单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq?DNA聚合酶、10×buffer、dNTP?mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C～冻存管F各自装有一种单增李斯特菌主要血清型的阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液；本发明试剂盒仅一步PCR反应便可准确、快速地鉴别单增李斯特菌全部4种主要血清型，该方法价格低廉，操作简便，特异性与灵敏性好，灵敏性可达102CFU/mL，无交叉反应，结果准确可靠并简单易读，适用于大通量的分型操作。
【专利说明】单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细菌性病原血清型的鉴别诊断，基于多重PCR方法，建立鉴定单增李斯特菌主要血清型的快速分型技术，即单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用方法。
(二)【背景技术】
[0002]单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是重要的人兽鱼共患食源性病原菌,对环境耐受性强，可在较高的盐浓度(10%NaCl)以及宽泛的pH (pH4.5~9)和温度范围(O~45°C)内生长，并可形成荚膜，因而单增李斯特菌广泛存在于自然界(包括土壤、水源、植物及动物体等)，易污染各种食品(肉、奶、海产品及蔬菜等)。单增李斯特菌可引发胃肠炎、败血症、脑膜炎和流产等，其致死率(20~30%)远高于其他常见食源性病原菌，如肠炎沙门氏菌(约0.38%)、弯曲杆菌(0.02~0.1%)、弧菌(0.005~0.1%)等。2000年即被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一，其危害严重性可见一斑。
[0003]根据菌体/鞭毛抗原(0/H)的血清学反应，单增李斯特菌可分为13个血清型，SPl/2a、l/2b、l/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e 与 7 型。其中血清型 l/2a、l/2b、l/2c 与4b为主要血清型，占食品与病人分离株的99%以上；其他血清型则分离率极低。并非所有血清型均表现出相同的致病力。血清型l/2a在食品中分离率最高，但绝大多数暴发或散发的人侵袭型李斯特菌病病例由4b型引起，而胃肠炎型李斯特菌病病例多由l/2a型与l/2b型引起，其他血清型则鲜有引起人发病的案例。侵袭性李斯特菌病与胃肠炎李斯特菌病主要有如下差异:引发胃肠炎的污染食品携带菌量(pathogen load)大，发病急(18~27h),症状包括发热、腹泻、呕吐、 关节痛与头痛等，感染者大多为健康人群；而侵袭性病例主要引发免疫力低下人群的致死性症状。脑膜炎病人的4b型分离率显著高于一般患者，且4b型感染者的死亡率(26%)明显高于其他血清型感染者(16%)，提示4b型可能具有更胜一筹的毒力。因此，亟需建立可鉴别单增李斯特菌各主要血清型的快速分型方法。
[0004]目前，单增李斯特菌的血清型分型主要为血清学方法，依赖于商品化的菌体与鞭毛抗原，不仅价格昂贵，且存在操作费时、费力、交叉反应多发、试验结果不易判读等弊端，尤其不适用于大通量的分型操作。国内外通过比较基因组学方法，陆续筛选出血清型特异的基因位点，但迄今尚无单增李斯特菌主要血清型的快速分型方法。本发明将通过对血清型特异基因的分析、引物与检测条件的优化，设计一种准确、灵敏、简便、快速的多重PCR检测试剂盒，以期填补上述的空白。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种准确、灵敏、简便、快速的单增李斯特菌主要血清型分型试剂盒及使用方法。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]本发明提供一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10 X buffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F分别装有单增李斯特菌l/2a型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌l/2b型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌l/2c型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌4b型阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液，所述稀释液为高压灭菌双蒸水；所述阳性对照缓冲液为单增李斯特菌EGD-e (血清型l/2a)、单增李斯特菌54004 (血清型l/2b)、单增李斯特菌54002 (血清型l/2c)、单增李斯特菌ATCC19115 (血清型4b)分别接种在BHI培养基中，37°C培养过夜后，取菌液100°C煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用双蒸水重悬，制成阳性对照缓冲液样品；[0008]所述冻存管A中引物的序列为:
[0009]Ll-F:AGCAAAATGCCAAAACTCGT
[0010]Ll-R:CATCACTAAAGCCTCCCATTG[0011 ] L2-F:AGTGGACAATTGATTGGTGAA
[0012]L2-R: CATCCATCCCTTACTTTGGAC
[0013]L3-F:AGGGCTTCAAGGACTTACCC
[0014]L3-R:ACGATTTCTGCTTGCCATTC
[0015]L4-F:AGGGGTCTTAAATCCTGGAA
