一种高通量筛选cyp450酶抑制药物的试剂盒及其研究方法
【专利摘要】本发明涉及一种高通量筛选CYP450酶抑制药物的试剂盒及其研究方法，属于药物安全评价领域。试剂盒盒体内包括：NADPH再生系统，0.1M磷酸盐缓冲液，六种混合探针底物；六种混合探针底物的代谢产物；20mg/ml小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体。通过将NADPH再生系统、六种酶底物和不同浓度的药物相混合，再与小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体共孵育于37℃水浴中，LC-MS/MS检测六种代谢产物的量来判断药物对CYP450酶活性的抑制作用，计算IC50值。本试剂盒具有简单、准确、稳定和方便的优点，具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种高通量筛选CYP450酶抑制药物的试剂盒及其研究方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高通量筛选CYP450酶抑制药物的试剂盒及其研究方法，属于药物安全评价领域。
【背景技术】
[0002]细胞色素P450 (CYP450)属于一种血红蛋白类酶，广泛存在于生物体，是微粒体混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶，分布在多种组织，器官，相对分子质量50kDa，在波长450nm处有最大吸收峰。它参与的生化反应有脂肪酸、固醇类生物合成和类固醇激素等内源性底物的氧化代谢、外源物和大部分药物的生物氧化等；它使进入机体的外源物经代谢后向两个方向发展:代谢活化和代谢解毒，代谢活化后的产物有较强的毒性，甚至产生致畸、致癌效应。
[0003]细胞色素P450作为和药物代谢相关的重要酶类，在药物代谢中起着相当重要的作用，对其代谢的研究将有助于新药的开发，并能帮助人们更加清楚的认识药物的代谢途径，减少新药在人体内的副作用，增加药物疗效。医药机构已经证明导致死亡的主要原因就是不良药物相互作用，当两种或更多药物联合使用时，改变其中一个药物的效应或毒性导致发生不良药物相互作 用。美国的一项研究表明，住院患者的严重不良反应发生率为6.7%，因药物相互作用的致死率已排名住院患者死亡原因的第4-5位，近20年内，美国FDA先后将已批准上市的13种新药从市场撤出，其最主要的原因就是出现了严重的药物代谢性相互作用。所以，如果一个药物对细胞色素P450产生抑制，在联合用药的过程中，就会导致细胞色素P450对另一药物的代谢受阻，从而产生毒性，危害身体，这就是严重的药物代谢的相互作用之一，因而在前期研发过程中，研究化合物对细胞色素P450是否有抑制相当重要，对于药物的临床应用有重要的意义。
[0004]由于组合化学的出现和和快速发展，使得合成大量有潜在临床治疗功能的化合物速度也大为提高了。然而评估这些化合物缺乏相应的快速检测试剂盒和技术支持，使科研人员需要自制或自配相关试剂和微粒体，酶抑制的研究方法也不统一和规范，有对单个酶的，也有对多个酶的，所有这些对于没有经过药物代谢研究培训的医务人员，开展相关药物相互作用评价工作会很难，即使做了也经常浪费大量人力、物力和时间之后，却会因试剂配制不正确、操作不规范，计算不专业等原因导致无法获得准确的药物相互作用的信息，从而低估药物在临床应用时的相互作用风险，潜在危害较大。而且国内外的酶活性检测试剂盒主要是对单个酶活性影响的检测，而且通常使用荧光定量、HPLC检测或ELISA检测试剂盒，检测灵敏度低，误差较大，操作复杂，而且远不能满足高通量快速筛选的要求，对于评价药物临床相互作用的风险数据不全面，不能模拟真正人体用药之后整体的情况，因此本领域特别需要有一套全面评价药物相互作用的试剂盒和技术方法，能够快速简单评价药物相互作用的风险，特别能够满足没有相关代谢专业基础的科研工作者的药物评价的需要，根据试剂盒说明书操作即可完成评价任务。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种高通量筛选CYP450酶抑制药物的试剂盒及其研究方法，试剂盒提供包装盒及完整的试剂搭配，能够利用试剂盒的使用说明书快速而准确的进行药物相互作用研究，利用高通量的LC-MS/MS检测技术检测各代谢产物的量，计算IC5tl值，评价药物对各CYP450酶抑制作用。本检测试剂盒及其研究方法主要是为药物早期筛选和临床用药相互作用研究提供技术支持，特别是为那些刚接触药物代谢研究的科研工作者，临床医务工作者提供了药物评价的物质和技术支持，将可大大缩短研究时间，提高工作效率，推动我国在临床用药领域的研发工作，对于提高人们的生活质量，推动医学模式、治疗方式及用药结构改革起到巨大的推动作用。
