一种双歧乳杆菌的高密度培养方法及其冻干菌粉制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种双歧乳杆菌V9的高密度发酵方法及其冻干菌粉的制备方法，属于益生菌发酵领域。双歧乳杆菌V9（Bifidobacterium?animalis?subsp.lactis?V9，Bifidobacterium?lactis?V9）是从健康蒙古族儿童肠道中分离得到的耐酸和耐胆盐的益生菌，保藏编号为CGMCC?No.5470。双歧乳杆菌V9在优化培养基和发酵条件控制下实现菌体高密度发酵，发酵液活菌数可达2.0×1010cfu/ml以上，该发酵液制备的双歧乳杆菌V9冻干菌粉中活菌总数可以达到6.0×1011cfu/g以上，可应用于益生菌发酵剂或益生菌制剂。
【专利说明】一种双歧乳杆菌的高密度培养方法及其冻干菌粉制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种乳酸菌的高密度发酵方法及其冻干菌粉制备方法，尤其涉及一种双歧乳杆菌V9的高密度发酵及其冻干菌粉的制备方法。属于益生菌发酵领域。
技术背景
[0002]双岐乳杆菌与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用。它对肠道微生物有重要影响，无论在食品发酵，还是在工业乳酸发酵以及医疗保健等领域，都有着广泛的应用。
[0003]本发明使用的双歧乳杆菌V9是一株自健康蒙古族儿童肠道中分离筛选出的益生菌。研究表明，双歧乳杆菌V9对常见肠道致病菌(大肠杆菌、鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、单胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌)具有显著的抑制效果，并可降低动物因腹泻导致的死亡率。双歧乳杆菌V9对腹泻和便秘患者具有显著的治疗作用。2009年完成了双歧乳杆菌V9的全基因组测序及分析，基因组学研究结果表明其遗传稳定，传代保藏过程中突变重组较少，突变几率极小。目前该菌株已成功应用于发酵益生菌酸牛乳、发酵乳饮料、益生菌片剂、益生菌固体饮料等食品或保健食品中，具有良好的应用前景。经过多年系统的基础研究，自主解决了其产业化的关键技术问题，包括直投式发酵剂、发酵豆乳益生菌饮料、发酵乳制品、益生菌奶粉、益生菌 固体饮料、益生菌片剂和益生菌胶囊等产品，并实现了产业化。
[0004]高密度培养技术(High Cell Density Culture)，也就是高密度发酵技术。由于各个菌种所能达到的最高菌体浓度相差较大，目前的文献中并没有对高密度培养有确切的定义。一般来说，高密度培养是指应用一定的培养技术或装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较传统培养方式有显著的提高，从而达到减少培养体积，还可以缩短生产周期，最终提高特定产物的生产速率，减少设备投资从而降低生产成本，提高在市场上的竞争力。
[0005]随着发酵剂的商业化生产和应用的迅速增加，工业发酵的基本目标自然转向了以最小的代价获得最大的产值和利润，而实现这一目标的工程手段是针对每个特定过程建立相应的高效发酵模式。因此，进行工业化生产，大规模培养非遗传修饰菌和工程菌的技术和工艺就显得日趋重要。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养。
[0006]专利《一种能在豆乳发酵过程中转化异黄酮的双歧杆菌》，CN102851223A,公开了一株双歧杆菌可在豆乳发酵过程中使无活性的异黄酮转化为功能性活性异黄酮，所述双歧杆菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCCN0.5470，保藏日期为2011年11月18日。
[0007]专利《用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌和植物乳杆菌》，CN103421710A,公开了采用干酪乳杆菌CGMCC N0.6735、植物乳杆菌CGMCC N0.6744和动物双歧杆菌CGMCC N0.5470进行混菌固态发酵，制备出含有益生菌的豆柏发酵制品。
[0008]专利《用于饲料添加剂益生菌固体发酵的动物双歧杆菌和枯草芽孢杆菌》，CN103421712A,公开了采用枯草芽孢杆菌CGMCC N0.6733和动物双歧杆菌CGMCC N0.5470进行混菌固态发酵豆柏，制备出含有益生菌的豆柏发酵制品。