[0016]和L4-R:CGGCTTGTTCGGCATACTTA。
[0017]进一步，所述PCR反应管根据待检测样品数量定，通常试剂盒内所述PCR反应管为100 ~300 个。
[0018]进一步，优选所述冻存管A内的冻干粉是将混合液先在_80°C超低温冰箱预冻10h，再放入冻干机(干燥箱压力0.03MPa)，温度设为_40°C (升华干燥阶段)持续冻干30h，除去90%以上水分；之后温度升至25°C进行解析干燥2h (升温速率为1.50C /min),使水分含量达到5% (质量浓度)以下，获得冻干粉；所述每8 μ L混合液组成为:Taq DNA聚合酶0.4 μ L，10 X buffer3 μ L, dNTP mixture (含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 IOmM) 0.6 μ L,浓度均为 50 μ M 的 Ll-F、Ll-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F 和 L4-R 引物各 0.5 μ L，所述 dNTPmixture由终浓度均为IOmM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP构成。
[0019]进一步，所述冻存管B中裂解液终浓度组成为:体积浓度4%Triton-X100，5mg/mL NaN3, lmol/L Tris，pHS8.0 (用IOM氢氧化钠水溶液调节)，溶剂为蒸馏水，配制方法:Triton-X1004mL, NaN3 (终浓度 5mg/mL) 500mg, Tris (终浓度 lmol/L) 12.114g，用 IOM 氢氧化钠调pH至8.0,蒸懼水定容至100mL。
[0020]进一步，优选每个试剂盒有100个PCR反应管，所述冻存管A内冻干粉的量以冻干前混合液的体积计为800 μ L (满足100个PCR反应管的用量)，所述冻存管B内装有裂解液ImL,冻存管C~冻存管F各自装有阳性对照缓冲液0.5mL，冻存管G装有1.5mL稀释液(通常冻存管G内的稀释液是一次性加入冻存管A，供100次PCR反应用)，每支冻存管内装样量根据PCR管个数定，冻存管A内冻干粉的量以冻干前混合液体积计，混合液体积与冻存管G内稀释液体积比为8:15，每次PCR反应需要稀释液跟冻干粉混悬制备的混悬液15 μ L、冻存管B内裂解液10 μ L、阳性对照缓冲液5 μ L或待检样品5 μ L。
[0021]本发明还提供一种利用所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒进行单增李斯特菌主要血清型分型的方法，所述分型方法按如下步骤进行:(I)将冻存管G中稀释液加至冻存管A，重悬、混匀制成混悬液，存放于-20°C备用(PCR反应前先在室温下解冻)；所述冻干粉用量以冻干前混合液体积计，所述的冻存管G中稀释液与混合液体积比为15:8 ；
[0022](2)将冻存管B中的裂解液分别加入PCR反应管，分为对照PCR反应管和待检PCR反应管，再依次将冻存管C、冻存管D、冻存管E和冻存管F中的阳性对照缓冲液加入相应对照PCR反应管内，将待检样品加入待检PCR反应管，混合均匀，然后再向各个PCR反应管内加入步骤(1)冻存管A内的混悬液，立即进行PCR扩增；所述待检样品为单增李斯特菌接种在BHI培养基中，37°C培养过夜后，取菌液100°C煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用高压灭菌双蒸水重悬，制成待检样品；所述冻存管B中裂解液与冻存管A中混悬液的体积比为2:3，所述冻存管B中裂解液与冻存管C、冻存管D、冻存管E和冻存管F中的阳性对照缓冲液的体积比均为2:1，所述冻存管B中裂解液与待检样品体积比为2:1 ;通常PCR反应管内装有30 μ L反应液，即冻存管A内的混悬液15 μ L、冻存管B内的裂解液10 μ L、对照液或样品液5 μ L ;所述BHI培养基按BHI培养基标准配法，即3.7gBHI粉溶于IOOmL蒸馏水，高压灭菌；
[0023](3)将步骤(2)各个PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增:95°C预热3min ;95°C变性 45s，55。。退火 30s，72。。延伸 55s, 25 个循环；72°C保持 5min ；
[0024](4)将步骤(3)扩增后的产物分别在质量浓度1%琼脂糖凝胶与0.5XTBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统读取数据并记录；
[0025](5)结果判定:检测后，待检样品与冻存管C内的阳性对照溶液同时扩增出691bp条带的为单增李斯特菌l/2a型阳性；待检样品与冻存管D内阳性对照溶液同时扩增出471bp条带的为单增李斯特菌l/2b型阳性；待检样品与冻存管E内阳性对照溶液同时扩增出691bp、906bp两条条带`的为单增李斯特菌l/2c型阳性；待检样品与冻存管F内阳性对照溶液同时扩增出471bp、597bp两条条带的为单增李斯特菌4b型阳性；阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为非单增李斯特菌主要血清型；待检样品与阳性对照溶液均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。
[0026]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明提供一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，该试剂盒仅一步PCR反应便可准确、快速地鉴别单增李斯特菌全部4种主要血清型。与基于血清凝集反应的传统血清型分型方法相比，该方法价格低廉，操作简便，特异性与灵敏性好，灵敏性可达102CFU/mL，无交叉反应，结果准确可靠并简单易读，适用于大通量的分型操作。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为凝胶电泳图片，