[0006]为了解决现有试剂盒和技术研究所存在的问题，本发明是采用以下技术方案:根据试剂盒说明书配制NADPH再生系统，通过将不同浓度药物、混合底物和肝微粒体共同孵育后，利用LC-MS/MS同时检测FDA推荐的六个代谢产物，IC50值的计算根据GraphPadPrism 5 Project软件进行。IC5(I>50 μ mol/L说明药物对CYP450酶无抑制作用，无药物相互作用的风险，IO〈 IC 5(|〈 5 O μ mo I / L说明药物是弱抑制剂，药物相互作用的风险较小，1<IC50<10 μ mol/L说明药物是中等抑制剂，IC50<1 μ mol/L说明药物是强抑制剂，中等和强抑制剂具有药物相互作用的风险，需要进一步研究和关注。.[0007]技术方案具体实施:
[0008](a)本发明试剂盒具有NADPH再生系统=NADPH再生系统包括A液:2.5mmol/LNADPNa2,10U/mL6_磷酸葡萄糖脱氢酶,20mmol/L氯化镁，B液:50mmol/L6_磷酸葡萄糖。0.lmol/L磷酸缓冲液包括29g磷酸氢二钠，2.96g磷酸二氢钠，42.5g氯化钠，11.8g氯化钾溶解于I升蒸馏水中。然后通过吸取50 μ LA液+10 μ LB液+180 μ L0.lmol/L磷酸缓冲液作为NADPH再生系统。
[0009](b)本发明试剂盒具有混合底物和肝微粒体:混合探针底物在250 μ L孵育系统终浓度为非那西丁(5(^11101/1)，咪达唑仑(2.5 4 11101/1)，甲苯磺丁脲(120 μ mol/L)，右美沙芬(5 4!1101/1)，安非他酮(25 411101/1)，美芬妥英(5(^11101/1)。小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体在250 μ L孵育系统中蛋白终浓度为0.4mg/ml。试剂盒说明书也提供系列药物在250 μ L孵育系统合理配制的建议终浓度:0.05、0.15、0.5、1.5、5、15、50、100 μ mol/L,最终
2.5 μ L混合探针底物+2.5 μ L系列药物浓度+5 μ L20mg/ml小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体与NADPH再生系统共孵育于37°C水浴中lh。
[0010](C)试剂盒说明书提供建立能同时检测六个代谢产物的LC-MS/MS方法，通过检测六个代谢产物的量来评价药物对CYP450酶活性的抑制作用:孵育Ih后，用3倍(甲醇:乙腈=1:1)沉淀蛋白，涡旋震荡2分钟，14000转离心10分钟，取上清进样于LC-MS/MS，检测六种酶代谢产物的量。液相条件:以流动相A (含0.1%甲酸和5mM甲酸铵的纯水)和B (乙腈)梯度洗脱:30%B (0min)，85%B (1.5-4.5min),30%B (4.6min);柱温 25°C，流速为
0.35mL.min-1,运行时间5min ;进样体积10 μ L。质谱条件:以ESI源正离子MRM方式检测，毛细管温度320°C，毛细管电压+4000V，雾化电压25psi，干燥气流速10L/min，其它质谱分析参数见表1。
[0011] 表1代谢产物的离子对[0012]
【权利要求】
1.一种高通量筛选CYP450酶抑制药物的试剂盒，其组成为=NADPH再生系统；0.1mol/L磷酸盐缓冲液；混合探针底物；混合探针底物的代谢产物；肝微粒体；所述六种混合探针底物为:非那西丁(5mmol/L),咪达唑仑(250 μ mol/L),甲苯磺丁脲(12mmol/L),右美沙芬(500 μ mol/L),安非他酮(2.5mmol/L),美芬妥英(5mmol/L);所述六种混合探针底物的代谢产物:扑热息痛(I μ g/ml), 1-羟基咪达唑仑(I μ g/ml),4-羟基甲苯磺丁脲(I μ g/ml),右啡烧(I U g/ml),羟基安非他酮(I μ g/ml),4-羟基美芬妥英(I μ g/ml)。
