理液，使残留 的菌丝断片沉于管底，取上部澄清部分，即为原生质体悬浮液，转移到另一灭菌离心管中备 用，并以3000转/分钟的速率，离心10分钟该原生质体悬浮液，温和地去除溶菌酶液，沉淀 出原生质体；
[0015] Q14 :取Q13步骤中沉淀出原生质体部分，轻轻震荡离心管，使原生质体分散开成 原生质体悬浮液，加生理盐水进行稀释并对原生质体计数，使原生质体的浓度为1〇〇个/毫 升；
[0016] Q2 :原生质体的再生，包括以下分步骤：
[0017] Q21 :取0. Q14步骤中得到的原生质体悬液，与25ml-50ml软琼脂混合均 匀，倾倒于R2YE平板上层的培养基中；
[0018] Q22 :另取一 R2YE平板，盖住Q21步骤中的R2YE平板，将双层培养基平板于28° 倒置培养；
[0019] Q3 :原生质体的紫外诱变，包括以下分步骤：
[0020] Q31 :将按照Q14步骤制备好、稀释好浓度的原生质体悬液进行紫外诱变：
[0021] Q311 :紫外线照射强度为10-25W，200-350nm，光源距离保持30cm不变，一次性持 续紫外照射时间分别为30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟；
[0022] Q312 :保持紫外线照射强度15W，254nm，照射距离分别设置为10cm、2〇Cm、3〇Cm、 40cm、50cm，每个距离的照射时间均为3分钟；
[0023] Q32:完成后，按照Q2步骤，28°的培养环境下，避光培养5天-10天时间；
[0024] Q4:离子注入诱变处理：将按照Q14步骤制备好的原生质体悬液按照下列步骤进 行离子注入诱变处理：
[0025] Q41 :将孢子悬浮液均匀涂布于玻璃片上，自然风干表面水分；
[0026] Q42 :以N+作为辐射致变剂，辐射室的真空度：10_3Pa，离子能量：65kev，辐射处理 的剂量率1015N+/秒，总辐射剂量为l*1015N+/cm 2 ;
[0027] Q43:处理后，用生理盐水将玻璃片上的孢子洗脱，对洗脱的孢子液进行梯度稀释， 分别取稀释10倍-50倍数的孢子液均匀地涂布在高氏一号培养基筛选平皿上，30°C培养10 天；
[0028] Q5 :分别以Q3步骤处理完成和Q4步骤处理培养长出的菌落作为具有不同遗传背 景的亲本，进行下列基因组改组处理：
[0029] Q51 :分别对上述不同遗传背景的亲本进行原生质体制备，即重复步骤1的方法步 骤，然后将处理后的两部分原生质体混合；
[0030] Q52 :以3000转/分钟的速率，在离心机中，离心上述混合液10分钟，弃上部澄清 液；
[0031] Q53:将上一步骤得到的沉淀中加入生理盐水，静置产生分层后得到的沉淀物质， 再次以3000转/分钟的速率，离心10分钟，弃去上部澄清液；
[0032] Q54 :于得到的沉淀中缓慢加入500 μ ml溶解在生理盐水中的、浓度为65%的PEG 溶液，室温静置1分钟；
[0033] Q55 :加入500 μ ml生理盐水，并以3000转/分钟的速率，离心10分钟，弃去上部 澄清液；
[0034] Q56 :重复一次 Q55 ;
[0035] Q57 :将上一步骤得到的沉淀中加入生理盐水，再与4毫升软琼脂混合，迅速倾倒 于R2YE平板上，在28°中进行培养；
[0036] Q6 :杂合再生子代菌丝体的培养：
[0037] 将Q5步骤中于R2YE培养基中长出的菌落，用接种铲刮下，接种于YEME培养基中， 28°的培养环境中培养三天，再按10%的接种量接种于含0. 5%甘氨酸的YEME培养基中，继 续在28°的培养环境中培养24小时；
[0038] Q7 :杂合子代原生质体制备及原生质体融合：
[0039] Q71 :将步骤Q6完成的杂合子代菌丝体，重复一遍步骤Q1，完成制备新的原生质 体；