[0009]本发明针对一株经过体外耐酸性试验、耐胆盐试验等一系列试验筛选得到的益生菌株一双歧乳杆菌V9，通过优化液体培养基以及对培养条件的控制等方法实现高密度发酵，发酵液经离心收集菌体、添加保护剂后冷冻干燥得到冻干菌粉，可以应用于益生菌发酵剂和益生菌制剂。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种双歧乳杆菌V9 (Bifidobacterium animal is subsp.1actis V9, Bifidobacterium lactis V9)的高密度培养方法。所述双歧乳杆菌V9(Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9, Bifidobacterium lactis V9)是从健康蒙古族儿童肠道内分离得到的耐酸和耐胆盐的益生菌；该菌菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC N0.5470，分类名称为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animal is subsp.lactis),地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0011]本发明的又一目的在于提供该菌株冻干菌粉的制备方法，冻干菌粉可以应用于益生菌发酵剂和益生菌制剂。
[0012]本发明的目的是通过如下技术方案实现的: [0013]一种双歧乳杆菌V9的高密度培养方法，包括以下步骤:
[0014]a.菌种的活化:
[0015]将_40°C冷冻保存的双歧乳杆菌V9接种于121°C 15min灭菌后的TPY液体培养基中，37°C厌氧培养18~24小时，如此传代培养I~2次得到活化菌种；
[0016]b.优化培养基的配制:
[0017]将优化培养基各成份按比例配制，混合均匀后调pH值为6.5，121 °C下灭菌15min ；
[0018]优化培养基组成如下:
[0019]乳糖8.0~12.0kg,牛肉膏2.0~7.0kg,酵母粉2.0~7.0kg,酪蛋白胨8.0~12.0kg,大豆蛋白胨 2.0 ~7.0kg, KH2PO4L O ~4.0kg, K2HPO4L O ~4.0kg, MgSO40.05 ~
0.15kg,吐温-800.15~0.35kg, L-半胱氨酸盐酸盐0.2~0.7kg,碳酸钙0.8~1.2kg,蒸馏水1000L。
[0020]c.种子液的制备:
[0021]取步骤a中活化好的菌种接种于b中配制的培养基中，37°C厌氧培养至pH值为
4.5~4.8时停止；
[0022]d.接种与培养:
[0023]将步骤c的种子液，接种于b中配制的培养基中，在控制的发酵条件下发酵12~18h ；
[0024]发酵条件控制为:发酵前期，30_35°C恒温培养，自然发酵至pH为5.0-5.8 ;再调整发酵温度为33-37°C恒温培养，并控制pH保持5.4~6.0，保持厌氧发酵。
[0025]上述过程中可以通过流加中和剂的方法控制pH，其中中和剂可以是NaOH、Κ0Η、Na2CO3或氨水溶液等无机碱水溶液。[0026]其中厌氧条件可以通过通氮气0.02~0.05vvm,或每两个小时通氮气一次的方法实现。
[0027]e.终止发酵
[0028]当菌体产酸停止时终止发酵，得到双歧乳杆菌V9的高密度发酵液，发酵液活菌数达到 2.0X1010cfu/ml 以上。
[0029]其中可根据pH不再降低，中和剂流加停止来判断产酸是否停止。
[0030]一种如上所述的双歧乳杆菌V9冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤:
[0031]a.菌体浓缩:高密度发酵液经8000~12000g离心浓缩菌体；
[0032]b.添加保护剂:菌体浓缩液添加3~8倍的保护剂溶液；
[0033]保护剂溶液的组成如下:
[0034]脱脂乳10-15kg,乳糖8-12kg,维生素Cl_2kg,谷氨酸钠l_2kg,蒸懼水1000L。
[0035]c.干燥:将上述添加保护剂后的菌悬液经冷冻干燥得到冻干菌粉，菌粉中活菌总数达到6.0X10ncfu/g以上。
