一种双层平板及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种双层平板及其制备方法。利用嗜酸酵母(Candida?digboiensisZBY)，保藏编号:CCTCC?NO:M2013311制作双层平板中的底层培养基，筛选自养浸矿微生物。与传统方法相比，本发明极大地提高了浸矿微生物分离筛选的效率，同时也为研究浸矿微生物遗传和代谢提供了一条可行的途径。
【专利说明】一种双层平板及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于浸矿微生物筛选的产品【技术领域】，具体涉及一种用于浸矿微生物筛选的双层平板及其制备方法，和菌株。【背景技术】
[0002]生物冶金利用微生物氧化硫化矿等矿物中的铁和硫，使结合在矿石中的有价金属释放到溶液中以利于进一步提取。浸矿微生物主要包括自养的铁氧化菌和硫氧化菌，它们利用硫化矿中的Fe2 +或者还原型的硫化物(如黄铁矿Fe2S)作为能源生长，产生硫酸促进硫化矿的浸出，因此，筛选出高效浸矿微生物是生物冶金的关键。
[0003]固体培养基通常用于浸矿微生物的分离和培养，然而浸矿微生物主要是自养菌，琼脂等凝固剂中的有机物质及其水解产物对浸矿微生物生长有抑制作用，酸性的固体培养基难以制作，所以浸矿微生物通常难以在固体平板上产生大量有特色的菌落供菌株筛选、选育及遗传特性研究。因此，高活性的浸矿微生物菌种资源缺乏，浸矿机理不明，导致生物浸出技术浸出速率慢，限制其大规模工业化应用。
[0004]为提高浸矿微生物检出率并缩短培养周期，双层平板方法发明并用于该类微生物的分离筛选。双层平板中采用底层涂布嗜酸的(Candida digboiensis sp.)等异养菌以除去培养基中的有毒有机物质，上层用于化能自养菌的筛选。双层平板中的培养基成分也不断改进，但目前该方法仍存在很大挑战。
[0005]本发明筛选了一种嗜酸酵母，利用其设计了一种新型的分离纯化极端浸矿菌的双层平板，该酵母菌除去培养基中的有毒有机物质的作用明显，成功的实现了浸矿菌的固体平板培养及纯化。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是通过筛选酸性浸矿体系中的嗜酸酵母，提供一种利用该菌建立的快速筛选浸矿微生物的双层平板及其制备方法，以丰富浸矿微生物资源，成功的实现浸矿菌的固体平板培养及纯化。
[0007]一种双层平板，是在双层培养基平板的底层平板中接种有嗜酸酵母(CandidadigboiensisZBY),所述的嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的保藏编号为:CCTCC NO:M2013311。
[0008]所述的双层平板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0009]I)挑选嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)单菌落置于含lwt%的葡萄糖和
0.025wt%的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)的5mL9k液体培养基中活化至菌液浓度达到IO9个/mL以上，取占体积比10%的活化好的培养液加入含1%葡萄糖的9K液体培养基中，得到酵母菌培养液；
[0010]2)分别配制以下三种溶液:(a)pH=2.0的2X9K液体培养基(即培养基中，每种成分的浓度均为2倍)，(b)pH=2.0的250mM的硫酸亚铁溶液，其中含IOmM K2S4O6 ； (c)pH=4.5的3wt%琼脂糖溶液；50°C时将(a) (b) (c)三种溶液按体积比4:1:5混合，制备成分离和纯化用培养基2份；
[0011]3)其中1份立即接种步骤I)得到的酵母菌培养液，接种量为培养基体积比的1%，然后倾倒在无菌培养皿中形成凝胶，另一份保温，当培养皿内的凝胶凝固，再倒入第二份无酵母的培养基，制成双层平板。
[0012]所述的酵母菌为嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY),保藏编号为:CCTCC NO:M2013311。保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学，保藏日期:2013年7月2日。
[0013]本发明筛选了一种嗜酸酵母，利用其设计了一种新型的分离纯化极端浸矿菌的双层平板，该酵母菌除去培养基中的有毒有机物质的作用明显，成功的实现了浸矿菌的固体平板培养及纯化。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1 为酵母(Candida digboiensisZBY)显微形态；
[0015]图2为本发明利用酵母(Candida digboiensisZBY)制作的双层平板；
[0016]图3为本发明双 层平板筛选的浸矿微生物菌落形态和扫描电子显微镜照片(SEM)图像；
[0017](a)底层接种酵母，上层接种浸矿微生物的双层平板；
[0018](b) Zl 菌的 SEM 图像；
[0019](c) Z2 菌的 SEM 图像。
【具体实施方式】
[0020]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0021]实施例1嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的分离筛选和鉴定:
