一种检测鲑鱼种类的方法及其检测试剂盒和引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测鲑鱼种类的方法及其检测试剂盒和引物。该方法包括以下步骤：(1)以待检测样本的基因组DNA为模板，以特异性扩增引物扩增待检测样本的基因组DNA，该特异性扩增引物的序列分别如序列表中SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:10所示，(2)将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，有特异性条带的待测样本属于大西洋鲑鱼(Salmo?salar)或大马哈鱼(Oncorhynchus?keta)。和传统方法相比，该方法具有准确性及唯一性。操作人员不需要大量的从业经验，只需按照操作步骤实验即可。本发明所述试剂盒具有所需检测时间短，成本低，检测结果特异性高，检测结果判定方法简单的优点。
【专利说明】一种检测鲑鱼种类的方法及其检测试剂盒和引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及鱼类检测领域，具体涉及一种检测鲑鱼种类的方法及其检测试剂盒和引物。
【背景技术】
[0002]鲑鱼是一类洄游性鱼类，广泛分布在大西洋、太平洋，在大陆淡水湖也能找到。研究发现，游进溪流的鲑鱼，90%都在同一溪流诞生。太平洋品种的鲑鱼，一般在繁殖后数周便会死亡。鲑鱼肉、肝、精巢和头均有药用价值。其肉有补虚劳、健脾胃、暖胃和中之功效，可以治疗水肿、消瘦、消化不良、膨闷胀饱、呕吐酸水、抽搐、肿疮等症。其肝可提制鱼肝油。其精巢可提制鱼精蛋白和配制成多种鱼精蛋白制剂，适应治疗过量注射肝素所引起的反应；它对某些出血症(如上消化道急性出血、肺咳血等)也有明显的止血作用，是提取制作鱼精蛋白注射液和精蛋白锌胰岛素的重要原料。
[0003]鲑鱼是鱼精蛋白制备的原材料来源。目前，用于鱼类鉴别的方法主要是采用传统的形态学鉴别法，即对完整鱼体进行形态特征比对，操作复杂，专业性强，但是，其最大缺陷在于需要结构完整的鱼体，不能有损坏。如果仅以鱼组织样品为材料，采用传统的整体形态学手段，则无法进行鱼类鉴别。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题在于克服传统的鲑鱼传统形态学鉴别法需要完整的鱼体进行形态特征比对 ，需要结构完整、不能有损坏的鱼体，使传统鲑鱼形态学鉴别法具有操作复杂，专业性强的缺陷。采用本发明的检测方法检测鲑鱼的种类，所需检测时间短，成本低，检测结果特异性高，检测结果判定方法简单。
[0005]为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一是:(I)提取待检测样本的基因组DNA,以其为模板，以特异性扩增引物对扩增待检测样本的基因组DNA，所述特异性扩增引物对的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2，或SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4,或 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6，或 SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 8，或 SEQ ID NO: 9 和 SEQID NO: 10 所示，
[0006](2)将步骤(1)所得PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，有特异性条带的待测样本属于大西洋鲑鱼(Salmo salar)或大马哈鱼(Oncorhynchus keta)。
[0007]根据本发明，步骤(1)中所述待测样本为本领域常规的待测样本，较佳地为待测鱼体的一部分，包括:鱼肉，内脏，鱼头，鱼白，鱼籽和鱼鳞中的一种或多种。
[0008]步骤(1)中所述提取待检测样本的基因组DNA的方法为本领域常规方法，所述方法较佳地包括以下步骤:
[0009]取鱼组织样品加液氮碾磨IOmin,或者100°C烘5-8小时,待烘干后碾磨lOmin。
[0010]取碾碎后的样品加入EP管，加入细胞裂解液1ml，加入蛋白酶Κ20μ 1，混匀。
[0011]在60-70°C的恒温水浴箱水浴10-40min，也可在30_40°C水浴12_24h，间歇震荡EP管数次。
[0012]裂解好后，台式离心机以12000-13000rpm离心5_10min,取上清液小心吸入另一
离心管中。
[0013]加入2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用吸头挑出，晾干。
[0014]加入200 μ ITE重洗溶解，加入等量的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)震荡混匀，转速12000-13000rpm 离心 5-lOmin。
[0015]取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，震荡混匀，转速12000-13000rpm 离心 5-lOmin。
[0016]取上层溶液至另 一管，加入1/2体积的7.5mol/L的乙酸铵，然后加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，转速12000-13000rpm离心5-lOmin。
[0017]小心倒出上清液，吸水纸将管壁残余液滴除掉。
[0018]用lml70%的乙醇洗涤沉淀物2-3次，转速12000-13000rpm离心5-lOmin。
[0019]小心倒掉上清液，EP管置烘箱37°C烘3-5小时。
