用于检测丁香疫霉的引物对和探针及其检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测丁香疫霉的引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。本发明进一步提供了检测丁香疫霉的荧光RT-PCR法，其是以样品总DNA为模板，利用上述引物对和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。该方法可从被丁香疫霉侵染的发病植物组织中快速、准确地检测出丁香疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对丁香疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。
【专利说明】用于检测丁香疫霉的引物对和探针及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种用于检测丁香疫霉的引物 对和探针及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 丁香疫霉（Phytophthora syringae (Klebahn) Klebahn)是我国重要的检疫性病 菌，可以引起观赏植物、果树发生严重、具有毁灭性的病害。该病菌寄主范围广泛，主要危害 14个科中的29个属，如：欧洲丁香（Syringa vulgaris)、柑桔属的朽1檬（Citrus limon)、脐 澄（C. sinensis)、小茴香（Foeniculum vulgare)、苹果属的苹果（Malus pumila)、李属的甜 搜桃（Prunus avium)、梨属的西洋梨（Pyrus communis)，火棘属（Pyracantha ssp.)等，能 引发根、茎、叶、果实上的多种病害。目前，在美洲、欧洲、亚洲、非洲的许多国家都有丁香疫 霉病菌发生危害的报道。
[0003] 因此开发丁香疫霉的早期快速检测技术，对相关植物生产中的病害防控和无公害 化具有重要的意义。
[0004] 近年来，实时荧光定量PCR (荧光RT-PCR)技术及其相关分子检测技术已广泛用于 植物病原菌消长动态的分子检测与预警，然而国内外鲜有利用荧光RT-PCR技术检测丁香 疫霉方面的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测丁香疫霉的引物对和探针。
[0006] 本发明的另一目的是提供用于检测丁香疫霉的荧光RT-PCR法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测丁香疫霉的引物对，其包括 上游引物PS-F :5'-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3'（SEQIDNo·l)和下游引物PS-R: 5'-AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3'（SEQ ID Νο·2)。
[0008] 本发明还提供含有上述引物对PS-F和PS-R的用于检测丁香疫霉的试剂盒。
[0009] 本发明还提供一种用于检测丁香疫霉的探针，所述探针为： 5' -F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3'（SEQ ID No. 3)，其中 F1 为报告荧光基团，Q1 为非荧光性 的淬灭基团。优选F1为FAM荧光染料，Q1为MGB。
[0010] 本发明还提供一种检测丁香疫霉的荧光RT-PCR法：以样品DNA为模板，采用引物 对PS-F和PS-R以及上述探针进行荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后 根据扩增曲线判定结果。
[0011] 上述荧光RT-PCR扩增反应中，25μ L的反应体系含有成分如下：样品 DNA1 μ L (0· 0005-50ng)，10 X PCR 反应缓冲液（不含 Mg2+) 2. 5 μ L，25mM MgCL22. 0 μ L，2. 5mM dNTP2. 0 μ L，10 μ M 引物 PS-F1 μ L，10 μ M 引物 PS-R1 μ L，10 μ M 探针 1· 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0· 3 μ L，ddH2013. 7 μ L。
[0012] 荧光RT-PCR扩增反应过程中使用的退火温度为60°C。优选地，反应程序为： 951：3111丨11;951：1〇8,6〇1：3〇8,40个循环。
[0013] 本发明还提供用于检测丁香疫霉的试剂盒，其包括引物对PS-F和PS-R以及上述 探针。
[0014] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种 或多种。
[0015] 更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0016] 本发明在测序分析丁香疫霉及其近似种和近缘种的ITS序列的基础上，分别设计 用于检测丁香疫霉的引物对和荧光探针。该探针与普通的Taqman探针不同之处在于3'端 采用了非荧光性的淬灭基因，即淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本 底信号的干扰。
[0017] Taqman MGB探针技术，即将报告荧光染料标记在探针的5'端，而3'端采用了非荧 光性的淬灭基因，二者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭基团吸 收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同 模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在扩增 延伸阶段将探针切断，淬灭基团的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对丁香 疫霉的检测。
[0018] 本发明根据丁香疫霉ITS序列，设计出可快速检测丁香疫霉病菌的特异性引物对 和探针，并在此基础上建立了荧光RT-PCR检测法，可从发病植物组织中快速、准确地检测 出丁香疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对丁香疫霉疫 情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例4中采用荧光RT-PCR技术检测丁香疫霉的结果示意图，其 中，1 :丁香疫霉（Phytophthora syringae，来源于美国）；2 :丁香疫霉（P. syringae，来源 于英国）；3_4 :冬生疫霉（P. hibernalis) ;5_7 :雪松疫霉（P. lateralis) ;8_9 :栎树粹死 病菌（P.ramorum) :苜猜疫霉根腐病菌（P.medicaginis) ;12-13 :马铃薯绯腐疫霉 (P. erythroseptica);14_16 :栗黑水疫霉（P. cambivora);17_18 :草莓疫霉（P. fragariae); 19-20 :树霉疫霉（Ρ· fragariae var. rubi) ;21 :大豆疫霉（Ρ· sojae) ;22 :棕榈疫霉 (P. palmivora) ;23 :辣椒疫霉（P. capsici) ;24 :康沃尔疫霉（P. kernoviae) ;25 :空白对照。
[0020] 图2是本发明实施例5中荧光RT-PCR检测方法的灵敏度实验结果示意图，其 中，1 _8 的 DNA 浓度分别为 50ng/y L、5ng/y L、0. 5ng/y L、0. 05ng/y L、0. 005ng/y L、 0· 0005ng/y L、0. 00005ng/y L 和 0· 000005ng/y L，9 为空白对照。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022] 以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或 Draper 等（Blackwell 科学出版 社，1988)，郑小波(疫霉菌及其研究技术，中国农业出版社，1997)中所述的操作技术规程， 或按照制造厂商所建议的实验条件。
