枫糖尿病相关基因突变、其检测方法及其用途

枫糖尿病相关基因突变、其检测方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病基因突变，枫糖尿病相关基因突变，更特别是枫糖尿病相关基因突变、其检测方法及其用途。
【专利说明】枫糖尿病相关基因突变、其检测方法及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病基 因突变，枫糖尿病相关基因突变。

【背景技术】
[0002] 枫糖尿病（Maple Syrup Urine Disease, MSUD)是一种常染色体隐性遗传性氨基 酸代谢病，主要是由于以下原因所致：支链氨基酸α-酮酸脱氢酶复合体的基因缺陷，使支 链氨基酸(主要包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）转氨基反应后形成的相应支链α -酮酸不 能氧化脱羧，组织中支链氨基酸和支链α-酮酸异常增高，体液排出α-酮酸，因而出现类 似枫糖的气味，并且由此而得名。同时，由于蓄积体内的支链氨基酸及其α-酮酸衍生物对 脑组织有毒性作用，可以抑制髓鞘生成，干扰脑内蛋白合成，抑制神经递质功能，使发育中 的脑组织受到严重损害。特殊气味和严重脑病是本病非常明显的两个特点。目前，本病共 分成如下5种类型：经典型、中间型、间隙型、维生素 Β1治疗有效型和二氢硫辛酰胺酰基脱 氢酶（Ε3)缺乏型，其中最后一种类型非常罕见。
[0003] 枫糖尿病在新生儿中的患病率是1/18万。遗传缺陷是线粒体中存在的BCKD多酶 复合体中的Ε1、Ε2和Ε33亚基的基因突变。BCKD多酶复合体是一种存在于线粒体中的多酶 复合体，其功能是催化从支链氨基酸降解而产生的3种支链α酮酸的氧化性脱羧。酶复合 体围绕一立方体核心含有24个相同的双氢脂酰转环酶（dihydrolipoyltranscylase，Ε2) 亚基，这些亚基通过离子相互作用连接在一起。此外，还有支链α酮酸脱羧酶（El)、特异性 激酶（E3)和特异性磷酸酶。特异性激酶和磷酸酶通过可逆性磷酸化来调节BCKD复合物活 性。E1是杂四聚体，由2个Ε?α和2个Ε?β亚基组成。E3为同二聚体。Elα、Elβ、E2和 Ε3的编码基因都可发生突变而导致BCKD多酶复合体活性降低。Ε1是焦磷酸硫胺素（ΤΡΡ) 依赖性酶，由2个El a和2个Ε1 β形成a 2 β 2四聚体，分子量为170kD。El a和Ε1 β基 因座分别定位在19q和6ρ，均可发生突变。El a基因突变则可阻碍其与正常的El β聚合 成四聚体，使El a迅速被降解，从而使支链a酮酸脱羧酶活性降低或完全丧失；或者只形 成α β二聚体，也可形成低分子量的四聚体。Wynn等研究了 IA型枫糖尿病患者中El a与 Ε?β的聚合障碍后指出：在被研究的El a突变如果在假定的焦磷酸硫胺素结合袋，则对E1 亚基的聚合无影响；如果涉及到C末端芳香性残基的突变，则阻碍亚基聚合动力学和天然 的α 2β 2结构的形成。El α亚基的突变使支链α-酮酸脱羧酶活性降低或完全丧失。
[0004] 确定新的MSUD基因的致病突变，对开展MUSD的分子诊断具有重要意义。


【发明内容】

[0005] 本发明人通过广泛而深入的研究，在一个MUSD患者中发现了编码支链a -酮酸脱 氢酶复合体El- α亚基的基因 BCKDHA基因的复合杂合突变：错义突变c. 392A>G (即El- a 亚基蛋白的突变P. Tyrl31Cys)和EX2-4DUP。该复合杂合突变导致BCKDHA基因失去正常功 能，从而导致MUSD发生。发明人在此基础上完成了此发明。
[0006] 本发明涉及MUSD病基因的复合杂合突变，具体为：BCKDHA基因的错义突变 c. 392A>G (即支链α-酮酸脱氢酶复合体El-α亚基蛋白的错义突变p.Tyrl31Cys)和 EX2-4DUP(指在一条染色体上，BCKDHA基因的2-4号外显子的拷贝数增加1倍，即出现外显 子2-3-4-2-3-4的结构）。其中，BCKDHA基因编码支链α-酮酸脱氢酶复合体El-α亚基。
[0007] 在第一方面，本发明涉及MUSD病的生物标记物，即BCKDHA基因或支链α-酮酸 脱氢酶复合体Ε1- α亚基蛋白的杂合突变，所述生物标记物是如下的突变BCKDHA基因或 El-α亚基蛋白：BCKDHA基因的错义突变c.392A>G (即支链α-酮酸脱氢酶复合体El-α 亚基蛋白的错义突变P. Tyrl31Cys)和EX2-4DUP。
[0008] 在一个实施方案中，本发明的突变BCKDHA基因为具有以下突变的SEQ ID NO: 1 : 错义突变 c. 392A>G 和 EX2-4DUP。
[0009] 在一个实施方案中，本发明的突变的支链α -酮酸脱氢酶复合体El-α亚基蛋白 为具有以下突变的SEQ ID N0:2:错义突变p.Tyrl31Cys和EX2-4DUP。
