检测鸭mapk1基因的荧光定量rt-pcr方法

检测鸭mapk1基因的荧光定量rt-pcr方法
【专利摘要】本发明提供了检测鸭MAPK1基因的荧光定量RT-PCR方法，属于基因工程领域。本发明通过基因克隆的方法获得了鸭MAPK1的全基因序列，并建立了一种快速检测鸭体内MAPK1基因表达水平的荧光定量RT-PCR方法。本发明提供的鸭MAPK1基因序列如SEQ?ID?NO.1所示，用于特异性检测该基因的荧光定量PCR引物序列如SEQ?ID?NO.3和4所示。本发明方法具有检测准确、灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有优异的检测能力，可用于研究鸭MAPK1在致病过程中的作用，具有良好的应用价值。
【专利说明】检测鸭MAPK1基因的荧光定量RT-PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体地，涉及鸭MAPKl基因及荧光定量检测该基因的方法。
【背景技术】
[0002]丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导生长、发育、分裂、分化、死亡以及细胞间的功能同步等多种细胞过程。在哺乳动物细胞中已发现和克隆了 ERK、JNK/SAPK、p38/RK和ERK5/BMK1四个MAPK亚族。这些MAPK能被多种炎性刺激所激活，并对炎症的发生、发展起重要调控作用。不同MAPK亚族被其上游激酶激活后，可通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白和酶类等多种底物来调节多种细胞生理过程，包括炎症、应激、细胞生长、发育、分化、死亡和功能同步化等。MAPK亚族成员对下游蛋白激酶的磷酸化是发挥其生理作用的重要方式。丝裂原活化蛋白激酶I(MAPKl)又称为细胞外信号调节激酶2 (extracellular signal-regulatedkinase2, ERK2)，其分子量为 42KDa。
[0003]与人和哺乳动物相比，禽类MAPKl的研究相对滞后，目前只有关于鸡MAPKl的部分研究报道。鸭MAPKl基因未见报道，为研究鸭MAPKl在鸭发病过程中的作用以及其在鸭体内的表达水平，急需建立一种快速、准确、敏感的检测方法。荧光定量RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、自动化程度高等特点，现已被广泛地应用于分子生物学及医学等研究领域，发挥着重大作用。目前将荧光定量RT-PCR用于检测鸭MAPKl基因的方法还未见报道。

【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供鸭MAPKl基因的全基因序列。
[0005]本发明的另一目的在于提供一种快速检测鸭体内MAPKl表达水平的荧光定量RT-PCR 方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007](I)根据GenBank上发表的鸡MAPKl基因序列(登录号:NM_204150)，用PrimerPremier5.0软件设计上游引物MAPKl-AF和下游引物MAPK1-AR(核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示)。提取鸭脾脏总RNA，用Random Primer (由单链六聚体组成，六个碱基的随机组合，购自Promega公司)为反转录的引物，以RNA为模板合成cDNA。以cDNA为模板，MAPK1-AF/MAPK1-AR为引物，PCR扩增MAPKl基因。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析、回收。将回收的PCR产物通过连接、转化、提取阳性克隆测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为PMD18-MAPK1。
[0008](2)使用 3’ full RACE Kit 和 5’ full RACE Kit，根据 RACE 操作的要求，在测序正确的区域设计3’端和5’端特异性引物。提取鸭脾脏总RNA，按照3’ full RACE Kit试剂盒说明书进行 3’ full RACE 实验。用 MAPK1-3GSP1 (SEQ ID N0.7)和 3’ RACE OuterPrimer (SEQ ID N0.9)进行 Outer PCR 反应，MAPK1-3GSP2 (SEQ ID N0.8)和 3’RACE InnerPrimer (SEQ ID N0.10)进行Inner PCR反应。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物、回收。将回收的PCR产物与载体连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为3’ -pMD18-MAPKl。
[0009](3)提取鸭脾脏总RNA，按照5’ full RACE Kit试剂盒说明书进行5’ full RACE实验。用 MAPK1-5GSP1 (SEQ ID N0.11)和 5’RACE Outer Primer (SEQ ID N0.13)进行Outer PCR 反应，MAPK1-5GSP2 (SEQ ID N0.12)和 5，RACE Inner Primer (SEQ ID N0.14)进行Inner PCR反应。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物、回收。将回收的PCR产物与PMD18-T连接，将连接产物转入DH5 α感受态中，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为5’ -pMD18-MAPKl。
[0010](4)将 pMD18-MAPKl、3’ -PMD18-MAPK1 和 5’ -pMD18-MAPKI 质粒的测序结果进行拼接，得到鸭MAPKl的全基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]因此，本发明提供了克隆鸭MAPKl基因的方法，包括以下步骤:
