α转移葡萄糖苷酶及其重组表达菌株的制作方法

α转移葡萄糖苷酶及其重组表达菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型的α转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:?1。用于重组表达该α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus?niger）At3，其保藏编号为CGMCC?No.6923。本发明所得到的重组菌种能够表达α转移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的α转移葡萄糖苷酶的酶活力。同时，所得重组α转移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了α转移葡萄糖苷酶的应用领域。
【专利说明】ct转移葡萄糖苷酶及其重组表达菌株

【技术领域】
[0001] 本发明属于酶分离表达【技术领域】，具体涉及一种来源于土曲霉（Aspergillus terreus)的新型的α转移葡萄糖苷酶，以及该α转移葡萄糖苷酶在丝状真菌宿主细胞 (诸如黑曲霉（Aspergillus niger)中的异源表达。

【背景技术】
[0002] α转移葡萄糖苷酶（a-transglucosidase E. C. 2. 4. 1. 24)能够从低聚糖类底 物的非还原性末端切开α-1、4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以α-1、 6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖（简称頂0,主要 包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等）、糖脂或糖肽等。该酶既具有水解能力，又可以专一地 进行葡萄糖苷键的转移反应，是生产低聚异麦芽糖的必需酶制剂之一。
[0003] α转移葡萄糖苷酶在自然界中分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生 物体内，在人类的糖原降解及动物、植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。α 转移葡萄糖苷酶主要应用于生产頂〇,而頂〇是人类肠道有益菌群双歧杆菌的增殖因子，摄 入后不被人体消化吸收，也不易被大肠中的多数腐败细菌所利用，却能作为双歧杆菌的碳 源而被利用。因此作为一种功能性食品原料，頂〇已被广泛用在各种食品的制造，居各种功 能性低聚糖之首。
[0004] 目前工业上已经有以淀粉或麦芽糖为原料，通过酶法生产低聚异麦芽糖的工艺， 但是已有的生产工艺转化率并不高。此外，虽然我国异麦芽糖产量很高，α转移葡萄糖苷 酶的用量很大，但是没有工业化生产，该酶仍然依赖进口。因此，本领域亟需获得高纯度的 转化活性较高的低聚异麦芽糖，提高生产工艺的转化效率；也亟需获得相应的高活性的α 转移葡萄糖苷酶及其相应的生产菌株。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种α转移葡萄糖苷酶及其重组表达菌株，从而弥补现有 技术的不足。
[0006] 本发明一个方面提供一种新型的α转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID Ν0: 1〇
[0007] 本发明的另一个方面提供用于编码上述α转移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序 列为 SEQ ID Ν0: 2。
[0008] 本发明的α转移葡萄糖苷酶，是从土曲霉中扩增出的。
[0009] 本发明还提供用于表达上述α转移葡萄糖苷酶的曲霉菌株；
[0010] 一种表达α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus niger)At3,已于2012年11 月30日保存于位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，菌株编号为CGMCC No. 6923。
[0011] 本发明的α转移葡萄糖苷酶和重组黑曲霉菌株用于生产低聚异麦芽糖。
[0012] 本发明所得到的重组菌种能够表达α转移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在 野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的α转移葡萄糖苷酶的酶活力。同时，所 得重组α转移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了 α转移葡萄糖苷酶的 应用领域。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1 :本发明所使用的pGm质粒的遗传图谱；
[0014] 图2 :黑曲霉（Asperillus niger) At3的发酵液蛋白SDS-PAGE凝胶图，显示了黑 曲霉转化子At3的表达情况，以及野生菌和宿主菌黑曲霉G1的蛋白表达情况，其中泳道1 所示为蛋白标准分子量标记，由上至下为116. 0 kD，66. 2 kD，45. 0 kD，35. 0kD，25. OkD和 18. 4kD ;泳道2所不为黑曲霉宿王G1在发酵5d后的蛋白表达情况；泳道3所不为At3的 α转移葡萄糖苷酶表达情况，在107kDa处可以看到清晰蛋白条带；泳道4所示为野生菌的 蛋白表达情况。

【具体实施方式】