[0010] 在第二方面，本发明涉及一种检测MUSD病或检查其易感性的方法，所述方法包括 检测受试者的BCKDHA基因或支链α-酮酸脱氢酶复合体El-α亚基蛋白中是否存在突变 位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有MUSD病或易患MUSD病，或者其后代会 患有MUSD病或易患MUSD病，所述突变为BCKDHA基因的错义突变c. 392A>G(即支链α -酮 酸脱氢酶复合体Ε1- α亚基蛋白的错义突变p. Tyrl31Cys)和/或EX2-4DUP。
[0011] 在一个实施方案中，BCKDHA基因的cDNA序列为SEQ ID NO: 1的序列表不。
[0012] 在一个实施方案中，El-α亚基蛋白为SEQ ID N0:2的序列表示。
[0013] 在一个实施方案中，本发明的检测MUSD病的方法包括如下两组引物扩增的步骤：
[0014] SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ;
[0015] SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO: 10。
[0016] 在一个实施方案中，本发明的检测MUSD病的方法中检测突变位点通过选自如下 的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱，基于荧光 标记技术的DNA测序。
[0017] 在本发明第二方面的方法中，优选检测BCKDHA基因的错义突变c. 392A>G(即支链 α -酮酸脱氢酶复合体E1- α亚基蛋白的错义突变p. Tyrl31Cys)和/或EX2-4DUP。
[0018] 在第三方面，本发明涉及一种检测突变BCKDHA基因或支链α -酮酸脱氢酶复合体 El-α亚基蛋白的方法，所述方法包括检测受试者的BCKDHA基因（即支链α-酮酸脱氢酶复 合体El-α亚基蛋白）中是否存在BCKDHA基因的错义突变c.392A>G (即支链α-酮酸脱 氢酶复合体Ε1- α亚基蛋白的错义突变p. Tyrl31Cys)和/或EX2-4DUP。
[0019] 在一个实施方案中，BCKDHA基因为SEQ ID NO: 1的序列表示。
[0020] 在一个实施方案中，El-α亚基蛋白为SEQ ID N0:2的序列表示。
[0021] 在一个实施方案中，本发明的检测突变BCKDHA基因或El-α亚基蛋白的方法包括 如下两组引物扩增的步骤：
[0022] SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ;
[0023] SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO: 10。
[0024] 在一个实施方案中，本发明的检测突变BCKDHA基因或El-α亚基蛋白的方法中检 测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性 高效液相色谱，基于荧光标记技术的DNA测序。
[0025] 在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变BCKDHA基因或支链α -酮酸脱氢酶复 合体El- α亚基蛋白中使用的引物对，所述突变是BCKDHA基因的错义突变c. 392A>G (即支 链α -酮酸脱氢酶复合体El- α亚基蛋白的错义突变p. Tyrl31Cys)和/或EX2-4DUP。
[0026] 其中所述引物对分别基于选自如下的位铬在基因组序列或cDNA序列上前后设 计，使得扩增该位铬：BCKDHA基因 cDNA序列第392位和/或外显子2-4。
[0027] 在第五方面，本发明涉及与突变BCKDHA基因互补的核酸探针，所述突变是BCKDHA 基因的错义突变c. 392A>G和/或EX2-4DUP。
[0028] 所述探针与突变BCKDHA基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA序列上 的位铬：BCKDHA基因cDNA序列第392位和/或外显子2-4。
[0029] 在第六方面，本发明涉及检测突变BCKDHA基因或支链α-酮酸脱氢酶复合体 Ε1- α亚基蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是BCKDHA基因的错义突 变c. 392A>G (即支链α-酮酸脱氢酶复合体El-α亚基蛋白的错义突变p.Tyrl31Cys)和 / 或 EX2-4DUP。
