一种检测水稻香味控制基因特定突变的分子标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测水稻香味控制基因特定突变的分子标记，可检测水稻植株中是否发生了该突变。适用于香味水稻品种的选育及香型水稻资源的筛选。
【专利说明】一种检测水稻香味控制基因特定突变的分子标记及应用
【技术领域】
[0001]属分子遗传学领域，具体地，涉及一种检测水稻香味控制基因特定突变的分子标记及应用。
【背景技术】
[0002]香味是水稻重要的食味品质性状，国际上早已将稻米香味作为一项检测稻米品质的重要指标。香米以其口味清香、营养价值丰富的特色备受广大消费者的喜爱，有较好的经济利益和市场前景。因此，育种工作者进行香稻新品种的选育是一个良好的育种方向。
[0003]到目前为止，水稻香味的遗传研究已取得很大进展。从遗传分析定位到基因克隆，再到分子标记辅助选择技术的应用，为香味水稻新品种的选育提供了很大的便利条件。
[0004]水稻香味性状受细胞核隐形基因控制。1992年Ahn等将该基因定位在水稻第8染色体，与RFLP标记RG28的遗传距离为4.5cm。之后，1996年，Lorieux等进一步将该基因定位在第8染色体RGl和RG28之间。1996年到2001年之间Jin、Dong等学者通过实验研究，相继证明香味基因受一对隐形基因控制，且该基因位于水稻第8染色体上。2005年，Wang等进一步将该基因定位在179kb的范围内，该范围存在22个开放阅读框，通过序列分析发现编码甜菜碱醛脱氢酶基因与水稻香味形状有关。
[0005]目前研究认为，水稻香味的产生是由编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2第7外显子、第2外显子及第4-5外显子等区域相关碱基突变引起的。
[0006]第7外显子突变是澳大利亚学者Bradbury等于2005年发现的,通过序列分析frg内的17个候选基因发现编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2是造成水稻香与非香差异的根源，香稻在该基因的第7外显子存在8碱基的缺失及3个碱基突变，而非香稻在该区域不存在缺失与突变。
[0007]第2外显子缺失是由Chen等于2008年发现的，Badh2的另一个等位基因，即第2外显子存在7个碱基的缺失，通过基因功能互补验证该缺失造成水稻香味的产生。
[0008]第4-5外显子缺失是中国水稻研究所胡培松等发现的，Badh2的另外一个等位基因，即第4外显子和第5外显子之间发生了 803碱基的缺失，该缺失碱基位于基因转录起始密码子下游1628bp与2430bp之间，803bp缺失碱基对应于第4外显子90bp,第4内含子694bp和第5外显子19bp。
[0009]针对以上产生水稻香味的分子机理，开发出功能分子标记并进行标记辅助选择育种有利于提高香稻品种的选育效率，减少选育过程的盲目性。
[0010]但目前检测水稻香味的分子标记大多是根据该基因第7外显子Sbp缺失及第2外显子7bp缺失的序列差异设计的STS类型分子标记，由于使用这些分子标记扩增的PCR产物在香与非香品种间序列差异小，基因型差异的检测必须借助分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳。但该电泳检测技术存在制胶步骤多、电泳时间长、印染过程繁琐等缺陷，不利于这些分子标记在标记辅助选择香味育种 的广泛应用。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种检测水稻香味控制基因特定突变的分子标记及应用，开发I个与控制水稻香味的基因(编码甜菜碱醛脱氢酶基因:Badh2)共分离的分子标记，从而检测水稻植株是否含有Badh2基因编码区第7外显子8碱基的缺失及3个碱基突变，可用于香味水稻品种的选育及香型水稻资源的筛选。
[0012]本发明根据Badh2基因编码区第7外显子8碱基的缺失及3个碱基突变导致水稻香味的原理设计开发功能分子标记，利用琼脂糖凝胶电泳可以快速、准确的判定某水稻材料是否发生该特定突变。
[0013]本发明利用了一种SNP检测方法，即四引物扩增受阻突变体系PCR技术，该技术的基本原理是=TaqDNA聚合酶缺少3’ _5’外切酶活性，因此对于3’末端错配的引物以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3’末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异长度的扩增条带，从而表明模版DNA没有与引物3’末端相应的突变；如果PCR结果能得带特异长度的扩增条带，表明模版DNA上具有与引物3’末端相应的突变。
[0014]本发明根据上述原理利用软件Primer Premier5.0设计引物序列。设计过程如下:以Badh2基因作为模版，针对其第7外显子8碱基缺失及3碱基突变序列，设计突变型上游引物和野生型下游引物，利用软件Primer Premier5.0设计外部上下游引物,选取发卡结构及错配无或较少，且片段大小、退火温度适中的序列。然后将选取的序列在NCBI网上进行Blast比对，选择特异性较强的序列。根据这一过程，设计合成多组引物，经过实验筛选，找出在该类型香稻与其他水稻间存在多态性、且多态性明显的标记。
[0015]主要采用如下技术方案:
[0016]一种检测水稻香味控制基因特定突变的分子标记，所述基因为编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2，所述特定突变为Badh2基因编码区第7外显子有8个碱基缺失及3碱基突变，所述Badh2编码区第7外显子有8个碱基缺失及3碱基突变，所述分子标记为:YY5:核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；ΥΥ6:核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；ΥΥ7:核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；ΥΥ8:核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0017]进一步地，所述编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2编码区第7外显子有8个碱基缺失及3碱基突变。
[0018]同时，本发明还提供采用本分子标记检测该突变的方法，包括如下步骤:
[0019]1)提取待测水稻叶片DNA ；
[0020]2)将所述分子标记中的4个引物:YY5/YY6/YY7/YY8放入一个PCR反应体系中，对所提取的待测水稻叶片DNA进行扩增；
[0021]其中，PCR反应体系包括:总反应体系20 μ 1:2 μl水稻叶片DNA ；0.4 μllOmMdNTP ;1.6 μ 110XPCR buffer ;1.6 μ l Mg2+ ;1.6 μ 1YY5/YY6/YY7/YY8 等体积混合物；
0.2μ l Taq 酶；12.8μl ddH20。