[0015] 本发明用到了在遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。例如 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)等参考书中所记载的技术。但是，这 并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，本领域的普通技术人 员可以选用已公开的技术来实施本发明实施例中记载的方案。
[0016] 本发明说明书中记载的低聚异麦芽糖和异麦芽低聚糖可互换使用，都指选自下组 的一种或多种糖：异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、或潘糖。此外，应理解，所述的术语还 包括上述糖的混合物。
[0017] 本发明所记载的α转移葡萄糖苷酶，又称为α-D-葡萄糖苷水解酶，能切开麦芽 糖和麦芽低聚糖分子结构中α -1，4糖苷键，并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另 一个葡萄糖分子或麦芽糖或麦芽三糖等分子中的α -1，6位上，其转糖苷作用可将低聚糖 中的α-1，4糖苷键转化成α-1，6糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异 麦芽糖或糖酯、糖肽等。
[0018] 基因指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片 段（外显子）之间的插入序列（内含子）。
[0019] 核酸包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物；核酸与多核苷酸在本 说明书中可以互换使用。
[0020] 本发明中的酶表达的分析和酶活力的测定的方法如下：
[0021] 为了评价α转移葡萄糖苷酶的表达，可以在蛋白水平或核酸水平进行分析。可以 应用的分析方法包括Northern印迹、斑点印迹（DNA或RNA分析）、Southern印迹、放射自 显影、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应）和含有适当标记的探针（基于核酸编码序列）进 行的原位杂交。此外，基因表达可以通过免疫学方法，诸如细胞、组织切片的免疫组织化学 染色或者组织培养基的免疫试验。例如通过Western印迹或ELISA来评估。这样的免疫试 验可以用于定性地和定量地评价α转移葡萄糖苷酶（诸如At3)的表达。此类方法的细节 是本领域技术人员已知的，并且用于实施此类方法的许多试剂是可商业获得的。在一些实 施方式中，α转移葡萄糖苷酶（诸如At3)的表达通过SDS-PAGE进行分析。
[0022] α转移葡萄糖苷酶（诸如At3)的活性测定采用HPLC方法，既可以使用淀粉为原 料，也可以使用麦芽糖为原料，根据生成的异麦芽糖、潘塘等低聚糖的量来判定酶活高低。 一种优选的测定方法包括：以淀粉为原料（浓度1〇%~40%)，经高温α淀粉酶（〇. 059Γ0. 5%) 在90°C ~115°C液化到DEKT20,煮沸5分钟?15分钟灭酶，冷却到60°C，调pH到4~7,加普 鲁兰酶（0. 05%?0. 5%)、α 真菌淀粉酶（〇. 〇5%?0. 5%)和 Maltogenase(0. 05%?0. 5%)，然后加 入α转移葡萄糖苷酶（〇· 059Γ0. 5%)进行保温转化（温度30°C?60°C ;时间24~72小时） ，从而获得高含量的低聚异麦芽糖浆，对所得糖浆进行HPLC分析。另一种优选的测定方法 包括：以麦芽糖（浓度1〇%~40%)为底物，加入α转移葡萄糖苷酶（〇. 059Γ0. 5%)，然后进行 保温转化（温度30°C?60°C;时间24~72小时），获得高含量的低聚异麦芽糖浆，对所得糖 浆进行HPLC分析。在一些实施方式中，α转移葡萄糖苷酶（诸如At3)的活性选用麦芽糖 作为底物进行测定。
[0023] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
[0024] 实施例1克隆α转移葡萄糖苷酶基因At3
[0025] 按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA提取试剂盒（Omega)从土曲霉的过夜 培养物中提取基因组DNA。根据NCBI上的编号为XM_001210809的序列设计PCR引物。用 于克隆土曲霉中的At3基因的正向引物At3-F序列为5'-ccaTTACGTAATGGTTGACATCACCGAC CTTCTGG，反向引物 At3-R 序列为 5'-CTGCTCTAGACTACCACTCCAGGACCCAGTCCTT，将该基因用 Phusion DNA聚合酶（Thermo scientific)从土曲霉基因组DNA中扩增出来。
[0026] 扩增条件：
[0027] 第一步：98°C 保持 3min。
[0028] 第二步：98°C保持10s，然后72°C保持75s，此步骤重复30次。
[0029] 第三步：72°C保持 lOmin。
[0030] 使用凝胶纯化试剂盒（Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶SnaBI 和Xbal (Fermentas)对纯化了的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶SnaBI和Xbal 对质粒pGm (遗传图谱如图1)进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5a大肠杆菌 (Transgen)，用氨节青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen)。
[0031] 按照制造商的说明书，使用质粒中量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大 肠杆菌克隆中纯化质粒。所得2个质粒分别为pGm-At3,结果扩增出的基因的核苷酸序列为 SEQ ID N0 :2,其翻译的氨基酸（蛋白）序列为SEQ ID N0 :1，序列比对结果表明其是一个新 的等位基因。