[0030] 其中所述引物对分别基于选自如下的位铬在基因组序列或cDNA序列上设计，使 得其扩增产物涵盖该位铬：BCKDHA基因 cDNA序列第392位和/或外显子2-4。
[0031] 在一个实施方案中，所述检测突变BCKDHA基因或支链α-酮酸脱氢酶复合体 ΕΙ-α亚基蛋白的试剂盒包括如下两组引物：
[0032] SEQ ID Ν0:3 和 SEQ ID Ν0:4 ;
[0033] SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO: 10。
[0034] 在第七方面，本发明涉及检测突变BCKDHA基因或支链a-酮酸脱氢酶复合体 El- α亚基蛋白的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是BCKDHA基因的错义突变 c. 392A>G 和 / 或 EX2-4DUP。
[0035] 所述探针与突变BCKDHA基因上包含选自如下位铬的基因组序列或cDNA序列上的 区域互补：BCKDHA基因 cDNA序列第392位和/或外显子2-4。
[0036] 本发明人发现，本发明的BCKDHA基因的c. 392A>G和EX2-4DUP的复合杂合突变即 致病；而本发明的BCKDHA基因的c. 392A>G和EX2-4DUP任一种的杂合突变并不致病，如杂 合错义突变c. 392A>G (p. Tyrl31Cys)存在于患者的母亲中，杂合突变EX2-4DUP存在于患 者的父亲中，他们并未患病。
[0037] 本发明的BCKDHA基因中的复合杂合突变，可以用于枫糖尿病病变的检测和诊断。 本发明发现了 MUSD病相关基因的复合杂合突变，对这些基因突变的检测可能用于MUSD病 患者的辅助诊断，并且可能有利于明确MUSD病患者的分子诊断。因此，本发明的检测复合 杂合突变BCKDHA基因（或El-α亚基蛋白）和/或EX2-4DUP的方法可以用于诊断MUSD病 或其易感性的目的，例如产前诊断、植入前遗传学诊断（PGD)、患者筛查。然而，本发明的方 法并不仅限于用于诊断疾病的目的。
[0038] 另外，本发明的检测突变BCKDHA基因和/或El-α亚基蛋白的方法也可以用于非 诊断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多态性，用于家 族演化研究。本发明可以对MUSD病的发病机理提供重要线索，对MUSD病的诊断治疗具有 十分重要的意义。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。
[0039] 例如，根据本文的描述可以看出，有些个体携带本发明所述的突变BCKDHA基因 (或支链α-酮酸脱氢酶复合体ΕΙ-α亚基蛋白）或者携带本发明所述的EX2-4DUP但不患 MUSD病，例如仅一条染色体携带突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以任何不涉及 诊断疾病的目的，因为这些个体并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为例如有用 信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为 SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。
[0040] 因此，本研究丰富了 MSUD基因的致病突变谱，对开展MUSD的分子诊断具有重要意 义。

【专利附图】

【附图说明】
[0041] 图1 :患者（即先证者Ρ610)和其父母（Ρ609是父亲，Ρ611是母亲）的BCKDHA基因 的sanger测序
[0042] 图2:患者、其父母和正常人对照的BCKDHA基因的QPCR测序结果。其中P610是 患者，P611是患者母亲，P609是患者父亲；N108为正常人。
[0043] BCKDHA基因的cDNA序列（SEQ ID N0:1 ;下划线部分为EX2-4 ;加框的为第392 位）：
[0044] ATGGCGGTAGCGATCGCTGCAGCGAGGGTCTGGCGGCTAAACCGTGGTTTGAGCCAGGCTGCCCTCCTG CTGCTGCGGCAGCCTGGGGCTCGGGGACTGGCTAGATCTCACCCCCCCAGGCAGCAGCAGCAGTTTTCATCTCTGGA TGACAAGCCCCAGTTCCCAGGGGCCTCGGCGGAGTTTATAGATAAGTTGGAATTCATCCAGCCCAACGTCATCTCTG GAATCCCCATCTACCGCGTCATGGACCGGCAAGGCCAGATCATCAACCCCAGCGAGGACCCCCACCTGCCGAAGGAG