[0012](I)提取鸭脾脏总RNA，反转录为cDNA ；以cDNA为模板，MAPK1-AF和MAPKl-AR为引物，PCR扩增MAPKl基因；扩增产物回收后与PMD18-T载体连接、转化、提取阳性克隆测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为PMD18-MAPK1 ;上游引物MAPKl-AF和下游引物MAPKl-AR的核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示；
[0013](2)提取鸭脾脏总 RNA，用 MAPK1-3GSP1 和 3’ RACE Outer Primer 进行 Outer PCR反应，MAPK1-3GSP2和3’ RACE Inner Primer进行Inner PCR反应，将回收的PCR产物与PMD18-T载体连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为3’ -pMD18-MAPKl ；MAPK1-3GSP1和MAPK1-3GSP2，核苷酸序列如SEQID N0.7 和 8 所不，3’ RACE Outer Primer 和 3’ RACE Inner Primer 核苷酸序列如 SEQ IDN0.9和10所示；
[0014](3)提取鸭脾脏总 RNA，用 MAPK1-5GSP1 (SEQ ID N0.11)和 5 ’ RACE Outer Primer(SEQ ID N0.13)进行 Outer PCR 反`应，MAPK1-5GSP2 (SEQ ID N0.12)和 5’ RACE InnerPrimer (SEQ ID N0.14)进行Inner PCR反应，将回收的PCR产物与pMD18_T连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为5，-pMD18-MAPKl ；MAPK1-5GSP1 和 MAPK1-5GSP2，核苷酸序列如 SEQ ID N0.11 和 12 所示，5’ RACE Outer Primer 和 5’RACE Inner Primer 的核苷酸序列如 SEQ ID N0.13 和 14 所示；
[0015](4)将 pMD18-MAPKl、3’ -pMD18-MAPKl 和 5’ -pMD18-MAPKI 质粒的测序结果进行拼接，得到鸭MAPKl的全基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。在本发明的一个实施例中，提取樱桃谷鸭的脾脏总RNA作为实验用RNA。
[0016]本发明提供了一种用于检测鸭MAPKl基因的遗传标记物，其核苷酸序列具有SEQID N0.2所示的序列或其特异性片段。
[0017]本发明提供了用于扩增上述遗传标记物的引物。
[0018]本发明提供的用于扩增上述遗传标记物的引物，其上游引物MAPKl-TR-F和下游引物MAPKl-TR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和4所示。
[0019]本发明还提供了一种检测鸭MAPKl基因的方法，通过提取鸭组织总RNA，反转录得到cDNA，以其为模板，利用SEQ ID N0.3和4所示的引物进行荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
[0020]进一步地，本发明检测鸭MAPKl基因的实时荧光定量PCR的反应体系为:20μL反应体系的具体配置为:2XGo Taq1* qPCR Master MixlO μ L，上游引物MAPKl-TR-F和下游引物 MAPKl-TR-R 各 0.5 μ L，cDNAl μ L,去核酸水 8 μ I。
[0021]所述实时荧光定量PCR的反应程序为:95°C IOmin ;95°C变性15s，60°C退火lmin，40个循环。
[0022]含有上游引物MAPKl-TR-F和下游引物MAPKl-TR-R的试剂盒也属于本发明的保护
范围。
[0023]本发明还提供了上述试剂盒在检测鸭MAPKl基因中的应用。
[0024]本发明获得鸭MAPKl基因及其序列，在国际上属于首创。为后续研究鸭MAPKl基因及其作用提供依据。本发明提供的荧光定量RT-PCR方法检测鸭MAPKl基因的特异性序列，该方法具有检测准确、灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有优异的检测能力，可用于研究鸭MAPKl在致病过程中的作用，具有良好的应用价值。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1为鸭MAPKl部分序列片段克隆。
[0026]图2为鸭MAPKl基因3’ full RACE实验，I号泳道为3’ Inner PCR产物。
[0027]图3为鸭MAPKl基因5’ full RACE实验，I号泳道为5’ Inner PCR产物。
[0028]图4为优化荧光定量RT-PCR检测鸭MAPKlmRNA退火温度。
[0029]图5为荧光定量RT-PCR引物特异性实验的线性扩增曲线。
[0030]图6为荧光定量RT-PCR标准曲线。
[0031]图7为荧光定量RT-PCR特异性试验线性扩增曲线。
[0032]图8为荧光定量RT-PCR敏感性试验线性扩增曲线。
[0033]图9为荧光定量RT-PCR检测细菌感染病鸭脾组织中MAPKlmRNA的表达量。
【具体实施方式】
[0034]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所用樱桃谷鸭购自江苏省某试验鸭场。
[0035]实施例1鸭丝裂原活化蛋白激酶(MAPKl)基因克隆以及全基因序列测定
[0036](I)根据GenBank上发表的鸡MAPKl基因序列(登录号:NM_204150)，用PrimerPremier5.0软件设计扩增鸭MAPKl基因的上游引物和下游引物:分别为MAPKl-AF:5’ -AAGTGTTCGACGTGGGG-3’ (SEQ ID N0.5) ;MAPK1_AR:5’-TCCTTCGGCAAGTCATC-3’ (SEQID N0.6),目的基因大小约为 973bp (SEQ ID N0.15)。