[0040] Q72 :按步骤Q57的方法进行原生质体融合，即在上述原生质体沉淀中加入PEG溶 液，进行原生质体融合，并与软琼脂混合，倾注于R2YE平板上，在28°的培养环境中长出的 菌落即为第二轮融合后的再生群体；
[0041] Q8 :子代原生质体多轮融合与再生：按照上述Q1-Q7进行后继子代的多轮反复融 合与再生。
[0042] 作为上述技术方案的优选，所述Q21步骤中，培养基的成分为：蔗糖、葡萄糖、酵母 抽提物、氯化镁、水解酪蛋白、硫酸钾、TES、微量元素。
[0043] 作为上述技术方案的优选，所述Q21步骤中，培养基中各成分的含量为：蔗 糖103g/L ;葡萄糖10g/L ;酵母抽提物5g/L ;氯化镁10g/L ;水解酪蛋白0. lg/L ;硫酸 钾0· 25g/L ;TES6. Og/L ;微量元素200微升/L，微量元素的成分为：Na2B407 · 10H20 : 10mg/100ml, ZnCl2 ：40mg/100ml, (NH4) 6M07024 · 4H20 ：10mg/100ml, FeCl3 · 6H20 ： 200mg/100ml,MnCl2 · 4H20 ：10mg/100ml, CuCl2 · 2H20 ： lOmg/lOOml 〇
[0044] 作为上述技术方案的优选，所述Q4步骤中，孢子悬液的制备方法为：
[0045] 在孢子生长良好的新鲜平板上加入生理盐水，用扁头竹签轻轻地刮下孢子，移入 装有灭菌玻璃珠的三角摇瓶，于室温环境中，旋转振荡10分钟；
[0046] 将上述溶液移入无菌的、装有脱脂棉的玻璃注射器中进行过滤；
[0047] 将滤液于离心机中，以3, 000转/分钟的速率，离心10分钟以沉淀孢子；
[0048] 弃去上部澄清液，用适量生理盐水洗涤一次后，在离心机中再次进行离心，再次弃 上部澄清液，并加入生理盐水悬浮孢子。
[0049] 作为上述技术方案的优选，所述Q4步骤中，高氏一号培养基的成分为：可溶性淀 粉20g/L，氯化钠0. 5g/L，硝酸钾lg/L，七水硫酸镁0. 5g/L，磷酸氢二钾0. 5g/L，硫酸亚铁 0· 01g/L，琼脂粉 2%，调节 pH 至 7. 0-7. 2。
[0050] 作为上述技术方案的优选，所述Q6步骤中，YEME培养基的成分为：酵母抽提物、 麦芽抽提物、蔗糖、聚胨、葡萄糖。
[0051] 作为上述技术方案的优选，所述Q6步骤中，YEME培养基进行高温灭菌后，加入六 水氯化镁进行稀释。
[0052] 同时，本发明尝试提供一种盐酸柔红霉素菌种，其特征在于，该菌种是通过Q1-Q8 的方法而产生得到的。
[0053] 本发明实施例提供的一种盐酸柔红霉素菌种及其高产方法，对柔红霉素产生菌进 行原生质体紫外诱变及离子注入诱变，获得具有不同遗传性状的突变体，使用上述突变体 作为亲本，进行基因组改组，对子代原生质体进行多轮融合与再生，筛选得到了柔红霉素产 量得到大幅提高的突变株。
[0054] 保藏说明
[0055] 本发明所涉及要求保护的盐酸柔红霉素菌种，其保藏信息为：
[0056] 保藏地址：中国?湖北省·武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院
[0057] 保藏单位：中国典型培养物保藏中心 分类命名： 天蓝淡红链霉菌ST-1 Streptomyces coeruleorubidus ST-1
[0058] 保藏单位简称：CCTCC
[0059] 保藏日期：2012. 04. 22
[0060] 保藏中心编号：CCTCC N0.M2012133
【具体实施方式】
[0061] 下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本 发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在 没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0062] 本发明申请中提及或涉及的基因组（Genome)-般的定义是单倍体细胞中的全套 染色体为一个基因组。