[0032] 实施例2 :PEG介导的原生质体融合转化黑曲霉
[0033] 吸取黑曲霉G1孢子悬浮液于CMA平板中心（9 cm培养皿），待菌落长满整个培养 皿，切1/4大小的培养基于200 mL CMA液体培养基中，在30°C、200 rpm的条件培养14~16 h〇
[0034] 用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过 的菌丝体转移到40 mL原生质体化溶液，在30°C、200 rpm的条件下温浴1~2 h，用显微镜观 察检测原生质体化进展。
[0035] 用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生 质体溶液分装于两个50 mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45 mL，在4000 rpm条件下离心8 min以获得沉淀并弃去上清液。用20 mL溶液B再清洗沉淀 两次。将沉淀重悬浮于10 mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再 次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体 数目在1X10 7个/mL。
[0036] 在冰上，将100 μ L上述原生质体溶液加入预冷的无菌15 mL离心管中，每个转化 反应用1管。加入10 μ g DNA。加入12. 5 μ L溶液C，温和混匀后再冰上放置20 min。
[0037] 将丽SA顶层琼脂试管熔化并保持在55°C。从冰中移出上述15 mL离心管，并向管 中加入1 mL溶液C和2 mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3 个顶层琼脂试管中的每一个中加入1 mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上， 并将平板在30°C下培养疒10 d。
[0038] 溶液 A :2. 5 mL 1M Κ2ΗΡ04,2· 5 mL 1M ΚΗ2Ρ04,48· 156 g MgS04,加入 dlH20 至终体 积500 mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0039] 溶液 B :5 mL 1M Tris (pH 7.5),2.77 g CaCl2，109.32 g 山梨醇，加入(11!120至 终体积500 mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0040] 溶液 C :250 g PEG 4000,2· 77 g CaCl2,5 mL 1M Tris (pH 7. 5)，加入 dlH20 至终 体积500 mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0041] 原生质体化溶液：将 0· 6 g 裂解酶（Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum，Sigma)溶解于40 mL溶液A中，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0042] MMSA 平板：0.59 g 乙酰胺（Sigma)，3.4 g CsCl (Sigma)，0.52 g KC1，1.52 g KH2P04,218.5 g山梨醇，1 ml痕量元素（见下），20 g琼脂，加入dlH20至终体积972.5 mL， 高压蒸汽灭菌后加入用〇. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的25 mL 40%葡萄糖和2. 5 mL 20% MgS04。
[0043] MMSA 顶层琼脂试管：0· 59 g 乙酰胺（Sigma)，3· 4 g CsCl (Sigma)，0· 52 g KC1， 1.52 g KH2P04,218.5 g山梨醇，1 ml痕量元素（见下），10 g低熔点琼脂糖，加入dlH20至 终体积972. 5 mL，高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除 菌的25 mL 40%葡萄糖和2. 5 mL 20% MgS04，之后立即分装于无菌试管中，每管10 mL。
[0044] 痕量元素：在 250 mL dlH20 中加入 1 g FeS04 · 7Η20,8· 8 g ZnS04 · 7Η20,0· 4 g CuS04 · 5Η20,0· 15 g MnS04 · 4Η20,0· 1 g Na2B407 · 10H20,50 mg (NH4)6 M〇7024 · 4Η20,0· 2 mL 浓HC1，完全溶解后用dlH20定容至1 L，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0045] CMA平板：20 g葡萄糖，20 g麦芽浸出物，1 g蛋白胨，15 g琼脂，加入dlH20至终 体积1000 mL，高压蒸气灭菌。
[0046] CMA液体培养基：20 g葡萄糖，20 g麦芽浸出物，1 g蛋白胨，加入dlH20至终体积 1000 mL，高压蒸气灭菌。