[0023] 实施例1引物对及探针的设计与合成
[0024] 根据丁香疫霉ITS序列，采用探针设计软件Express3. 0设计引物对及探针，引物 对序列为：
[0025] PS-F (正向引物）：5, -GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3，
[0026] PS-R (反向引物）：5, -AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3，
[0027] 探针的序列为：5' -F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3' ；其中，F1 为 FAM 荧光染料，Q1 为 非荧光性的淬灭基团MGB。
[0028] 上述引物对及探针序列合成由上海基康生物技术有限公司完成。实施例2样品总 DNA的提取
[0029] 采集适量丁香疫霉（Phytophthora syringae)真菌菌丝体或染病果实、叶片，用赛 默飞世尔植物直接提取试剂盒（Thermo Phire Direct PCR Kit)提取DNA。
[0030] 实施例3实时荧光定量PCR (荧光RT-PCR)法的建立
[0031] 1、荧光RT-PCR反应体系
[0032] 以总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，反应体系（总体积25μ L)为：样品 DNA1 μ L (0· 0005-50ng)，10 X PCR 反应缓冲液（不含 Mg2+) 2. 5 μ L，25mM MgCL22. 0 μ L，2. 5mM dNTP2. 0 μ L，10 μ M 引物 PS-F1 μ L，10 μ M 引物 PS-R1 μ L，10 μ M 探针 1· 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0· 3 μ L，ddH2013. 7 μ L。
[0033] 2、实时荧光PCR反应条件
[0034] 将样品管放入BIO-RAD公司IQ?5荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：第1个 循环为95°C 3min;然后是95°C 10s，6(TC 30s，40个循环。每个循环结束后采集数据。反应 结束后根据扩增曲线判定结果。
[0035] 实施例4 丁香疫霉荧光RT-PCR检测法的特异性分析
[0036] 以丁香疫霉的总DNA为模板，以丁香疫霉的近似种及近缘种的总DNA为对照，通过 荧光RT-PCR检测荧光强度变化。
[0037] 试验结果：
[0038] 以丁香疫霉（Phytophthora syringae)的总DNA为模板，通过实时突光 PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而丁香疫霉的近似种及近缘种，如冬生疫霉 (P. hibernalis)、雪松疫霉（P. lateralis)、栎树粹死病菌（P. ramorum)、苜猜疫霉根腐病 菌（P. medicaginis)、马铃薯绯腐疫霉（P. erythroseptica)、栗黑水疫霉（P. cambivora)、 草莓疫霉（Ρ· fragariae)、树霉疫霉（Ρ· fragariae var. rubi)、大豆疫霉（Ρ· sojae)、棕榈 疫霉（P. palmivora)、辣椒疫霉（P. capsici)、康沃尔疫霉（P. kernoviae)的突光强度没有 变化，检测结果如图1所示。
[0039] 实施例5 丁香疫霉荧光RT-PCR检测法的灵敏度分析
[0040] 用超纯水分别稀释丁香疫霉的DNA，进行相对灵敏度检测，在25μ L反应体系中， DNA 分别为 50ng/y L、5. Ong/μ L、0. 5ng/y L、0. 05ng/y L、0. 005ng/y L、0. 0005ng/y L、 0· 00005ng/μ L和0· 000005ng/μ L。检测结果如图2所示，最低检测限为0· 0005ng/μ L。
[0041] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0001] 序列表 <--〇>中B检验检疫科学研究院 <120〉用于检测Γ香疫霉的引物对和探针及其检涵方法 <130> KHP12115911.1 <160> 3 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213〉人丁序列 <400> 1 gtctggcttc ggctggat 18 <210> 2 <211〉 21 <212> DNA <213〉人丄序列 <400> 2 agtgggctac tagctccagg c 21 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213〉人工序列 <400 3 tggcgaccgc tctga 15
【权利要求】
1. 用于检测丁香疫霉的引物对，其特征在于， 上游引物 PS-F :5' -GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3'， 下游引物 PS-R :5' -AGTGGGCTACTAGCTCCAGGC-3'。
2. 用于检测丁香疫霉的探针，其特征在于，所述探针为： 5' -F1-TGGCGACCGCTCTGA-Q1-3'，其中F1为报告荧光基团，Q1为非荧光性的淬灭基团。
3. 根据权利要求2所述的探针，其特征在于，F1为FAM，Q1为MGB。
4. 检测丁香疫霉的荧光RT-PCR法，其特征在于，以样品DNA为模板，采用权利要求1 所述的引物对以及权利要求2或3所述的探针进行荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数 据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，25yL的反应体系含有成分如下： 0· 0005-50ng/ μ L 样品 DNA1 μ L，10 X PCR 反应缓冲液 2. 5 μ L，25mM MgCL22. Ο μ L，2. 5mM dNTP2. 0 μ L，10 μ Μ 引物 PS-F1 μ L，10 μ Μ 引物 PS-R1 μ L，10 μ Μ 探针 1· 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 3 μ L，ddH2013. 7 μ L ;其中，所述PCR反应缓冲液中不含Mg2+。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反应程序为：95°C 3min;95°C 10s， 60 °C 30s，40 个循环。
7. 用于检测丁香疫霉的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物对以及权利要求2或3 所述的探针。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
9. 根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
10. 含有权利要求1所述引物对的用于检测丁香疫霉的试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK104099404SQ201310119058
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月8日 优先权日:2013年4月8日
【发明者】杜洪忠, 吴品珊 申请人:中国检验检疫科学研究院