[0063] 实施例1
[0064] 步骤Q1 :原生质体的制备，包括以下分步骤：
[0065] Q11 :取培养菌丝体（ATCC31276)，以8000转/分钟的速率，离心5分钟后得沉淀， 加生理盐水进行洗涤，再次离心后弃澄清部分,并以漩涡振荡的方式分散菌丝体；
[0066] Q12 :在Q11步骤中处理后的悬浮菌丝体中加入lml生理盐水，用来悬浮菌丝体，再 加入0. 2ml溶菌酶溶液，用移液枪吹吸5次混匀后，于30°水浴中进行酶解，每隔10分钟， 用移液器吹吸3次，90分钟后终止酶解；
[0067] Q13 :以2000转/分钟的速率，离心5分钟上述Q12步骤结束后的处理液，使残留 的菌丝断片沉于管底，取上部澄清部分，即为原生质体悬浮液，转移到另一灭菌离心管中备 用，并以3000转/分钟的速率，离心10分钟该原生质体悬浮液，温和地去除溶菌酶液，沉淀 出原生质体；
[0068] Q14 :取Q13步骤中沉淀出原生质体部分，轻轻震荡离心管，使原生质体分散开成 原生质体悬浮液，加生理盐水进行稀释并对原生质体计数，使原生质体的浓度为1〇〇个/毫 升。
[0069] 实施例2
[0070] 步骤Q2 :原生质体的再生，包括以下分步骤：
[0071] Q21 :取0. 5ml Q14步骤中得到的原生质体悬液，与25ml软琼脂混合均匀，倾倒于 R2YE平板上层的培养基中；
[0072] Q22 :另取一 R2YE平板，盖住Q21步骤中的R2YE平板，将双层培养基平板于28° 倒置培养。
[0073] 其中，培养基的成分为：蔗糖、葡萄糖、酵母抽提物、氯化镁、水解酪蛋白、硫酸钾、 TES、微量元素，培养基中各成分的含量为：蔗糖103g/L ;葡萄糖10g/L ;酵母抽提物5g/L ; 氯化镁l〇g/L ;水解酪蛋白0· lg/L ;硫酸钾0· 25g/L ;TES6. Og/L ;微量元素200微升/L， 微量元素的成分为：Na2B407 · 10H20 :10mg/100ml，ZnCl2 :40mg/100ml，（ΝΗ4)6Μ07024 · 4H20 : 10mg/100ml,FeCl3 *6H20 ：200mg/100ml, MnCl2 *4H20 ：lOmg/lOOml, CuCl2 *2H20 ：10mg/100mL·
[0074] 实施例3
[0075] 步骤Q3 :原生质体的紫外诱变，包括以下分步骤：
[0076] Q31 :将按照Q14步骤制备好、稀释好浓度的原生质体悬液进行紫外诱变：
[0077] Q311 :紫外线照射强度为15W，254nm，光源距离保持30cm不变，一次性持续紫外照 射时间分别为30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟；
[0078] Q312 :保持紫外线照射强度15W，254nm，照射距离分别设置为10cm、2〇Cm、3〇Cm、 40cm、50cm，每个距离的照射时间均为3分钟；
[0079] Q32:完成后，按照Q2步骤，28°的培养环境下，避光培养7天时间。
[0080] 实施例4
[0081] 步骤Q4:离子注入诱变处理：将按照Q14步骤制备好的原生质体悬液按照下列步 骤进行离子注入诱变处理：
[0082] Q41 :将孢子悬浮液均匀涂布于玻璃片上，自然风干表面水分；
[0083] Q42 :以N+作为辐射致变剂，辐射室的真空度：10_3Pa，离子能量：65kev，辐射处理 的剂量率1015N+/秒，总辐射剂量为l*1015N+/cm2 ;
[0084] Q43:处理后，用生理盐水将玻璃片上的孢子洗脱，对洗脱的孢子液进行梯度稀释， 分别取稀释10倍-50倍数的孢子液均匀地涂布在高氏一号培养基筛选平皿上，30°C培养10 天；