[0022]PCR 反应程序:95°C预变性 5min ;94°C变性 30s ;55°C退火 30s ;72°C延伸 30s ；33个循环；72°C延伸1Omin ；
[0023]扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳25_35min，判定是否为所述特定突变类型香稻，检测结果为:同时出现591bp和169bp两条特征条带，判定为香稻，且为存在所述特定突变的纯合植株；同时出现591bp，449bp和169bp三条特征条带，判定为存在所述特定突变的杂合植株；同时出现591bp和449bp两条特征条带，判定为不存在所述特定突变的植株。
[0024]且，本发明还提供所述分子标记在香味水稻品种选育及香型水稻资源筛选过程中的应用。
[0025]本发明的琼脂糖凝胶电泳技术检测标准如下:
[0026]I)水稻DNA样品经本分子标记进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果中同时出现591bp和169bp两条特征条带，判定为香稻，且为存在该特定突变的纯合植株；
[0027]2)水稻DNA样品经本分子标记进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果中同时出现591bp，449bp和169bp三条特征条带，判定为存在该特定突变的杂合植株；
[0028]3)水稻DNA样品经本分子标记进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果中同时出现591bp和449bp两条特征条带，判定为不存在该突变的植株，但有可能为存在其他突变的香稻植株；
[0029]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0030]a)针对基因特定突变进行检测，目标单一，目的明显，可实现有效快速检测。本发明所提供分子标记，系针对Badh2基因编码区第7外显子8碱基的缺失及3个碱基突变这一特定突变所设计。若水稻材料中存在该特定突变，则可判定其为香稻品种。
[0031]b)提供I个分子标记，可快速、准确检测出待测水稻中是否存在所述特定突变。首先，该分子标记是针对变异序列设计的引物，与基因共分离，所以检测结果准确；其次，该标记检测结果中特征条带大小差异较大(即591bp,449bp和169bp三条特征条带),不需要较高分辨率的凝胶及电泳较 长时间即能分开。
[0032]c)由第7外显子处发生序列变异引起的香稻材料，通过进一步利用该分子标记进行分子标记辅助选择，在优质香稻新品种(系)的选育过程中发挥了重要作用。
[0033]d)采用琼脂糖凝胶电泳检测技术，操作方便，检测时间缩短，仅30分钟左右的时间，即可得出检测结果，检测效率高，适于分子标记辅助选择育种应用。而采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，从制胶到得出检测结果约需2小时30分钟。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为采用本发明的分子标记对待测水稻进行PCR扩增后，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。1-香稻:太湖香粳；2_香稻:早香09-2 ；3-香稻:紫香糯861 ；4~非香稻:秀水123 ;5、6_两个杂合植株。
【具体实施方式】
[0035]下面结合实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
[0036]实施例1
[0037]1.1提取待测水稻叶片DNA
[0038]选取待测水稻:1_香稻:太湖香粳；2-香稻:早香09-2 ;3-香稻:紫香糯861 ;4-非香稻:秀水123 ;5、6_两个杂合植株(即香稻和非香稻的杂合植株)
[0039]其中，所述杂合植株，即香稻和非香稻的杂合植株，分别为秀水123与太湖香粳杂交后代，紫香糯861与秀水123杂交后代。
[0040]分别取水稻叶片2-3cm放入2.0ml离心管中，放入液氮中，磨碎；加入700mlCTAB提取液，于65°C下水浴30min，期间反复摇匀；加入700ml三氯甲烷，上下颠倒混匀至分三层；12000rpm/min离心15min ;吸取上清液600ml于1.5ml离心管中，加入_20°C预冷的0.6倍体积异丙醇，上下轻轻摇匀，置于_20°C下冷冻30min ; 12000rpm/min离心5min，沉淀附于离心管底部，弃上清；70%无水乙醇洗涤后，充分干燥，溶于150 μ I ddH20中。
[0041]1.2PCR 扩增
[0042]将所述分子标记中的4个引物:YY5/YY6/YY7/YY8放入一个PCR反应体系中，对所提取的待测水稻叶片DNA进行扩增；PCR反应体系如下表所示:
PCR反应体系:(20μ1)
【权利要求】
1.一种检测水稻香味控制基因特定突变的分子标记，所述基因为编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2，所述特定突变为Badh2基因编码区第7外显子有8个碱基缺失及3碱基突变，其特征在于，所述分子标记序列为: YY5:核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； YY6:核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； YY7:核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； YY8:核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种如权利要求1所述的分子标记用于检测该突变的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)提取待测水稻叶片DNA； 2)将所述分子标记中的4个引物:YY5/YY6/YY7/YY8放入一个PCR反应体系中，对所提取的待测水稻叶片DNA进行扩增； 3)扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳25-35min，判定是否为所述特定突变类型香稻，检测结果为:同时出现591bp和169bp两条特征条带，判定为香稻，且为存在所述特定突变的纯合植株；同时出现591bp，449bp和169bp三条特征条带，判定为存在所述特定突变的杂合植株；同时出现591bp和449bp两条特征条带，判定为不存在所述特定突变的植株。
3.权利要求1所述的分子标记在香味水稻品种选育及香型水稻资源筛选过程中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103725778SQ201310697469
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】吴书俊, 闫影, 曹黎明, 赵志鹏, 万常照 申请人:上海市农业科学院