2.按权利要求1的试剂盒，其特征在于=NADPH再生系统包括A液:2.5mmol/LNADPNa2,10U/mL6-磷酸葡萄糖脱氢酶,20mmol/L氯化镁，B液:50mmol/L6-磷酸葡萄糖。
3.按权利要求1的试剂盒，其特征在于:0.lmol/L磷酸缓冲液组成是29g磷酸氢二钠，2.96g磷酸二氢钠，42.5g氯化钠，11.Sg氯化钾，最终溶解于I升蒸馏水中。
4.按权利要求1的试剂盒，其特征在于:肝微粒体可以是小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体中的一种，其浓度为20mg/ml。
5.一种CYP450酶抑制药物的研究方法，其特征在于包括如下步骤: 1)通过配制245μ L孵育的NADPH再生反应体系包括50 μ LA液+10 μ LB液+2.5 μ L混合探针底物+2.5 μ L系列药物浓度+180 μ L0.lmol/L磷酸缓冲液预孵育于37°C水浴中5min,再加入20mg/ml小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体5 μ L,孵育Ih ;所述2.5 μ L混合探针底物在250 μ L孵育系统终浓度为非那西丁(50 μ mol/L),咪达唑仑(2.5 μ mol/L),甲苯磺丁脲(120 μ mol/L),右美沙芬(5 μ mol/L),安非他酮(25 μ mol/L),美芬妥英(50 μ mol/L)； 2)然后，按体积比为 甲醇:乙腈=1:1的比例配置蛋白沉淀液，用3倍体积的蛋白沉淀液沉淀蛋白，涡旋震荡2分钟，14000转离心10分钟，取上清进样于LC-MS/MS，计算系列药物浓度对六种酶的抑制百分率，由GraphPad Prism 5软件绘制抑制曲线并计算IC5tl值。
6.按权利要求5的研究方法，其特征在于:250μ L NADPH再生反应体系中NADPNa2终浓度为0.5mmol/L,6-磷酸葡萄糖脱氢酶的终浓度为2U/mL，氯化镁的终浓度为4mmol/L，6-磷酸葡萄糖的终浓度为lOmmol/L。
7.按权利要求5的研究方法，其特征在于:系列药物浓度在250μ L孵育系统终浓度为0.05,0.15,0.5、1.5、5、15、50、100ymol/L，再加一个 Control 组，药物溶解的有机相用乙腈溶解，最终整个孵育体系乙腈的比例控制在1%以下即可，甲醇或二甲基亚砜溶解有机相比例应控制在1%。以下。
8.按权利要求5的研究方法，其特征在于:小鼠、大鼠、狗或猴的肝微粒体在250μ L孵育系统中蛋白终浓度为0.4mg/ml。
9.按权利要求5的研究方法，其特征在于:LC-MS/MS的检测方法包括: O液相条件:以流动相A (含0.1%甲酸和5mM甲酸铵的纯水)和B (乙腈)梯度洗脱:30%B (Omin),85%B (1.5-4.5min)，30%B (4.6min);柱温 25°C，流速为 0.35mL.mirT1，运行时间5min ;进样体积10 μ L ； 2)质谱条件:以ESI源正离子MRM方式检测，毛细管温度320°C，毛细管电压+4000V，雾化电压25psi,干燥气流速10L/min,其它质谱分析参数见表1, 表1代谢产物的离子对
10.按权利要求5的研究方法，其特征在于:由公式I计算不同浓度药物作用下的相对酶活性:
Erel (%) =Ci (n)/Ci (O) X 100% (I) 式中Erel为相对酶活性，Ci (η)为不同浓度药物组测得的代谢产物生成量，Ci (O)为空白对照组的代谢产物生成量。以相对酶活性Erel为纵坐标，药物浓度的Log值为横坐标，由GraphPad Prism 5软件绘制抑制曲线并计算IC5tl值。IC5(I>50 μ mol/L说明药物对CYP450酶无抑制作用，10〈IC5Q〈50 μ mol/L说明药物是弱抑制剂，1<IC50<10 μ mol/L说明药物是中等抑制剂，IC5(I〈1 μ mol/L说明药物是强抑制剂，IC5(I〈10 μ mol/L时即表明药物在临床应用时有可能产生药物相互作用的风险。
【文档编号】C12Q1/32GK103937869SQ201410146681
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月13日 优先权日:2014年4月13日
【发明者】李海山, 韩辉, 艾文超, 李蕾, 陈会明 申请人:中国检验检疫科学研究院