[0022]采集酸性矿坑水10mL，用含1%葡萄糖的9K液体培养基90mL富集培养，9K培养基成分为(g/L): (NH4)2S043.0, KC10.1, K2HPO40.5，MgSO4.7Η200.5，Ca(NO3)20.01，H2OlOOOmL,ρΗ=2.5，培养温度35°C，转速200rpm。2天后，当菌液浓度达到IO9个/mL时，取IOmL培养液于90mL新鲜的9K液体培养基(含1%葡萄糖)中富集培养，此过程重复四次。
[0023]酸性浸矿体系中异养微生物分离纯化采用单层平板。将pH=2.0的2X9K液体培养基和pH=4.5的3%琼脂糖溶液在121°C高温灭菌30min后按1:1混合，加入过滤灭菌的1%葡萄糖和0.025%TSB，调pH值为2.5，冷却至50°C后倒入无菌培养皿中；将上述富集的培养液稀释涂布平板，35°C中培养；挑取单菌落在同样的琼脂平板上划线分离培养。此过程重复四次，得到酵母的纯培养。
[0024]含1%葡萄糖的9K平板上生长的酵母(Candida digboiensisZBY)，菌落乳白色，菌落平整，表面与边缘平整；用普通光学显微镜观察发现分离物细胞呈卵圆形，出芽生殖，有子囊孢子形成(图1)。提取嗜酸酵母基因组DNA，扩增18S rDNA序列，结合形态特征、18SrDNA基因序列鉴定为酵母(Candida digboiensisZBY)。菌种由中国典型培养物保藏中心保藏，编号:CCTCC N0:M2013311。
[0025]实施例2利用嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)制作双层平板[0026]挑选酵母单菌落于5mL含葡萄糖(1%)和TSB (0.025%)的9k液体培养基中活化至菌液浓度达到IO9个/mL时，取5mL培养液于45mL新鲜的9K液体培养基(含1%葡萄糖)中，使其具有良好的活性。[0027]分别配制以下三种溶液用于双层平板的制作:(a)pH=2.0的2X9K培养基，121°C高温灭菌30分钟；(b)pH=2.0的250mM硫酸亚铁溶液(含K2S4O6IOmM), 0.2 μ m的尼龙膜过滤；(c)pH=4.5的3%琼脂糖溶液，121°C高温灭菌30分钟。50°C时将(a) (b) (c)三种溶液按体积比4:1:5混合，制备分离和纯化用固体培养基2份，其中1份立即接种活化好的酵母(接种量1%)，然后倾倒在无菌培养皿中形成薄的凝胶；另一份50°C保温，当培养皿内的凝胶凝固，再倒入第二份无酵母的培养液，待其凝固。制成双层平板(如图2所示)。
[0028]实施例3利用双层平板筛选浸矿微生物:
[0029]取IOmL酸性矿坑水至90ml含有250mM硫酸亚铁的9K培养基中富集培养，选取待分离菌种的最适的pH值和温度,置于转速为200rpm/min的摇床上培养。当溶液变红，取IOml的培养液转移到90ml新鲜的上述同种培养基中继续富集培养，此过程重复四次。将富集培养液稀释，并涂布于实施例2制备的双层平板上,置于适宜的培养箱中培养。挑选菌落在琼脂平板上划线分离，适宜条件下再培养，得到纯培养。
[0030]在未接种的培养皿中，只有酵母菌菌落在底层培养基中出现。在上层接种富集物的培养皿中，出现了酵母菌和铁氧化菌的菌落(图3a所示)。根据微生物的形态特征，在上层分离和纯化出两种浸矿细菌，分别命名为Zl和Z2。在双层琼脂平板中两种菌落都在一周内出现，它们覆盖上层培养基的表面，使培养皿变红，Zl铁氧化的速度较Z2快。Zl菌在双层平板上检出的时间比单层平板提早5d，检出菌落数约800个，检出率比单层平板提高25倍，比现有双层平板提高2倍。
[0031]通过SEM (扫描电子显微镜)观察到新菌株的形态(图3所示)。Zl为杆状细菌，直径为0.40-0.70 μ m，长1.00-2.50 μ m ;而Z2细胞呈弧形，直径为0.25-0.50 μ m，长
0.80-2.15 μ m。光学显微镜发现，Z2运动性较Zl强。Zl和Z2的形态特征与氧化亚铁硫杆菌和钩端螺旋菌属相似。16S rDNA序列分析表明，Zl和Z2分别属于氧化亚铁硫杆菌和钩端螺旋菌属。
【权利要求】
1.一种双层平板，其特征在于，是在双层培养基平板的底层平板中接种有嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY),所述的嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY)的保藏编号为:CCTCC NO:M2013311o
2.权利要求1所述的双层平板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)挑选嗜酸酵母(CandidadigboiensisZBY)单菌落置于含lwt%的葡萄糖和0.025wt%的胰蛋白胨大豆肉汤培养基的5mL9k液体培养基中活化至菌液浓度达到IO9个/mL以上，取占体积比10%的活化好的培养液加入含1%葡萄糖的9K液体培养基中，得到酵母菌培养液； 2)分别配制以下三种溶液:(a)pH=2.0的2X9K液体培养基，(b)pH=2.0的250mM的硫酸亚铁溶液，其中含IOmM K2S4O6 ； (c)pH=4.5的3wt%琼脂糖溶液;50°C时将(a) (b) (c)三种溶液按体积比4:1:5混合，制备成分离和纯化用培养基2份； 3)其中1份立即接种步骤I)得到的酵母菌培养液，接种量为培养基体积比的1%，然后倾倒在无菌培养皿中形成凝胶，另一份保温，当培养皿内的凝胶凝固，再倒入第二份无酵母的培养基，制成双层平板。
3.—种酵母菌,其特征在于,所述的酵母菌为嗜酸酵母(Candida digboiensisZBY),保藏编号为:CCTCC NO :M2013311o
【文档编号】C12N1/16GK103540519SQ201310441319
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】刘学端, 梁伊丽, 尹华群, 恩刚姆, 胡琪, 马丽媛, 肖云花, 邱冠周 申请人:中南大学