[0037](2)采集樱桃谷鸭脾脏置于10倍体积的PBS中，用拍打器进行组织匀浆。吸取200 μ L组织匀浆液加入TRIzol ReagentlmL,按照TRIzoI法推荐步骤提取细胞总RNA，用DNase I去除RNA中基因组的污染，对提取的RNA进行纯度检测及定量。
[0038](3)对去除基因组污染的RNA采用Random Primer (由单链六聚体组成,六个碱基的随机组合，购自Promega公司)作为引物,参照MMLV反转录酶(Promega公司)说明书提供的方法进行反转录。采用2(^1^反转录反应体系:总1?嫩2~44 8，Oligo dT(25ymol/L) I μ L, Random Primer (25 μ mol/L) I μ L, M-MLV (200U/ μ L) I μ L, 5 XM-MLV 缓冲液 5 μ L，dNTP (IOmmoI/L) 4 μ L，RRI (40U/ μ L) I μ L,最后补加无 RNase 水至 20 μ L。
[0039](4)以cDNA为模板，MAPK1-AF/MAPK1-AR为引物，PCR扩增MAPKl基因，反应体系为20 μ L,反应条件:
[0040]预变性:94°C,4min ；
[0041]主循环:94°C,40s；50°C,40s ；72°C,90s ;循环数:30 ；
[0042]后延伸:72°C，IOmin;
[0043]PCR在eppendorf热循环仪上进行。
[0044]按上述条件进行PCR，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果见图1。PCR产物为973bp左右，与理论值大小相符，用Thermo公司胶回收试剂盒回收该片段，操作按照说明书进行。
[0045]将回收的PCR产物与pMD18-T simple连接，将连接产物转入DH5 α感受态中，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果973bp (SEQ ID N0.15)。与鸡MAPKl序列使用DNAstar软件分析，同源性98.4%，确定克隆得到鸭MAPKl部分序列片段，质粒命名为PMD18T-MAPK1。
[0046](5)使用 Takara 公司 3’ full RACE Kit 和 5’ full RACE Kit，根据 RACE 操作的要求，在测序正确的区域设计3’端特异性上游引物MAPK1-3GSP1和MAPK1-3GSP2，分别对应于试剂盒中下游特异 性引物3’ RACE Outer Primer和3’ RACE Inner Primer,产物大小预计分别约为500bp和300bp ;5’端特异性下游引物MAPK1-5GSP1和MAPK1-5GSP2，分别对应于上游特异性引物5’ RACE outer Primer和5’ RACE Inner Primer,产物大小预计分别约为 550bp 和 350bp。
[0047]MAPK1-3GSP1:5’ TTCTAAGGGTTACACCAAGTC3’ (SEQ ID N0.7)
[0048]3’ RACE Outer Primer:5’ TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3’ (SEQ ID N0.9)
[0049]MAPK1-3GSP2:5，CTATTTGCTTTCCCTACCAC3’ (SEQ ID N0.8)
[0050]3’RACE Inner Primer:5’CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3’(SEQ ID N0.10)
[0051]MAPK1-5GSP1:5’GTGGTCGTTGCTGAGGTGTTGAG3’ (SEQ ID N0.11)
[0052]5’ RACE outer Primer:5’ CATGGCTACATGCTGACAGCCTA3’ (SEQ ID N0.13)
[0053]MAPK1-5GSP2:5’ CTGGCAGTACGTCTGATGCTCAA3’ (SEQ ID N0.12)
[0054]5’ RACE Inner Primer:5’ CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3’ (SEQ IDN0.14)
[0055](6)采集樱桃谷鸭脾脏置于10倍体积的PBS中，用拍打器进行组织匀浆。吸取200 μ L组织匀浆液加入TRIzol ReagentlmL,按照TRIzol法推荐步骤提取细胞总RNA，用DNase I去除RNA中基因组的污染。将提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测。获得的RNA中28s rRNA和18s rRNA两条带清晰完整，基本无拖尾，说明本实验获得的RNA较完整、无降解。对提取的RNA进行纯度检测及定量，结果表明其A260/A280比值1.928，浓度为I, 244μ g/mL，说明RNA的含量和纯度可以满足后续试验要求。
[0056](7)按照3’ full RACE Kit试剂盒说明书步骤进行3’ full RACE实验，使用MAPK1-3GSP1 和 3’ RACE Outer Primer 进行 Out PCR 反应。[0057]反应条件为:
[0058]预变性:94°C，3min;
[0059]主循环-MV，30s；55°C，30s ；72°C, 60s ;循环数:20 ；
[0060]后延伸:72°C，IOmin;
[0061]将上述Outer PCR 反应液作为模板，使用 MAPK1-3GSP2 和 3’RACE Inner Primer进行Inner PCR反应。
[0062]反应条件为:
[0063]预变性:94°C,3min ;
[0064]主循环:94°C，30s；55°C，30s ；72°C, 60s ;循环数:25 ；
[0065]后延伸:72°C,IOmin ；
[0066]PCR在eppendorf热循环仪上进行。