[0085] 其中孢子悬液的制备方法为：
[0086] 在孢子生长良好的新鲜平板上加入适量的生理盐水，用扁头竹签轻轻地刮下孢 子，移入装有灭菌玻璃珠的三角摇瓶，于室温环境中，旋转振荡10分钟；
[0087] 将上述溶液移入无菌的、装有脱脂棉的玻璃注射器中进行过滤；
[0088] 将滤液于离心机中，以3, 000转/分钟的速率，离心10分钟以沉淀孢子；
[0089] 弃去上部澄清液，用适量生理盐水洗涤一次后，在离心机中再次进行离心10分 钟，再次弃去上部澄清液，并加入生理盐水以悬浮孢子。
[0090] 其中高氏一号培养基的成分为：
[0091] 可溶性淀粉20g/L，氯化钠0. 5g/L，硝酸钾lg/L，七水硫酸镁0. 5g/L，磷酸氢二钾 〇· 5g/L，硫酸亚铁(λ 01g/L，琼脂粉2%，调节pH至L 0-7. 2。
[0092] 实施例5
[0093] 步骤Q5 :分别以Q3步骤处理完成和Q4步骤处理培养长出的菌落作为具有不同遗 传背景的亲本，进行下列基因组改组处理：
[0094] Q51 :分别对上述不同遗传背景的亲本进行原生质体制备，即重复步骤1的方法步 骤，然后将处理后的两部分原生质体混合；
[0095] Q52 :以3000转/分钟的速率，在离心机中，离心上述混合液10分钟，弃上部澄清 液；
[0096] Q53 :将上一步骤得到的沉淀中加入生理盐水，静置产生分层后得到的沉淀物质， 再次以3000转/分钟的速率，离心10分钟，弃去上部澄清液；
[0097] Q54 :于得到的沉淀中缓慢加入500 μ ml溶解在生理盐水中的、浓度为65%的PEG 溶液，室温静置1分钟，使原生质体充分融合；
[0098] Q55 :加入500 μ ml生理盐水，并以3000转/分钟的速率，离心10分钟，弃去上部 澄清液；
[0099] Q56:重复一次 Q55;
[0100] Q57 :将上一步骤得到的沉淀中加入生理盐水，再与4毫升软琼脂混合，迅速倾倒 于R2YE平板上，在28°中进行培养。
[0101] 实施例6
[0102] 步骤Q6 :杂合再生子代菌丝体的培养：
[0103] 将Q5步骤中于R2YE培养基中长出的菌落，用接种铲刮下，接种于YEME培养基中， 28°的培养环境中培养三天，再按10%的接种量接种于含0. 5%甘氨酸的YEME培养基中，继 续在28°的培养环境中培养24小时；
[0104] YEME培养基的配置：
[0105] 酵母抽提物3g/L ;麦芽抽提物3g/L ;蔗糖340g/L ;聚胨5g/L ;葡萄糖10g/L，高温 灭菌后加入六水氯化镁至终浓度为5毫摩尔/升。
[0106] 实施例7
[0107] 步骤Q7 :杂合子代原生质体制备及原生质体融合：
[0108] Q71 :将步骤Q6完成的杂合子代菌丝体，重复一遍步骤Q1，完成制备新的原生质 体；
[0109] Q72 :按步骤Q57的方法进行原生质体融合，即在上述原生质体沉淀中加入PEG溶 液，进行原生质体融合，并与软琼脂混合，倾注于R2YE平板上，在28°的培养环境中长出的 菌落即为第二轮融合后的再生群体；
[0110] 实施例8
[0111] Q8 :子代原生质体多轮融合与再生：
[0112] 按照上述Q1-Q7进行后继子代的多轮反复融合与再生。
[0113] 按照上述方法进行后继子代的多轮反复融合与再生，不同的融合再生子代可以标 记为 F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8?··
[0114] 诱变改组后高产菌株与出发菌株产柔红霉素能力比较如下：
[0115] 1)对出发菌株和诱变改组得到的子代F1至F8代进行发酵；
[0116] 2)高效液相色谱检测发酵液中柔红霉素的方法：
[0117] 检测柱：Eel ipse XDB-C18, 250mm x4. 6mm, 5micrometri
[0118] 柱温：室温