[0020]其中步骤(1)中所述PCR反应的体系较佳地为I XPCR反应缓冲液，10~15mmol/L Mg2+，0.2 ~0.3mmol/L dNTP，0.1 ~0.3 μ M 特异性扩增引物对，0.01 ~0.lU/yLTaq 酶，10 ~IOOng/μ LDNA模板。更佳地为:1 XPCR反应缓冲液，12.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP,
0.2 μ M特异性扩增引物对，0.04U/ μ LTaq酶和50ng/ μ L DNA模板。
[0021]步骤(1)中所述PCR反应的扩增程序较佳的为:(1)93~95°C预变性2~4min，
(2)93~95°C变性28~32，(3) 56~60°C退火28~32s，(4) 72°C延伸I~2min，其中步骤(2)~(4)循环次数30~35次，(5)72°C延伸3~5min，(6)4°C终止反应。更佳地为:
(1)94°C预变性 3min，(2) 94 °C 变性 30s，(3) 58°C 退火 30s，(4)72°C 延伸 lmin，其中步骤
(2)~(4)循环次数30次，(5)72°C延伸4min，(6)4°C终止反应。
[0022]本发明所述的方法更佳地还包括步骤(3):将步骤(1)所得PCR扩增产物进行测序，将测序结果与鲑鱼科的COI基因进行序列比对，样品序列与大西洋鲑鱼(Salmo salar)或大马哈鱼(Oncorhynchus keta)的COI基因的匹配度≥99%,则确定待测样本为大西洋鲑鱼(Salmo salar)或大马哈鱼(Oncorhynchus keta)。
[0023]基因之间的匹配度由Ident值表示，Ident值是指两段核酸序列的匹配度，该值越接近100%，说明两个核酸序列的相似度越高。考虑到基因基因扩增和测序的准确度影响，当Ident值≥99%时，就可以判断待测物种的基因与目的基因来自同一物种。因此当测序结果与鲑鱼属的COI基因进行序列比对时，若样品序列与大西洋鲑鱼或者大马哈鱼COI基因的Ident值≥99%，则确定待测样本为大西洋鲑鱼或者大马哈鱼。
[0024]步骤(3)所述的测序和序列比对方法均为本领域常规方法，其中所述的测序的方法较佳地为利用核酸测序仪进行测序，所述序列比对的方法较佳地为利用Blast方法进行序列比对。
[0025]为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二是:一种检测鲑鱼种类的试剂盒，其包括特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQID NO: 2，或 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4，或 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6，或 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID N0:8，或 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10 所示。
[0026]本发明所述试剂盒较佳地还包括10 X PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2。所述的IOXPCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2都如本领域常规所述。
[0027]为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三是:一种检测鲑鱼种类的引物，其序列如SEQ ID NO:1所示或者如SEQ ID NO: 2所示。
[0028]为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四是:一种检测鲑鱼种类的引物，其序列如SEQ ID N0:3所示或者如SEQ ID N0:4所示。
[0029]为解决上述技术问题，本发明的技术方案之五是:一种检测鲑鱼种类的引物，其序列如SEQ ID N0:5所示或者如SEQ ID N0:6所示。
[0030]为解决上述技术问题，本发明的技术方案之六是:一种检测鲑鱼种类的引物，其序列如SEQ ID N0:7所示或者如SEQ ID N0:8所示。
[0031]为解决上述技术问题，本发明的技术方案之七是:一种检测鲑鱼种类的引物，其序列如SEQ ID N0:9所示或者如SEQ ID NO: 10所示。
[0032]本发明所述检测鲑鱼种类的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成全序列，或通过商业合成本发明所述引物。
[0033]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。 [0034]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0035]本发明的积极进步效果在于:本发明设计的引物依据为鱼类线粒体DNA的COI基因，该基因在不同科的鱼类之间既有特异性，又有保守序列。因此，采用该基因的保守序列设计PCR引物，保证扩增出来的DNA具有种的特异性，保证能被测序和鉴定。该方法鉴别鱼种准确度高，可重复性强，误差小，操作人员不需要深厚的物种鉴定背景。
[0036]同时，I)本检测方法所需样品为鱼的一小块组织，不需要完整的鱼体。2)采用具有特异性的引物扩增cytochrome oxidase subunit I (COI)基因,确保鉴定方法的准确性及唯一性。3)和传统方法相比，本发明的操作人员不需要大量的从业经验，只需按照操作步骤实验即可。4)本发明所述试剂盒具有所需检测时间短，成本低，检测结果特异性高，检测结果判定方法简单的优点。