MGGTGCTGAAGCTCTACAAGAGCATGACACTGCTTAACACCATGGACCGCATCCTCTATGAGTCTCAGCGGCAGGGC CGGATCTCCTTCTP|CATGACCAACTATGGTGAGGAGGGCACGCACGTGGGGAGTGCCGCCGCCCTGGACMCACGGA CCTGGTGTTTGGCCAGTACCGGGAGGCAGGTGTGCTGATGTATCGGGACTACCCCCTGGAACTATTCATGGCCCAGT GCTATGGCAACATCAGTGACTTGGGCAAGGGGCGCCAGATGCCTGTCCACTACGGCTGCAAGGAACGCCACTTCGTC ACTATCTCCTCTCCACTGGCCACGCAGATCCCTCAGGCGGTGGGGGCGGCGTACGCAGCCAAGCGGGCCAATGCCAA CAGGGTCGTCATCTGTTACTTCGGCGAGGGGGCAGCCAGTGAGGGGGACGCCCATGCCGGCTTCAACTTCGCTGCCA CACTTGAGTGCCCCATCATCTTCTTCTGCCGGAACAATGGCTACGCCATCTCCACGCCCACCTCTGAGCAGTATCGC GGCGATGGCATTGCAGCACGAGGCCCCGGGTATGGCATCATGTCAATCCGCGTGGATGGTAATGATGTGTTTGCCGT ATACAACGCCACAAAGGAGGCCCGACGGCGGGCTGTGGCAGAGAACCAGCCCTTCCTCATCGAGGCCATGACCTACA GGATCGGGCACCACAGCACCAGTGACGACAGTTCAGCGTACCGCTCGGTGGATGAGGTCAATTACTGGGATAAACAG GACCACCCCATCTCCCGGCTGCGGCACTATCTGCTGAGCCAAGGCTGGTGGGATGAGGAGCAGGAGAAGGCCTGGAG GAAGCAGTCCCGCAGGAAGGTGATGGAGGCCTTTGAGCAGGCCGAGCGGAAGCCCAAACCCAACCCCAACCTACTCT TCTCAGACGTGTATCAGGAGATGCCCGCCCAGCTCCGCAAGCAGCAGGAGTCTCTGGCCCGCCACCTGCAGACCTAC GGGGAGCACTACCCACTGGATCACTTCGATAAGTGA
[0045] El-α亚基蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:2 ;下划线为EX2-4编码的氨基酸；加框 的为第131位）：
[0046] MAVAIAAARVffRLNRGLSQAALLLLRQPGARGLARSHPPRQQQQFSSLDDKPQFPGASAEFIDKLEFIQ PNVISGIPIYRVMDRQGQIINPSEDPHLPKEKVLKLYKSMTLLNTMDRIL面ESQRQGRISFYMTNYGEEGTHVGSAA ALDNTDLVFGQYREAGVLMYRDYPLELFMAQCYGNISDLGKGRQMPVHYGCKERHFVTISSPLATQIPQAVGAAYAA KRANANRWICYFGEGAASE ⑶ AHAGFNFAATLECPIIFFCRNNGYAISTPTSEQYRGDGIAARGPGYGMSIRVDG NDVFAVYNATKEARRRAVAENQPFLIEAMTYRIGHHSTSDDSSAYRSVDEVNYWDKQDHPISRLRHYLLSQGWWDEE QEKAWRKQSRRKVMEAFEQAERKPKPNPNLLFSDVYQEMPAQLRKQQESLARHLQTYGEHYPLDHFDK

【具体实施方式】
[0047] 本研究对一个被诊断为MSUD的患者进行BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD基因的捕获测 序。测序后进行变异检测。然后，将检测的变异与dbSNP数据库、千人基因组数据库、HapMap 数据库、HGMD数据库、LSMD数据库和正常人的数据进行比较，最后找到BCKDHA基因的未报 道过的复合杂合突变：BCKDHA基因的错义突变c. 392A>G (或支链α-酮酸脱氢酶复合体 El-α亚基蛋白的错义突变p. Tyrl31Cys)和EX2-4DUP。其中，基因BCKDHA编码支链α-酮 酸脱氢酶复合体ΕΙ-α亚基。
[0048] 样本采集
[0049] 我们接受了一个到医院就诊的来自北京的MUSD患者，3岁，其生产过程正常没有 窒息情况，6个月是被诊断为肌迟缓，经一系列检查，其MRI和脑电图均不正常。其血浆的定 量氨基酸分析结果显示，亮氨酸+异亮氨酸总量为715. 4808 μ Μ (参考值120-190 μ Μ)，酪 氨酸总量为452. 3789 μ Μ (参考值200-425 μ Μ)。我们采集了该患者和其父母亲的外周血 并提取了基因组DNA。除此之外，本研究还采集了 455个正常人的外周血并提取了其基因组 DNA。
