一种D-氨基酸脱氢酶基因bll6812S及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因bll6812S及其制备方法和应用，其核苷酸序列如SEQ?ID?No1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ?ID?No2所示。该D-氨基酸脱氢酶基因bll6812S是将来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因bll6812按照植物偏爱密码子进行改造，利用基因合成方法制备而成。将所述bll6812S基因转化拟南芥获得转基因拟南芥，该转基因拟南芥在抗草甘膦的性能明显优于野生型拟南芥，可应用于抗草甘膦作物育种中。
【专利说明】—种D-氨基酸脱氢酶基因bl I6812S及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S及其制备方法和应用。
【背景技术】[0002]草甘膦(Glyphosate)又称:镇草宁、农达(Roundup)等，因理化性质稳定并具有高效、广谱、低毒、低残留、易分解、不破坏土壤环境和对大多数植物具有强灭生性等优点，自1971年孟山都公司开发成功以来，现已成为全球销售量最大的除草剂。因此，草甘膦也成为抗除草剂转基因作物研究的首选对象，抗草甘膦转基因作物是目前全球播种面积最大的转基因作物。
[0003]草甘膦的毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-勝酸合成酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase,简称 EPSPS),导致分枝酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，从而扰乱了植物体正常的氮代谢而使杂草死亡。目前，抗草甘膦植物基因工程主要采用三种方法。第一，植物细胞通过EPSPS的超常表达对一定剂量的草甘膦产生抗性。第二，植物细胞通过EPSPS基因的作用活性位点变化对草甘膦产生抗性，即通常所说的EPSPS抗草甘膦基因。利用这种作用机理使植物具有草甘膦抗性的常用基因主要是CP4-EPSPS和aroA两种。第三，导入编码草甘膦降解相关基因，如草甘膦氧化还原酶基因(Glyphosate oxidoreductase, G0X),和草甘勝N-乙酸转移酶(glyphosateNacetyhransferase)基因，即GAT基因。
[0004]目前商品化的抗草甘膦转基因作物几乎全部为美国孟山都公司产品(商品名RoundupReady)，且主要采用过表达对草甘膦低敏感的CP4_EPSPs提高作物对草甘膦的抗性，然而这种抗性机制不能消除植物体内吸收的草甘膦，且植物对草甘膦代谢极为缓慢，造成草甘膦在植物体内不断积累，这可能会导致两方面的危害:一是对植物繁育器官的造成损害，这种损害表现为授粉不良及果实败育以致产量减少。有研究表明第一代抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆相比产量降低了 6.7%【Duke,和Powle, Pest Manag.Sc1.，2008，64:319-325】；二是对食用者的身体健康可能会造成一定的潜在危害。最近的研究表明，长期喂食添加有草甘膦的饲料能够导致老鼠胎儿和怀孕的母鼠许多机能出现异常【Daruich等，Environ.Res.，2001,85:226-231】。另外，草甘膦会干扰老鼠细胞产生睾酮的酶【WaiIh等，Environ.Health.Persp., 2000, 108:769-776.】和人类胎盘细胞中人雌激素合成酶【Richard等Environ.Health.Persp., 2005,, 13:716.】。这也是人们质疑抗草甘膦转基因食品安全性的主要原因之一，因而开发无/低草甘膦残留的抗性机制是十分必要的。
[0005]现有的文献及科学研究中关于D-氨基酸在抗草甘膦的应用报道很少。氨基酸序列同源性分析表明，D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,简称DAA0, ECl.4.3.3)与甘氨酸氧化酶(glycine oxidase,简称GO, ECl.4.3.19)和单体肌氨酸氧化酶(monomeric sarcosine oxidase, ECl.5.3.1)同属于谷胱甘妝还原酶家族II成员【Dym和Eisenberg, Protein Sc1.，2001，10:1712-1728】。DAAO 和 GO 都能催化氨基酸氧化脱氨，产生相应的α-酮酸，氨/胺和H202，但两者底物谱不同。DAAO可催化草甘膦生成氨甲基磷酸(AMPA)和乙醛酸，从而降低草甘膦的毒性。近年来，DAAO被人们应用于创造草甘膦抗性植物研究，但目前没有关于将D-氨基酸脱氢酶基因应用于培育抗草甘膦植物的相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium diazoefficiens)的D-氛基酸脱氧酶基因bll6812S及其制备方法和应用。本发明将来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因(W16812)改造成可在植物中高效表达的D-氨基酸脱氢酶基因(W16812S)，并将该D-氨基酸脱氢酶基因bll6812S转化拟南芥，进而提高转基因拟南芥抗草甘膦的能力，该D-氨基酸脱氢酶基因W16812S对于培育抗草甘膦的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。
[0007]因此，本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S。
[0008]本发明所要解决的技术问题之二，在于提供所述来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S的制备方法。
[0009]本发明所要解决的技术问题之三，在于提供所述来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S在植物转化中的应用。
[0010]本发明所要解决的技术问题之四，在于提供所述来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W1 6812S，在提高植物抗草甘膦性能中的应用及在培育抗草甘膦转基因植物中的应用。
[0011]为了达到上述目的，本发明的技术方案如下:
[0012]一种来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。所述D-氨基酸脱氢酶基因W16812S编码阅读框有1266bp组成编码一个421个氨基酸的蛋白质。
[0013]本发明所述的来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S，采用人工方法合成，即将高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因(bll6812)按照植物偏爱密码进行改造,利用基因合成法【Xiong et al.,Nucl Acids Res,2004，32: e98】进行化学合成，在保持D-氨基酸脱氢酶基因W16812的氨基酸序列不变的基础上，设计引物W16812S-1~W16812S-32，并进行PCR扩增合成本发明的D-氨基酸脱氢酶基因(W16812S)。具体设计的引物如下:
[0014]bll6812S-l:
[0015]GAA, GGA, TCC ATGCCAGAGG GTCGTCACGT CGCTATCATC GGTGCTGGTGCTGTCGGTGTCATCTCCGCT
[0016]bll6812S-2:
[0017]CGATCAGAGT GACACGATGA CCCTCACGCA GAGCCTCGAT AGCGGAGATG ACACCGACAG
[0018]bll6812S-3:
[0019]TCATCGTGTC ACTCTGATCG ACCCAGGTGA GCCAGGTGGT GAGCAGGCTG CTTCCTACGG
[0020]bll6812S-4:
【权利要求】
1.一种来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所不,其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所不。
2.如权利要求1所述的来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因bll6812S的制备方法，其特征在于，将高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因bll6812按照植物偏爱密码进行改造，利用基因合成法进行化学合成，在保持D-氨基酸脱氢酶基因W16812的氨基酸序列不变的基础上，设计引物W16812S-1~W16812S-32，进行PCR扩增合成所述的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S ;设计的具体引物如下:
3.如权利要求1或2所述的来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因W16812S在植物转化中的应用。
4.如权利要求1或2所述的来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因bll6812S在提高植物抗草甘膦性能中的应用。
5.如权利要求1或2所述的来源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脱氢酶基因bll6812S在培育抗草甘膦植物中的应用。
【文档编号】C12R1/41GK103740737SQ201310738841
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】韩红娟, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 付晓燕, 薛永, 王波, 田永生, 许晶, 高建杰, 王丽娟, 韩静, 李振军 申请人:上海市农业科学院