[0028]A中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker,泳道I为血清型l/2a阳性对照品，泳道2为待检样品(l/2a型阳性)。
[0029]B中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker,泳道I为血清型l/2b阳性对照品，泳道2为待检样品(l/2b型阳性)。
[0030]C中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker,泳道I为血清型l/2c阳性对照品，泳道2为待检样品(l/2c型阳性)。[0031]D中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker,泳道I为血清型4b阳性对照品，泳道2为待检样品(4b型阳性)。
[0032]E中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker,泳道I为血清型l/2a阳性对照品，泳道2为待检样品(阴性)。
[0033]F中泳道M为2000bp DNALadder Marker,泳道I为血清型l/2b阳性对照品，泳道2为待检样品(阴性)。
[0034]G中泳道M为2000bp DNALadder Marker,泳道I为血清型l/2c阳性对照品，泳道2为待检样品(阴性)。
[0035]H中泳道M为2000bp DNALadder Marker,泳道I为血清型4b阳性对照品，泳道2为待检样品(阴性)。
[0036]I中泳道M为2000bp DNALadder Marker,泳道I为阳性对照品(未见条带)，泳道2为待检样品(阴性)。
[0037]J中泳道M为2000bp DNALadder Marker,泳道I为阳性对照品(未见条带)，泳道2为待检样品(阳性)。
(五)【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0039]实施例1单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒
[0040]一、冻存管组成
[0041]A管为冻干粉，冻干粉含量以冻干前混合液体积计，供100次PCR反应的混合液为800 μ L,每 8 μ L 混合液由 Taq DNA polymerase (市购)0.4 μ L, IOXbuffer (市购)3uL,dNTP mixture0.6 μ L (市购，dATP、dCTP、dGTP和dTTP终浓度均为IOmM),引物(上海英骏生物技术有限公司合成)Ll-F, Ll-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F、L4-R 各 0.5 μ L (各条引物浓度均为50 μ Μ)组成；冻干粉的制备是先将混合液在_80°C超低温冰箱预冻IOh ;再放入冻干机(干燥箱压力0.03MPa)，温度设为-40°C (升华干燥阶段)持续冻干30h，除去90%以上水分；之后温度升至25°C进行解析干燥2h (升温速率为1.5°C /min)，使水分含量达到5%以下，制得冻干粉，保存于_20°C。
[0042]B 管装有 ImL 裂解液，配制方法:Triton-X1004mL, NaN3 (终浓度 5mg/mL) 500mg,Tris (终浓度lmol/L) 12.114g,用IOM氢氧化钠水溶液调pH至8.0,蒸懼水定容至IOOmL,保存于_20°C。
[0043]C-F管各自装有0.5mL溶液，为4种阳性对照品(单增李斯特菌l/2a型、l/2b型、l/2c型和4b型阳性对照缓冲液)，保存于_20°C。
[0044]G管含有1.5mL溶液，为稀释液(即高压灭菌双蒸水)，保存于4°C。
[0045]引物序列:
[0046]Ll-F:AGCAAAATGCCAAAACTCGT
[0047]Ll-R:CATCACTAAAGCCTCCCATTG
[0048]L2-F:AGTGGACAATTGATTGGTGAA
[0049]L2-R: CATCCATCCCTTACTTTGGAC[0050]L3-F:AGGGCTTCAAGGACTTACCC
[0051]L3-R:ACGATTTCTGCTTGCCATTC
[0052]L4-F:AGGGGTCTTAAATCCTGGAA
[0053]L4-R: CGGCTTGTTCGGCATACTTA
[0054]PCR 反应管 100 个。
[0055]二、加样及检测步骤说明
[0056](I)将冻存管G中1.5mL稀释液加至冻存管A (冻存管A内混合液冻干前体积为800 μ L),重悬、混匀制成混悬液,存放于-20°C备用；
[0057](2)将冻存管B中的裂解液10 μ L分别加入5个(每管10 μ L裂解液)PCR反应管，分为对照PCR反应管C-F和待检PCR反应管，再将冻存管C-F中的阳性对照溶液5 μ L分别加入对照PCR反应管C-F中，将待检样品5 μ L加至待检PCR反应管内，混合均匀，然后将步骤(I)冻存管A中的混悬液15 μ L分别加入上述对照PCR反应管C-F和待检PCR反应管，立即进行PCR扩增；
[0058](3)将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪(Life Technologies，Veriti)上进行扩增:95°C 3min ；95°C 45s, 55°C 30s, 72°C 55s，25 个循环；72°C 5min ；
[0059](4)将扩增后的产物在质量浓度1%琼脂糖凝胶、0.5XTBE缓冲液中电泳，经Goldview染色(市购)后用凝 胶成像系统(上海天能4500SF)读取数据并分析结果。