[0050] 与所有受试者或其监护人签订书面的知情许可。
[0051] 芯片设计、文库构建和高通量测序
[0052] 发明人用定制的捕获芯片（NimblGen，Roche)结合Solexa Hiseq2000高通量测序 技术对该患者的BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD基因进行了捕获测序，具体如下：
[0053] 1)我们设计了一张捕获芯片（NimblGen，Roche)对4个基因的外显子、剪接位点和 邻近的内含子序列进行捕获。
[0054] 2)将基因组DNA随机打断成150_200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上 接头，制备文库(参见http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明 书)。
[0055] 3)文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与定制的捕 获阵列进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq2000,读取长度为90bp。
[0056] 变异检测、注释及与数据库比较
[0057] 1)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Softwarel. 7进行处 理。然后过滤低质量读段和包含接头污染读段。使用BWA (versi〇n0.5.9-rl6)(可参 见 Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics2010;26(5) :589-595)将高质量读段比对到参考基因组，获得 比对到基因组上的唯一比对读段。然后利用SOAPsnp (可参见：Li R，Li Y，Fang X，Yang H, et al, SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res2009, 19(6) :1124-1132.，通过参照将其全文并入本文）和 GATK (version vl. 0· 4705)(可参见McKenna, A, Hanna M, Banks E, et al. The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research2010;20(9) :1297-1303)分别进行 SNP 和 indel 的检测。
[0058] 2)对于检出的SNP和indel变异，我们利用内部的流程进行注释，即确定变异所处 基因组环境，以及变异的类型。我们关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插 入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。我们将检出的变异和dbSNP数据库、千 人基因组数据库、HapMap数据库、HGMD数据库和LSMD数据库等公共数据库以及正常人的数 据进行了比较。我们选出了 HGMD数据库和LSMD数据库中包含的变异以及位于编码区和剪 接位点区的先前未报道过的变异，然后和我们的内部对照数据库进行比较。对于位于疾病 已知基因上的候选致病突变，我们进行了 sanger验证。
[0059] 通过上述分析，我们在该患者的BCKDHA基因中发现未报道过的复合杂合突变：错 义突变 c. 392A>G(p. Tyrl31Cys)和 EX2-4DUP。其中，杂合错义突变 c. 392A>G(p. Tyrl31Cys) 存在于患者的母亲中，杂合突变EX2-4DUP存在于患者的父亲中，因此可判断为复合杂合突 变。我们的结果表明BCKDHA基因的功能缺失突变是导致枫糖尿病（MUSD)的原因。
[0060] 在本文中使用的靶向捕获测序又称为目标区域捕获测序，就是将研究者感兴趣的 基因组区域定制探针并与基因组DNA进行芯片杂交（NimbleGen Sequence Capture array) 或溶液杂交（Agilent Sure-Select System),将目标基因区域DNA富集后再利用新一代测 序技术进行测序的研究策略。目标区域可以是连续的DNA序列，也可以是分布在同一染色 体不同区域或不同染色体上的片段。目前，由于其高通量、低成本和大大缩短的实验周期， 目标区域测序逐渐在临床分子诊断中得到广泛应用。