[0036]本发明所述方法制备的双歧乳杆菌V9冻干菌粉可以应用于益生菌发酵剂或益生菌制剂，如:直投式 发酵剂、发酵豆乳益生菌饮料、发酵乳制品、益生菌奶粉、益生菌固体饮料、益生菌片剂和益生菌胶囊等产品。
[0037]有益效果:
[0038]本发明的双歧乳杆菌V9 (Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9,Bifidobacterium lactis V9)对酸和胆盐耐受能力强,并且显著抑制致病菌和降低动物因腹泻导致的死亡率等多种益生功能，经高密度发酵后，添加保护剂冷冻干燥，可得到高活力的冻干菌粉，满足了对于益生菌发挥益生功效所需的高活力的要求，可直接应用于益生菌制剂或益生菌发酵剂。
[0039]本发明高密度发酵方法得到双歧乳杆菌V9的发酵液，发酵液活菌数可达2.0X1010cfu/ml以上，比目前报道的高密度发酵的活菌数高5_15倍(胡曼:两歧双歧杆菌培养及冻干保护剂的研究，陕西科技大学硕士学位论文，2012)。
[0040]本发明方法得到的双歧乳杆菌V9冻干菌粉，菌粉活菌总数可以达到
6.0X 10ncfu/g以上，比目前报道的双歧杆菌冻干菌粉的活菌数高2-10倍(发明专利:一种双歧杆菌冻干粉的制备方法及其产品和用途，专利申请号:200310103234.0)，可以应用于益生菌发酵剂或益生菌制剂。
【具体实施方式】
[0041]下面结合实施例对本发明作进一步说明；以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0042]实施例1:
[0043]双歧乳杆菌V9(Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9, Bifidobacteriumlactis V9)的高密度发酵:
[0044]a.菌种的活化:将-40°C冷冻保存的双歧乳杆菌V9(Bif idobacterium animal issubsp.lactis V9, Bifidobacterium lactis V9)接种于 5ml TPY 液体培养基中(TPY 培养基:乳糖10g，牛肉膏5g，酵母粉5g，酪蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g，ΚΗ2Ρ042.5g，Κ2ΗΡ042.5g，MgSO40.1g,吐温-800.25g，蒸馏水 1000mL, ρΗ7.0,121。。15min 灭菌)，37°C厌氧培养 20 小时，如此传代培养2次得到活化的菌种。
[0045]b.配制优化培养基，将乳糖8.0kg，牛肉膏2.0kg，酵母粉7.0kg，酪蛋白胨8.0kg,大豆蛋白胨 rL 0kg，KH2PO4L 0kg,K2HP044.0kg7MgSO40.05kg,吐温-800.15kg，L-半胱氨酸盐酸盐0.2kg，碳酸钙0.8kg，蒸馏水1000L，充分溶解。
[0046]c.制备种子培养液:将上述活化好的菌种5%接种于优化培养基中，37°C厌氧培养至PH值为4.5时停止。
[0047]d.接种发酵:将种子培养液7%接种于优化培养基中，先30°C恒温培养，自然发酵至pH为5.0-5.8 ;再调整发酵温度为35°C恒温培养，自动控制流加氨水保持pH5.4~6.0，通过通氮气0.02~0.05vvm保持厌氧发酵。发酵至产酸停止，氨水不再流加时终止发酵，得到双歧乳杆菌V9高密度培养液，经检测发酵液中活菌数达到3.0X 101(lCfu/ml。
[0048]实施例2:
[0049]双歧乳杆菌V9(Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9, Bif idobacteriumlactis V9)的高密度发酵:
[0050]a.菌种的活化:将-40°C冷冻保存的双歧乳杆菌V9(Bif idobacterium animal issubsp.lactis V9, Bifidobacterium lactis V9)接种于 5ml TPY 液体培养基中(TPY 培养基:乳糖10g，牛肉膏5g，酵母粉5g，酪蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g，ΚΗ2Ρ042.5g，Κ2ΗΡ042.5g，MgSO40.1g,吐温-800.25g，蒸馏水 1000mL, ρΗ7.0,121。。15min 灭菌)，37°C厌氧培养 20 小时，如此传代培养2次得到活化的菌种。 [0051]b.配制优化培养基，将乳糖12.0kg，牛肉膏5.0kg，酵母粉5.0kg，酪蛋白胨12.0kg,大豆蛋白胨 5.0kg, ΚΗ2Ρ044.0kg，Κ2ΗΡ042.0kg，MgSO40.15kg，吐温-800.35kg，L-半胱氨酸盐酸盐0.5kg，碳酸钙1.2kg，蒸馏水1000L，充分溶解。