[0060]实施例2单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用
[0061]下面通过试验对本发明的使用效果进行论证和描述。
[0062]I材料与方法
[0063]1.1菌株及培养
[0064]将134株单增李斯特菌(分离来源见表1)进行扩大培养，经选择性显色培养基(CHROM agar,法国科玛嘉)与Vitek (法国梅里埃)方法进行菌种确证,均为单增李斯特菌，为便于实验将除参考株外的各个菌株进行编号(详见表1，M4至SH4行、Ml至SH3行、M9至NB28行、M5至125SL1行、M7至Wl-1ll行)。与单增李斯特菌亲缘关系较近、G + C含量低的革兰氏阳性菌(G+1ot)如无害李斯特菌(Listeria innocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii )、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri )、塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)、腊样芽抱杆菌(Bacillus cereus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus, equi subsp.zooepidemicus)、嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)以及其他12种阴性对照菌株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、福氏志贺氏菌(Shigella fIexneri)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、支气管败血博代氏菌(Bordetellabronchis印tica)亦由本实验室保存(详见表1)。各菌株接种于5mL BHI (DIFCO)培养基(Oxoid, Hampshire, England), 37°C振荡培养过夜。
[0065]1.2基于血清学方法的血清分型
[0066]经基于菌体/鞭毛抗原(0/H)与抗血清的凝集反应，对所有单增李斯特菌菌株进行传统血清型分型。134株单增李斯特菌中含有l/2a型菌株50株，l/2b型菌株29株，l/2c型菌株17株，4b型菌株26株，4a型菌株10株，4c型菌株2株(详见表1)。
[0067]1.3PCR体系建立
[0068]1.3.1引物筛选
[0069]采用比较基因组学方法，并参照相关文献，对血清型特异的基因区域内保守区和可变区进行比对分析，设计8条引物Ll-F、Ll-R、L2-F、L2-R、L3_F、L3-R、L4_F、L4-R。弓丨物序列详见表2。
[0070]1.3.2PCR反应体系及条件
[0071]通过PCR体系及条件的优化，确定多重PCR反应体系(ddH20为稀释液)为:IOXTaq Buffer (含 Mg2 + ) 3 μ L，10mmol/L dNTP Mix0.6 μ L，50 μ M 引物各 0.5 μ L，Taq DNApolymerase0.4 μ L，阳性对照溶液5 μ L或待检样品5 μ L，裂解液10 μ L，加ddH20补足体积至 30 μ L ;反应条件为:95°C 3min ；95°C 45s, 55°C 30s, 72°C 55s, 25 个循环；72°C 5min。产物在I %琼脂糖凝胶0.5 X TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。
[0072]1.3.3PCR产物测序鉴定
[0073]将PCR产物割胶回`收，克隆到pMD18-T载体，转化入DH5 α，提取质粒后鉴定，阳性克隆子送至上海英骏生物技术有限公司测序。序列经NCBI BLAST对比，以确证片段为目的条带。
[0074]1.3.4特异性试验
[0075]以无害李斯特菌(Listeriainnocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)、塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、腊样芽抱杆菌(Bacilluscereus)、幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)> 猪链球菌(Streptococcus suis)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus, equisubsp.zooepidemicus)、嗜酸性乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(VibrioparahaemoIytiCUs)> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、福氏志贺氏菌(Shigella fIexneri)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、支气管败血博代氏菌(Bordetella bronchiseptica) 25种细菌作为阴性对照，双蒸水为空白对照，用建立的PCR方法进行扩增。ATCC为美国典型微生物保藏中心；CMCC为中国医学微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市天坛西里2号。
[0076]表1李斯特菌参考菌株及阴性对照菌株
【权利要求】