[0047] 待平板上长出菌落后，挑选25个菌落，按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA 提取试剂盒（Omega)从其过夜培养物中提取基因组DNA。按实施例1中所述实验步骤对At3 的黑曲霉转化子进行PCR验证，对所得PCR产物进行测序。所得阳性克隆的孢子悬浮液接 种于30mL TSB发酵培养基中，在30°C，200 rpm的条件下培养5d，所得发酵液用8层纱布过 滤，滤液在14000Xg条件下离心10 min，收集上清液。所得上清液即为酶液。将酶液在浓 度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳，对在预期位置处有明显条带的阳性克隆进行HPLC分 析。根据HPLC分析图谱，选取酶活力最高者作为At3转移葡萄糖苷酶的重组菌进行进一步 研究。选取的黑曲霉（Asperillus niger)At3,已于2012年11月30日保存于位于北京市 朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（CGMCC)，菌株编号为 CGMCC No. 6923。
[0048] 实施例3 :黑曲霉（Asperillus niger) At3的发酵和酶的表达
[0049] 将表达At3 α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉（CGMCC No. 6923)转化子的孢子悬浮液 接种于30mL TSB发酵培养基中，在30°C，200 rpm的条件下培养5 d。所得发酵液用8层纱 布过滤，滤液在14000Xg条件下离心10 min，收集上清液。所得上清液即为At3 α转移葡 萄糖苷酶酶液。将酶液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳（图2);电泳结果显示在 107kDa处可以看到明显条带，而野生菌在预期位置没有可见的蛋白条带，宿主菌G1有极其 微弱的条带，但表达量明显远小于重组菌的表达量。
[0050] 配制pH4. 6的醋酸-醋酸钠缓冲液，At3酶液用上述缓冲液稀释至合适的浓度。以 10%麦芽糖为底物，加入适量的At3稀释酶液，然后在50°C保温转化24小时以上，得到转化 产物低聚异麦芽糖浆。将产物糖浆稀释10倍，取lml稀释糖浆经0. 22 μ m的一次性微孔滤 膜过滤后，进行HPLC分析。HPLC结果显示，底物麦芽糖的含量有明显减少，此过程伴随有异 麦芽糖和异麦芽三糖的产生并且其产量显著增加，同时也有些许潘糖产生。此实验结果与 先前预期的结果一致，证明本发明的土曲霉α转移葡萄糖苷酶转化到黑曲霉中表达，确有 很好的转移葡萄糖苷酶活性，可以催化麦芽糖生产低聚异麦芽糖。
[0051] TSB 发酵培养基：12 g NaN03,0. 5 g KC1，1. 5 g ΚΗ2Ρ04,2· 05 g MgS04 ·7Η20,3· 5 g NaH2P04*H20,45 g胰蛋白大豆肉汤，70 g柠檬酸钠，1 g吐温80，1 mL痕量元素（见下）， 加入dlH20至终体积700 mL，高压蒸气灭菌后加入300 mL用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除 菌的40%麦芽糖。
[0052] 痕量元素：在 250 mL dlH20 中加入 1 g FeS04 · 7Η20,8· 8 g ZnS04 · 7Η20,0· 4 g CuS04 · 5Η20,0· 15 g MnS04 · 4Η20,0· 1 g Na2B407 · 10H20,50 mg (NH4)6 M〇7024 · 4Η20,0· 2 mL 浓HC1，完全溶解后用dlH20定容至1 L，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0053] 实施例4表达α转移葡萄糖苷酶的应用实例
[0054] 工业生产低聚异麦芽糖浆，以淀粉为原料，加水制成30%粉浆，在pH值为6. 0、温 度为9(T120°C条件下，经耐热性α -淀粉酶液化后，在pH值为5. 0、温度为60°C的条件下， 用β_淀粉酶、普鲁兰酶和真菌α-淀粉酶同时作用，转化成麦芽糖后，加入实施例3的菌 株编号为CGMCC No. 6923的黑曲霉所表达的α-转移葡萄糖苷酶进行转苷反应生成异麦芽 糖、异麦芽三糖、四糖及五糖等含α-1，6键的分支低聚糖与潘糖。加入α-转移葡萄糖苷 酶使其转化率明显提高可达409Γ50%以上，再经活性炭脱色、离子交换树脂脱盐，浓缩到固 形物为75%，得到普通异麦芽糖浆，其中含异麦芽低聚糖为409Γ50%，葡萄糖为40%，再将葡 萄糖用酵母发酵或膜过滤除去，便可得到含异麦芽低聚糖为90%的产品。上述结果表明本 发明所保藏的重组菌株能够高效的表达α转移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在野生 菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的α转移葡萄糖苷酶的酶活力。
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[0005] 行：列表 Trp Gly Gly Asp Asn lie Scr Lys Trp Gly Scr Met Tyr Phe Scr He 660 665 670 Scr Gin Ala Leu Scr Phe Scr Leu Phe Gly lie Pro Mel Phe GJv Thr 675 (m ms Asp Thr Cys Gly Phe Asn Gly As? Tin Asp Glu Glu Leu Cys Asn Arg mo 695 7m Trp Met Gin Leu Scr Ala Phe Phe Pro Phe Tyr Arg Asn His Asn Val 705 7 HI 715 720 Leu Scr Ala ilc Pro Gin Glu Pro Tyr Arg Trp Ala Scr Val He Asp 725 730 735 Ato Scr Lys Ala Ala Mel Lys Ik Arg Tyr Ala lie Leu Pro Tyr Phe 740 745 750 Tyr Thi* Leu Phe His Plie Aki His Uir Tlir Gly Ser Thr Val Arg 755 760 765 Ala Leu Ala Leu Trp Scr Gly Leu Pro Scr Trp Scr Scr Arg Scr Trp 770 775 7雜 Qu Pro Gin Va〗Asp Thr Val Lys Gly Val Phe Pro Gly Va〗Gly Asn 7K5 791! 795 800 Gly Glu Val Trp Tyr Asp Trp Tyr Thr Gin Thr Ala Val Asp Ala Glu 805 810 815 Pro Gly Val Asn Lys Thr Leu Scr Ala Pro Leu Gly His He Pro Val ?20 825 830