[0119] 流速：lml/min
[0120] 检测波长：UV lamp254nm
[0121] 方法：梯度洗脱
[0122]
【权利要求】
1. 一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，其特征在于，包括以下步骤： Q1 :原生质体的制备，包括以下分步骤： Q11 :取培养菌丝体，以5000-7000转/分钟的速率，离心5-8分钟后得沉淀，加生理盐 水进行洗涤，再次离心后弃澄清部分，并以漩涡振荡的方式分散菌丝体； Q12 :在Q11步骤中处理后的悬浮菌丝体中加入生理盐水，再加入溶菌酶溶液，用移液 枪吹吸5次混匀后，于30°水浴中进行酶解，每隔10分钟，用移液器吹吸3次，90分钟后终 止酶解； Q13 :以2000转/分钟的速率，离心5分钟上述Q12步骤结束后的处理液，使残留的菌 丝断片沉于管底，取上部澄清部分，即为原生质体悬浮液，转移到另一灭菌离心管中备用， 并以3000转/分钟的速率，离心10分钟该原生质体悬浮液，温和地去除溶菌酶液，沉淀出 原生质体； Q14 :取Q13步骤中沉淀出原生质体部分，轻轻震荡离心管，使原生质体分散开成原生 质体悬浮液，加生理盐水进行稀释并对原生质体计数，使原生质体的浓度为100个/毫升； Q2 :原生质体的再生，包括以下分步骤： Q21 :取0. Q14步骤中得到的原生质体悬液，与25ml-50ml软琼脂混合均匀，倾 倒于R2YE平板上层的培养基中； Q22 :另取一 R2YE平板，盖住Q21步骤中的R2YE平板，将双层培养基平板于28°倒置 培养； Q3 :原生质体的紫外诱变，包括以下分步骤： Q31 :将按照Q14步骤制备好、稀释好浓度的原生质体悬液进行紫外诱变： Q311 :紫外线照射强度为10-25W，200-350nm，光源距离保持30cm不变，一次性持续紫 外照射时间分别为30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟； Q312 :保持紫外线照射强度15W，254nm，照射距离分别设置为10cm、20cm、30cm、40cm、 50cm，每个距离的照射时间均为3分钟； Q32:完成后，按照Q2步骤，28°的培养环境下，避光培养5天-10天时间； Q4:离子注入诱变处理：将按照Q14步骤制备好的原生质体悬液按照下列步骤进行离 子注入诱变处理： Q41 :将孢子悬浮液均匀涂布于玻璃片上，自然风干表面水分； Q42 :以N+作为辐射致变剂，辐射室的真空度：l(T3Pa，离子能量：65kev，辐射处理的剂 量率1015N+/秒，总辐射剂量为l*1015N+/cm2 ; Q43 :处理后，用生理盐水将玻璃片上的孢子洗脱，对洗脱的孢子液进行梯度稀释，分别 取稀释10倍-50倍数的孢子液均匀地涂布在高氏一号培养基筛选平皿上，30°C培养10天； Q5 :分别以Q3步骤处理完成和Q4步骤处理培养长出的菌落作为具有不同遗传背景的 亲本，进行下列基因组改组处理： Q51 :分别对上述不同遗传背景的亲本进行原生质体制备，即重复步骤1的方法步骤， 然后将处理后的两部分原生质体混合； Q52 :以3000转/分钟的速率，在离心机中，离心上述混合液10分钟，弃上部澄清液； Q53 :将上一步骤得到的沉淀中加入生理盐水，静置产生分层后得到的沉淀物质，再次 以3000转/分钟的速率，离心10分钟，弃去上部澄清液； Q54 :于得到的沉淀中缓慢加入500 μ ml溶解在生理盐水中的、浓度为65%的PEG溶液， 室温静置1分钟； Q55 :加入500 μ ml生理盐水，并以3000转/分钟的速率，离心10分钟，弃去上部澄清 液； Q56 :重复一次Q55 ; Q57 :将上一步骤得到的沉淀中加入生理盐水，再与4毫升软琼脂混合，迅速倾倒于 R2YE平板上，在28°中进行培养； Q6 :杂合再生子代菌丝体的培养： 将Q5步骤中于R2YE培养基中长出的菌落，用接种铲刮下，接种于YEME培养基中，28 ° 的培养环境中培养三天，再按10%的接种量接种于含〇. 