1.一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10 X buffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F分别装有单增李斯特菌l/2a型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌l/2b型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌l/2c型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌4b型阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液，所述稀释液为双蒸水；所述冻存管A中引物的序列为:
Ll-F:AGCAAAATGCCAAAACTCGT
Ll-R:CATCACTAAAGCCTCCCATTG
L2-F:AGTGGACAATTGATTGGTGAA
L2-R: CATCCATCCCTTACTTTGGAC
L3-F:AGGGCTTCAAGGACTTACCC
L3-R:ACGATTTCTGCTTGCCATTC
L4-F:AGGGGTCTTAAATCCTGGAA
和 L4-R:CGGCTTGTTCGGCATACTTA。
2.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述PCR反应管为100~300个。
3.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述冻存管A内的冻干粉是将冻存管A内所述混合液先在_80°C预冻10h，再在_40°C持续冻干30h，然后以1.5°C /min的速率升温至25°C干燥2h使水分含量达到5%以下，获得冻干粉；所述每8 μ L 混合液组成为:Taq DNA 聚合酶 0.4 μ L，10 Xbuffer3 μ L, dNTP mixture0.6 μ L,浓度均为 50 μ M 的 Ll-F、Ll-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F 和 L4-R 引物各 0.5 μ L，所述 dNTPmixture由终浓度均为IOmM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP构成。
4.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于冻存管B中所述裂解液终浓度组成为:体积浓度4%Triton-X100, 5mg/mLNaN3, lmol/L Tris, pH为8.0，溶剂为蒸馏水。
5.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于每个试剂盒有100个PCR反应管，所述冻存管A内冻干粉的量以冻干前混合液的体积计为800 μ L，所述冻存管B内装有裂解液lmL，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F各自装有阳性对照缓冲液0.5mL,冻存管G装有1.5mL稀释液。
6.一种利用权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒进行单增李斯特菌主要血清型分型的方法，其特征在于所述分型方法按如下步骤进行:(I)将冻存管G中稀释液加至冻存管A，重悬、混匀制成混悬液，存放于-20°C备用；所述冻干粉用量以冻干前混合液体积计，所述的冻存管G中稀释液与混合液体积比为15:8 ; (2)将冻存管B中的裂解液分别加入PCR反应管，分为对照PCR反应管和待检PCR反应管，再依次将冻存管C、冻存管D、冻存管E和冻存管F中的阳性对照缓冲液加入相应对照PCR反应管内，将待检样品加入待检PCR反应管，分别混合均匀，然后再向各个PCR反应管内加入步骤(1)冻存管A内的混悬液，立即进行PCR扩增；所述待检样品为待检的单增李斯特菌接种在BHI培养基中，37°C培养过夜后，取菌液10(TC煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用双蒸水重悬，制成待检样品；所述冻存管B中裂解液与冻存管A中混悬液的体积比为2:3，所述冻存管B中裂解液与冻存管C、冻存管D、冻存管E和冻存管F中的阳性对照缓冲液的体积比均为2:1，所述冻存管B中裂解液与待检样品体积比为2:1; (3)将步骤(2)各个PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增:95°C预热3min；95°C变性 45s，55°C退火 30s，72。。延伸 55s，25 个循环;72°C保持 5min ； (4)将步骤(3)扩增后的产物分别在质量浓度1%琼脂糖凝胶与0.5XTBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统读取数据并记录； (5)结果判定:检测后，待检样品与冻存管C内的阳性对照溶液同时扩增出691bp条带的为单增李斯特菌l/2a型阳性；待检样品与冻存管D内阳性对照溶液同时扩增出471bp条带的为单增李斯特菌l/2b型阳性；待检样品与冻存管E内阳性对照溶液同时扩增出691bp、906bp两条条带的为单增李斯特菌l/2c型阳性；待检样品与冻存管F内阳性对照溶液同时扩增出471bp、597bp两条条带的为单增李斯特菌4b型阳性；阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为非单增李斯特菌主要血清型；待检样品与阳性对照溶液均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。
【文档编号】C12Q1/68GK103602739SQ201310571311
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】陈健舜 申请人:浙江省水产技术推广总站