[0061] 在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。c. 392A>G表示cDNA第392位核苷 酸由A变成G ;p. Tyrl31Cys表示蛋白质水平第131位密码子由Tyr变成Cys ;EX2-4DUP表 示cDNA和/或蛋白质水平外显子2-4重复。
[0062] 在本发明中，除非另外说明，否则A和/或B，等价于以下三种情况：A ;B ;A和B。
[0063] 对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实 际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数 情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及BCKDHA基因的 cDNA序列，实际上可以包括/或不包括该序列以及其互补序列。例如，提及SEQ ID NO: 1, 实际可以包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反 之亦然。
[0064] 本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被 公开。例如提及BCKDHA基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。
[0065] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理 解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用 试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0066] 实施例1
[0067] 基因组提取
[0068] 采集所有受试者的外周血，利用QIAamp DNA BloodMiNi Kit (Qiagen, Hilden, Germany)依照制造商提供的方案提取基因组DNA。
[0069] 实施例2
[0070] 芯片设计、文库构建和高通量测序
[0071] 本发明人设计了一张捕获芯片（NimblGen，Roche)对 BCKDHA、BCKDHB、DBT 和 DLD 这4个基因的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。
[0072] 文库构建的方法可参考Illumina公司提供的方案（http://www. illumina. com/)。现简单描述如下：利用超声波仪（Covaris S2, Massachusetts, USA)将基因组DNA随 机打断成200-300bp的片段。取1 μ g (用Nanodrop定量）纯化DNA片段用T4DNA聚合酶、 T4磷酸核苷酸激酶和大肠杆菌（Escherichia coli)DNA聚合酶的Klenow片段进行处理，补 平5'突出末端和去除3'突出末端。在3'末端添加 A碱基以后再连接上接头序列。添加 接头以后，利用包含8bp标签序列（barcode sequence)的PCR引物进行4个循环的PCR得 到捕获前的文库。将10个文库混合后与捕获芯片进行72小时杂交。杂交完成以后，利用 300ml 洗脱缓冲液（SeqCap EZ Hybridization and Wash Kit ;Qiagen, Valencia, CA, USA) 对结合到芯片上的DNA片段进行洗脱。在自制的洗脱设备上95°C洗脱20分钟，然后添加 200ml洗脱缓冲液进行一次重复洗脱。参照Illumina标准的成簇和测序的方案，我们利用 Illumina Hiseq2000进行了测序，读取长度为90bp。
[0073] 实施例3
[0074] 变异检测、注释及与数据库比较
[0075] 1)测序完成以后，利用Illuminal. 3. 4进行图像分析、错误率估计和碱基读取，获 得原始数据。然后过滤低质量读段（read)和包含接头污染读段。我们将包含超过10%的N 碱基的读段、50%的质量值小于5的碱基占读段使用BWA将高质量读段比对到参考基因组， 获得比对到基因组上的唯一比对读段。然后利用SOAPsnp和GATK分别进行SNP和indel 的检测。
[0076] 2)对于检出的SNP和indel变异，我们利用内部的流程进行注释，即确定变异所 处基因组环境，以及变异的类型。我们关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区 插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。我们将检出的变异和dbSNP数据库、 千人基因组数据库、HapMap数据库、HGMD数据库和LSMD数据库等公共数据库进行了比较。 我们选出了 HGMD数据库和LSMD数据库中包含的变异以及位于编码区和剪接位点区的先前 未报道过的变异，然后和我们的内部对照数据库进行比较。