【具体实施方式】
[0037]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0038]实施例1检测鲑鱼引物的设计与合成
[0039]1、根据NCBI (美国国立生物技术信息中心)官方网站，查找三种鲑鱼Salmosalar、Oncorhynchus mykiss 和 Oncorhynchus keta 的 COI 基因共计 445 种，罗列部分如下:
[0040]鲑鱼的cytochrome oxidase subunit I (COI)基因如下所不:
[0041]FJ999166 FJ998966 FJ998729
[0042]FJ999161 FJ998953 FJ998718
[0043]FJ999155 FJ998950 FJ998712
[0044]FJ999148 FJ998803 EU525057[0045]FJ999131FJ998799 HQ712702
[0046]FJ999122FJ998788 HQ611128
[0047]FJ999118FJ998777 ⑶440432
[0048]FJ999109FJ998767 FJ918927 [0049]FJ998992FJ998756 EF609449
[0050]FJ998986FJ998745 FJ999539
[0051]FJ998973FJ998739 FJ999511
[0052]FJ999508JN007787 EU524353
[0053]FJ999503JN007784 EU524349
[0054]FJ999485JN007779 ⑶324184
[0055]FJ999472HQ961026 HQ339988
[0056]FJ999469HQ960962 EU752177
[0057]FJ999458HQ025008
[0058]KC015282.1
[0059]KCO15281.1
[0060]KC015280.1
[0061]⑶324181.1
[0062]JF693779.1
[0063]JF693777.1
[0064]JF693778.1
[0065]JF693776.1
[0066]JF693775.1
[0067]JF693774.1
[0068]HQ611122.1
[0069]HQ611121.1
[0070]HQ611120.1
[0071]AM911176.1
[0072]2、根据所得到的基因，利用DNAMAN5.0软件，通过多基因序列比对，查找这些基因的保守区域，得到的保守区域的DNA序列如序列表中SEQ ID N0:11所示。
[0073]3、制备引物
[0074]根据以上得到的cytochrome oxidase subunit I (COI)基因保守区域序列，采用DNAMAN5.0设计引物，引物设计参数设置为:产物长度400~600bp，引物长度18~22bp，Tm值为56~62°C，GC含量为45~55%。
[0075]得到初始引物对22对，根据多基因序列比对结果，剔除在保守区域之外的引物对，同时根据PCR扩增反应的结果，剔除无法得到特异性条带的引物对，最终选择制备了 5对引物(上海美吉生物医药科技有限公司)，所得5对引物分别命名为引物1，引物2，引物3，引物4和引物5。
[0076]所述5对引物的10条核酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 10所
/Jn ο[0077]实施例2检测鲑鱼种类
[0078]1、提取样品基因组DNA
[0079]取市售鲑鱼肉样品lg，加液氮碾磨lOmin，取碾碎后样品0.1g加入到2ml的EP管，加入细胞裂解液1ml、蛋白酶Κ20μ 1，混匀；
[0080]在62°C恒温水浴箱水浴20min,台式离心机12000rpm离心5min,取上清液小心移入另一离心管中，加入2倍体积异丙醇，倒转混匀后可以看见丝状物，用100μ I吸头挑出，晾干；
[0081]加入200 μ ITE重洗溶解，加入等量的酚:氯仿:异戊醇(25: 24: I)震荡混匀，12000rpm 离心 5min ；
[0082]取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24: I)震荡混匀，12000rpm离心5min ；
[0083]取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸铵，然后加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，12000rpm离心10min ；
[0084]小心倒出上清液，吸水纸将管壁残余液滴除掉，用lml70 %乙醇洗涤沉淀物3次，12000rpm离心10min,小心倒掉上清液，EP管置烘箱37。。烘3h，得至Ij DNA约0.2 μ g。
[0085]2、PCR方法扩增目的基因
[0086](I)PCR 反应
[0087]a、引物:取实施例1所得引物1，所述引物I中的正反向引物序列分别如序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。按照合成引物给定的浓度，配制成浓度为10 μ mol/L的溶液备用。
[0088]b、PCR反应体系为:将步骤I制备所得基因组DNA加入200μ 1TE，重新溶解作为模板；取DNA样品(模板)30μ 1，加入IOX缓冲液10μ 1、dNTPMix8y 1、Tap DNAPolymerase0.5 μ 1、正反向游引物各 5 μ 1，补充 ddH20 至 100 μ I。
[0089]C、PCR扩增程序:
[0090]PCR扩增程序包括以下步骤:(1)94°C预变性3min，(2)94°C变性30s，(3)58°C退火30s，(4)72°C延伸lmin，其中步骤(2)~(4)循环次数30次，(5)72。。延伸4min, (6)4。。终止反应。得到DNA溶液50 μ 1，其浓度约为IOOng/μ I。