[0006] 序剩衣 Phc Val Arg (ily (My Ser Val lie Pro Mel (iln Olu Pro Ala Leu Tlir 835 UO 845 Thr Thr Asp Ala Arg Lys Thr Pro Trp Ser Leu Leu Thr Ser Leu Ser 850 855 860 Ser Glu Glv Thr Ala Trp Gly Glu Leu Tw Leu Asp Asp Gly Glu Ser K65 X?0 875 SSO \y Thr Fro Asp (Hu Thr Leu Leu Va! Ilir Fhc (iln A!a A!a His Ser xx5 _) ms Lys Leu Arg Ala Thr Pro Lys Gly Asn Trp Glu Ghi Ser Asn Ala Leu ^?) m Ala Asn Val Thr Val Leu Gly Val Ala Lys Glu Pro Arg Asn Val Arg 915 920 925 Phc Asn (ily Lys Lys He Ser Ser Val Ala Tyr Asn Ah Thr Ser (itn m) 935 雜 Val Leu Ser Val Gly Gly Leu Gin Glu Leu Thr Gly Lys Gly Ala Trp 945 950 955 960 Ala Lys Asp Trp Val Leu GJu Trp 965 <2H> 2 <211> 3112 <212> DNA <213> α-lransgiucosidasc gene <400 2 atggtlgaca icaccgacct tctggccggt gcctgcclgs teccggtggt ctatggggcg 60 agtcagaccc tggccccgag cacctccgcg acggcttctc acacccagtt caccatccct 120
[0007] 坪列表 gcgtcggccg acgtcggtgc teaaltgate gcoaacatcg aegatecgea ggocgtgaat 180 gcgcagagtg tgtgccctgg atatcgggct teggatgtle atcalaactc teaiggglll 240 acggctagtc tggagttggc gggagacccc tgcaatgigt acggaacgga tgtcgaagcc 3_ ttgacttiga ccgtcgagta ccaggcgaag gatcggttga acatccagat cacccctact 36(1 cacgttgEcg cgtccaalgc etetlggtae atectttegg agfieclggl gccccggccc 420 caggeticgl eg gaiggcte ggeieatgae tgegatcttg gwaatgaa 480 mmama 處m 歲驄 t gacmgmm gemmggag atgagmtt mmmcgm 540 ggctccactt tggtgtatga aaaccagttc atcgagtttg tgagcgcctt gcctgagg^g ⑷" lacaacttgt alggcttggg tgagcggatg gcccagctgc ggttgctgcg caatgccact 祕i) ctgaccatgt aigeggcfgi liliggtgal ccgattgata ggtaagcagc gilgeaaaeg 720 gggtcaagca gatctgttac tgacattgtc gtgtagcaat atctatggcc agcaiccati 780 ctatctggac accagatact acaaagtgga caagcacggc totcacaeti tggtcaagae H40 cgacaaggcc g^tgcctetg aggaatatgt gtcitattcc catggtgtct tcctgagaaa 900 tgcecatgga eaggaggtcc tcctgaacce caaggglgtg acatggcgta ctctcggtgg 960 aagcatcgat cttactttcl acgccggccc aagccaggtc caagtcaccc agcagtatct 1020 gaagagtact gttggtctgc cggccatgca gaaglatagc acgctcggct tccaccagtg 1080 ccgctgggga tacaacaaci ggsecgggei ggeagstgte gtggcgaact ttgagaagtt 1140 cgagattcct ctggaataca tetggtatgt agtcgatgca tccagtcttg gtctcctggt 1200 ctgacactte taggtctgat attgactata tgeaoggtta ccggaacttc gacaacgatg 1260 tccaccggtt cccatacgac gagggtgtcg agttcctcaa caaactccac gacagtggac 1320 gccaetgggt cccgaitgtt gatggggcgc ictalatcoc gaacocogag aatgctlcig 1380 atgcgtaagt catgclaiac ctatacaccc ggttgtgcct tlactaatca tgtcacoagg 1440