[0077] 发现BCKDHA基因的未报道过的复合杂合突变：错义突变c. 392A>G(p. Tyrl31Cys) 和 EX2-4DUP。
[0078] 实施例4
[0079] 分别对家系内1个患者样本和2个非患者样本进行Sanger测序，确定错义突变 c.392A>G (p.Tyrl31Cys)。具体方法步骤如下：
[0080] 1) DNA 提取：
[0081] 采集患者和其父母的外周静脉血用QIAamp DNA BloodMiNi Kit(Qiagen, Hilden, Germany)方法提取基因组DNA,DNA用于以下步骤2)反应体系中的DNA 模板。
[0082] 2)引物设计及PCR扩增反应
[0083] a)引物序列
[0084] 用于扩增该突变c. 392A>G位点的引物：
[0085] 上游引物 F :AGCAGTCTGGCAGCGTCTTCTTA (SEQ ID N0:3)
[0086] 下游引物 R :GCTCCTTAGACCTTCCTGGCACTA (SEQ ID N0:4)
[0087] b)反应体系：
[0088] 反应采用25 μ 1体系，其中：酶及缓冲溶液均购自KATARA公司。
[0089]

【权利要求】
1. 一种枫糖尿病的生物标记物，所述生物标记物包括突变的BCKDHA基因和/或支链 α-酮酸脱氢酶复合体El-α亚基蛋白， BCKDHA基因的突变是c. 392A>G，支链α-酮酸脱氢酶复合体El-α亚基蛋白的突变是 ρ·Tyrl31Cys〇
2. 权利要求1的生物标记物，所述生物标记物还包括EX2-4DUP。
3. 权利要求1或2的生物标记物，所述突变BCKDHA基因为SEQ ID NO: 1的序列中具有 以下突变： c.392A>G。
4. 一种检测受试者的BCKDHA基因和/或支链α -酮酸脱氢酶复合体El- α亚基蛋白 中是否存在突变位点以及拷贝数变异的方法，所述突变位点以及拷贝数变异选自如下任一 种或其组合： BCKDHA基因突变c. 392A>G，支链α -酮酸脱氢酶复合体El-α亚基蛋白突变 ρ·Tyrl31Cys ;和 EX2-4DUP。
5. 权利要求4的方法，包括如下至少一组引物扩增的步骤： SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ; SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO:10。
6. 检测突变BCKDHA基因和/或支链a-酮酸脱氢酶复合体El-α亚基蛋白中使用的 引物对，所述突变是选自如下任一种或其组合： BCKDHA基因突变c. 392A>G，支链α -酮酸脱氢酶复合体El-a亚基蛋白突变 ρ·Tyrl31Cys ;和 EX2-4DUP, 其中所述引物对分别基于选自如下的位铬在基因组序列或cDNA序列上前后设计，使 得扩增该位铬：BCKDHA基因 cDNA序列第392位。
7. 与突变BCKDHA基因互补的核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合： BCKDHA 基因突变 c. 392A>G， 所述探针与突变BCKDHA基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA序列上的位 铬：BCKDHA基因 cDNA序列第392。
8. 检测突变BCKDHA基因和/或支链α-酮酸脱氢酶复合体El-a亚基蛋白的试剂盒， 包含一组或多组引物对，并且/或者包含一个或多个核酸探针，其中所述突变是选自如下 任一种或其组合： BCKDHA基因突变c. 392A>G，支链α -酮酸脱氢酶复合体El-a亚基蛋白突变 ρ·Tyrl31Cys ;和 EX2-4DUP, 其中所述引物对分别基于选自如下的位铬在基因组序列或cDNA序列上设计，使得其 扩增产物涵盖该位铬：BCKDHA基因 cDNA序列第392位。
9. 权利要求8的试剂盒，所述引物对选自如下的一组或两组： SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ; SEQ ID NO:5 至 SEQ ID NO:10。
【文档编号】C12Q1/68GK104099349SQ201310118898
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月8日 优先权日:2013年4月8日
【发明者】魏晓明, 朱倩 申请人:深圳华大基因科技有限公司