[0052]c.制备种子培养液:将上述活化好的菌种8%接种于优化培养基中，37°C厌氧培养至PH值为4.8时停止。
[0053]d.接种发酵:将种子培养液10%接种于优化培养基中，先32°C恒温培养，自然发酵至pH为5.0-5.8 ;再调整发酵温度为37°C恒温培养，通过每两个小时通氮气一次的方法保持厌氧发酵，自动控制流加lOmol/L NaOH溶液保持pH5.9发酵至产酸停止，得到双歧乳杆菌V9高密度培养液。经检测发酵液中活菌数达到2.8X 101(lCfu/ml。
[0054]实施例3:
[0055]双歧乳杆菌V9(Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9, Bif idobacteriumlactis V9)冻干菌粉的制备:
[0056]将双歧乳杆菌V9高密度发酵液经1000Og离心得到浓缩菌体，按浓缩菌体与保护剂溶液比例1:5加入保护剂溶液(脱脂乳IOkg,乳糖8kg,维生素Clkg,谷氨酸钠Ikg,蒸懼水1000L)，混合均匀后入冷冻干燥机中冷冻干燥30小时，得到双歧乳杆菌V9冻干菌粉。菌粉的活菌数可达6.0X10ncfU/g以上，可直接应用于益生菌发酵剂或益生菌制剂。
【权利要求】
1.一种双歧乳杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，发酵过程中发酵条件控制为:发酵前期，30-35°C恒温培养，自然发酵至pH为5.0-5.8 ;再调整发酵温度为33_37°C恒温培养，并控制PH保持5.4~6.0，保持厌氧发酵；当菌体产酸停止时终止发酵，发酵液活菌数达到2.0X 101Qcfu/ml以上；所述双歧乳杆菌保藏编号为CGMCC N0.5470。
2.如权利要求1所述的一种双歧乳杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述发酵过程中发酵培养基组成如下:乳糖8.0~12.0kg，牛肉膏2.0~7.0kg，酵母粉2.0~7.0kg,酪蛋白胨 8.0 ~12.0kg，大豆蛋白胨 2.0 ~7.0kg，KH2PO4L O ~4.0kg，K2HPO4L O ~4.0kg,MgSO40.05~0.15kg，吐温-800.15~0.35kg，L-半胱氨酸盐酸盐0.2~0.7kg，碳酸钙0.8~1.2kg,蒸懼水1000L,混合均匀后调pH值为6.5,121°C下灭菌15min。
3.如权利要求1或2所述的一种双歧乳杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述控制PH保持5.4~6.0是通过流加中和剂的方法控制，所述中和剂是NaOH溶液、KOH溶液、Na2CO3溶液或氨水溶液中的任意一种。
4.如权利要求1或2所述的一种双歧乳杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述厌氧发酵是通过通氮气0.02~0.05vvm或每两个小时通氮气一次的方法实现。
5.如权利要求1或2所述的一种双歧乳杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述双歧乳杆菌CGMCC N0.5470在发酵过程前还经过种子液的制备，是在权利要求2所述培养基中37 °C厌氧培养至pH值为4.5~4.8时停止。
6.利用权利要求1-5任一方法得到的发酵液制备双歧乳杆菌冻干菌粉的方法，包括如下步骤: a.菌体浓缩:高密度发酵液经8000~12000g离心浓缩菌体； b.添加保护剂:菌体浓缩液添加3~8倍的保护剂溶液； 所述保护剂溶液的组成如下:脱脂乳10_15kg，乳糖8-12kg，维生素Cl-2kg，谷氨酸钠l-2kg，蒸馏水 1000L ； c.干燥:将上述添加保护剂后的菌悬液经冷冻干燥得到冻干菌粉，菌粉中活菌总数达到 6.0X10ncfu/g 以上。
【文档编号】C12N1/20GK103898018SQ201410123146
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】高鹏飞, 赵旭, 张善亭 申请人:北京和美科盛生物技术有限公司