[0067]反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物、回收，结果见图2。I号泳道为3’ Inner PCR产物，电泳结果不是单一条带，分析原因为mRNA不同的拼接方式，扩增的基因为多基因家族成员造成的。分别回收从大到小三个条带，将回收的PCR产物与pMD18-Tsimple连接，将连接产物转入DH5 α感受态中，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，同源性为97.7%，质粒命名为3’-pMD18-MAPKl。测序结果693bp，序列见SEQ ID N0.16，其中第l_298bp的序列为部分ORF区域。
[0068]8)按照5’ full RACE Kit试`剂盒说明书进行5’ full RACE实验。
[0069]主要通过以下几个步骤:
[0070]A)对Total RNA中裸露的5’磷酸基团进行去磷酸化处理。
[0071]B)去掉5’帽子结构，保留一个磷酸集团。
[0072]C)5，RACE Adaptor 连接。
[0073]D)反转录反应。
[0074]根据MAPK1-5GSP1 和 5’ RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应。
[0075]a.反应体系:
【权利要求】
1.鸭MAPKl基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.一种克隆鸭MAPKl基因的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取鸭脾脏总RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，MAPKl-AF和MAPKl-AR为引物，PCR扩增MAPKl基因；扩增产物回收后与pMD18-T载体连接、转化、提取阳性克隆测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为PMD18-MAPK1 ;上游引物MAPKl-AF和下游引物MAPKl-AR的核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示； (2)提取鸭脾脏总RNA，用 MAPK1-3GSP1 和 3，RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应，MAPK1-3GSP2 和 3’ RACE Inner Primer 进行 Inner PCR 反应，将回收的 PCR 产物与PMD18-T载体连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为3’ -pMD18-MAPKl ；MAPK1-3GSP1和MAPK1-3GSP2，核苷酸序列如SEQID N0.7 和 8 所不，3’ RACE Outer Primer 和 3’ RACE Inner Primer 核苷酸序列如 SEQ IDN0.9和10所示； (3)提取鸭脾脏总RNA，用 MAPK1-5GSP1 (SEQ ID N0.11)和 5’RACE Outer Primer(SEQ ID N0.13)进行 Outer PCR 反应，MAPK1-5GSP2 (SEQ ID N0.12)和 5’ RACE InnerPrimer (SEQ ID N0.14)进行Inner PCR反应，将回收的PCR产物与pMD18_T连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为5，-pMD18-MAPKl ；MAPK1-5GSP1 和 MAPK1-5GSP2，核苷酸序列如 SEQ ID N0.11 和 12 所示，5’ RACE Outer Primer 和 5’ RACE Inner Primer 的核苷酸序列如 SEQ ID N0.13 和 14 所示； (4)将pMD18-MAPKl、3’ -pMD18_MAPKl 和 5’ -pMD18_MAPKl 质粒的测序结果进行拼接，得到鸭MAPKl的全基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.一种用于检测鸭MAPKl基因的遗传标记物，其特征在于，其核苷酸序列具有SEQ IDN0.2所示的序列或其特异性片段。`
4.用于扩增权利要求3所述遗传标记物的引物。
5.如权利要求4所述引物，其特征在于，其上游引物MAPKl-TR-F和下游引物MAPKl-TR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和4所示。
6.一种检测鸭MAPKl基因的方法，其特征在于，提取鸭组织总RNA，反转录得到cDNA，以其为模板，利用SEQ ID N0.3和4所示的引物进行荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
7.如权利要求6所述的检测鸭MAPKl基因的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应体系为:20yL反应体系的具体配置为:2XGo TaqK qPCR Master MixlOy L，上游引物MAPKl-TR-F 和下游引物 MAPKl-TR-R 各 0.5 μ L，cDNAl μ L,去核酸水 8 μ I。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为:95V IOmin ;95°C变性 15s，60。。退火 lmin,40 个循环。
9.含有权利要求4或5所述引物的试剂盒。
10.权利要求9所述的试剂盒在检测鸭MAPKl基因中的应用。
【文档编号】C12N15/54GK103882039SQ201310435432
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】于圣青, 曹守林, 韩先干, 王少辉, 丁铲, 田明星 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所