5%甘氨酸的YEME培养基中，继续在 28°的培养环境中培养24小时； Q7 :杂合子代原生质体制备及原生质体融合： Q71 :将步骤Q6完成的杂合子代菌丝体，重复一遍步骤Q1，完成制备新的原生质体； Q72 :按步骤Q57的方法进行原生质体融合，即在上述原生质体沉淀中加入PEG溶液，进 行原生质体融合，并与软琼脂混合，倾注于R2YE平板上，在28°的培养环境中长出的菌落 即为第二轮融合后的再生群体； Q8 :子代原生质体多轮融合与再生：按照上述Q1-Q7进行后继子代的多轮反复融合与 再生。
2. 根据权利要求1所述的一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，其特征在于，所述Q21步 骤中，培养基的成分为：蔗糖、葡萄糖、酵母抽提物、氯化镁、水解酪蛋白、硫酸钾、TES、微量 元素。
3. 根据权利要求2所述的一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，其特征在于，所述Q21 步骤中，培养基中各成分的含量为：蔗糖l〇3g/L ;葡萄糖10g/L ;酵母抽提物5g/L ;氯化 镁10g/L ;水解酪蛋白0· lg/L ;硫酸钾0· 25g/L ;TES6. Og/L ;微量元素200微升/L，微 量元素的成分为：Na2B407 · 10H20 :10mg/100ml，ZnCl2 :40mg/100ml，（ΝΗ4)6Μ07024 · 4H20 : lOmg/lOOml，FeCl3·6Η20 :200mg/100ml，MnCl2·4Η20 :10mg/100ml，CuCl2·2Η20 :10mg/100ml。
4. 根据权利要求1所述的一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，其特征在于，所述Q4步 骤中，孢子悬液的制备方法为： 在孢子生长良好的新鲜平板上加入生理盐水，用扁头竹签轻轻地刮下孢子，移入装有 灭菌玻璃珠的三角摇瓶，于室温环境中，旋转振荡10分钟； 将上述溶液移入无菌的、装有脱脂棉的玻璃注射器中进行过滤； 将滤液于离心机中，以3, 000转/分钟的速率，离心10分钟以沉淀孢子； 弃去上部澄清液，用适量生理盐水洗涤一次后，在离心机中再次进行离心，再次弃上部 澄清液，并加入生理盐水悬浮孢子。
5. 根据权利要求1所述的一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，其特征在于，所述Q4步 骤中，高氏一号培养基的成分为：可溶性淀粉20g/L，氯化钠0. 5g/L，硝酸钾lg/L，七水硫酸 镁0· 5g/L，磷酸氢二钾0· 5g/L，硫酸亚铁0· 01g/L，琼脂粉2%，调节pH至7. 0-7. 2。
6. 根据权利要求1所述的一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，其特征在于，所述Q6步 骤中，YEME培养基的成分为：酵母抽提物、麦芽抽提物、蔗糖、聚胨、葡萄糖。
7. 根据权利要求6所述的一种盐酸柔红霉素菌种的高产方法，其特征在于，所述Q6步 骤中，YEME培养基进行高温灭菌后，加入六水氯化镁进行稀释。
8. 根据权利要求1所述的一种盐酸柔红霉素菌种，其特征在于，该菌种是通过Q1-Q8的 方法而产生得到的。
【文档编号】C12N15/03GK104059871SQ201310086639
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月18日 优先权日:2013年3月18日
【发明者】余宏, 徐超波, 陈欢斌, 王波, 姚定余 申请人:江苏禾昌生物科技有限公司