[0008] tatgaaacat acacccgagg agelpggat gaictctgga icaagaaccc cgatggcagc 1500 ctelacattg gageegteig gc^eggcte ?gletate eigai%gca toaeaiteag 1560 gcagtggact tetgggccaa cgagalcgig acciggtgoa aoaaactgcc atafgatggl 1620 atctggtacg aealggctga agigfcticf ttcigtgfeg gcagctgcgg lao^ggaaac HM ugacictca acccggnca cccaccauc gcgcigcccg gagagccagg caacgicgic 174() lacgaciaic ctgagggci! igagaagacc aacgcgaccg aggcigccic Igcaiccgci 1X〇〇 gglieltcea geeaggcigc igc%cicca acetet^gi e^cgi￡gae ilcclatetg 1861) cgtaccacgc coactgctgg c^tcgcaat gigaaccacc ciccctacgt gatcaaccat 1920 gtccagacgg gcci^gatct cgctgticat gcgatitcic ccaactccac ^acgitgat 19X0 ggggftxagg agta^gatgt gcac^tctg ittggecacc agggtatoa tgccai^^c 2M§ caaggicte tlggagtalg gcctgagaag c^ecgtKm tiatcgoteg llcc^gttc 2! 00 gttggct^tg giimatgggc cggtcactgg ggcggcgata acatttficaa giggggatcc 2160 atgtacllct ccatctctca ggccccticg ttctctctct tcggtatccc caigtttggt 2220 accgalaccl gcggtttcaa cggaaacacc gacgaggagc tctgcaaccg clggaigcaa 22 SO ctctccgcct tettcccctt ctaccgtaac cacaatgtte tctcggctat cccgcaggaa 2340 ce_€ggl gggegtoggt tot麟egca ageaagge鼸 ^Igaafat eegclaegee 24_ attctccc€t aeifeiaeae feitii^ac tteg<xcaca ceacgggcte gactgteatg 2460 cgcgccctgg cgtgggagtt tcccaacgac ccctcgctgg ccgccatcga cacccagttt 2520 atggtcgggc cttccgtcat ggtcgtcccg gtcctgggag ccccaggicg acaccgtcaa 2580 gggtgUtic cccgglgUg gcaacggcga ggtciggtac gacigglaca cgcagaclgc 2640 ggttgacgcg gagccgggtg tcaacaagac tctctetgct cctctcggcc acatcccggt 2700 cttlgtogg gglggcagig toAcccgat gc^gagcec gcgclgasca ccaccgalgc 2760 gcgcaagacg ccttggtcgc ttctgacatc actgagcagc gagggcaccg cctggggcga 2820
[0009] 序列表 gctctatctc gatgacggcg aaagcgtcac cccggatgag acgcttcttg tcacattcca 2KH0 ggctgcgcac tcgaagclgc gtgccacgcc caaaggcaac tgggaagagt cgaaigctct 2940 ggccaacglg acggicctig gtglggccaa ggagccgcge aalgiccggi icaaiggcaa 3000 gaagalcagc icgglcgcct acaatgcgac UcgcaggU ctctcigicg gaggicicca 3060 ggagctgacl ggcaagggcg cgtgggccaa ggaclgggtc ctggagtggt ag 3112
【权利要求】
1. 一种α转移葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的α转移葡萄糖苷酶的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1〇
2. 权利要求1所述的α转移葡萄糖苷酶在生产低聚异麦芽糖中的应用。
3. 用于编码权利要求1所述的α转移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 2〇
3. 用于重组表达权利要求1所述的α转移葡萄糖苷酶的曲霉菌株。
4. 如权利要求3所述的曲霉菌株，为黑曲霉（Asperillus niger)At3,其保藏编号为 CGMCC No. 6923。
5. 权利要求4所述的曲霉菌株在生产低聚异麦芽糖中的应用。
【文档编号】C12N15/54GK104099306SQ201310118904
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月8日 优先权日:2013年4月8日
【发明者】王华明, 訾祯祯 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所