[0091]3、目的基因的测序和比对
[0092]将扩增后所得目的基因样品经过凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。
[0093]将所得目的基因测序结果的5’_>3’序列，在NCBI数据库中进行Blast运行比对，与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为JX960940 (Max ident = 100% )，在NCBI数据库中查询序列JX960940，得到该基因序列的种属信息为:Salmo salar，确定该鱼组织样品属于大西洋鲑鱼(Salmo salar)。
[0094]实施例3检测鲑鱼种类
[0095]1、提取样品基因组DNA
[0096]取鲑鱼组织样品，依据实施例2所述样品基因DNA组提取方法抽提组织样品DNA。
[0097]2、PCR方法扩增目的基因 [0098](I)PCR 反应[0099]a、引物:取实施例1所得引物2，所述引物2中的正反向引物序列分别如序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。按照合成引物给定的浓度，配制成浓度为10 μ mol/L的溶液备用。
[0100]b、PCR反应体系中Mg2+浓度为15mmol/L，dNTP浓度为0.3mmol/L，扩增引物浓度为0.3 μ M，Taq酶浓度为0.1U/ μ L，DNA模板浓度为IOOng/ μ L。
[0101]C、PCR 扩增程序为(1)93°〇预变性211^11，(2) 93 °C 变性 28s，(3) 56 °C 退火 28s，(4)72°C延伸lmin，其中步骤(2)~(4)循环次数30次，(5)72。。延伸3min, (6)4°C终止反应。
[0102]3、目的基因的测序和比对
[0103]将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID N0:13所示。
[0104]将所得目的基因测序结果的5’_>3’序列，在NCBI数据库，Blast运行，与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为KF597049 (Max ident = 99% )，在NCBI数据库查询序列KF597049，得到其种属信息为:Salmo salar,从而判断该鱼组织样品属于大西洋鲑鱼种(Salmo salar)。 [0105]实施例4检测鲑鱼种类
[0106]1、提取样品基因组DNA
[0107]取鲑鱼组织样品，依据实施例2所述样品基因组DNA提取方法抽提组织样品DNA。
[0108]2、PCR方法扩增目的基因
[0109](I) PCR 反应
[0110]a、引物:取实施例1所得引物3，所述引物3中的正反向引物序列分别如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。按照合成引物给定的浓度，配制成浓度为10 μ mol/L的溶液备用。
[0111]b、PCR反应体系中Mg2+浓度为10mmol/L，dNTP浓度为0.2mmol/L，扩增引物浓度为0.1 μ M，Taq酶浓度为0.01U/ μ L，DNA模板浓度为IOng/ μ L。
[0112]c、PCR 扩增程序为(1)95°〇预变性411^11，(2)95°C变性 32s，(3)60°C退火 32s，(4)72°C延伸2min，其中步骤(2)~(4)循环次数35次，(5)72。。延伸5min, (6)4°C终止反应。
[0113]3、目的基因的测序和比对
[0114]将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID N0:14所示。
[0115]将所得目的基因测序结果的5’ ->3’序列，在NCBI数据库，运行Blast进行序列比对，与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为的序列为FJ999537 (Max ident =99% )，在NCBI数据库查询序列FJ999537，得到其种属信息为:Salmo salar,从而判断该鱼组织样品属于大西洋鲑鱼种(Salmo salar)。
[0116]实施例5检测鲑鱼种类
[0117]1、提取样品基因组DNA
[0118]取鲑鱼组织样品lg，依据实施例2所述样品基因组DNA提取方法抽提组织样品DNA。[0119]2、PCR方法扩增目的基因
[0120](I) PCR 反应
[0121]a、引物:取实施例1所得引物4，所述引物4中的正反向引物序列分别如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。按照合成引物给定的浓度，配制成浓度为10 μ mol/L的溶液备用。
[0122]b、PCR反应体系如实施例2所述。
[0123]c、PCR扩增程序如实施例2所述。
[0124]3、目的基因的测序和比对
[0125]将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO:15所示。
[0126]将所得目的基因测序结果的5’ ->3’序列，在NCBI数据库，Blast运行，与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为HQ693265(Max ident = 99% )，在NCBI查询序列HQ693265,得到其种属信息为:0ncorhynchus keta,从而判断该鱼组织样品属于大马哈鱼(Oncorhynchus keta)。
[0127]实施例6检测鲑鱼种类
[0128]1、提取样品基因组DNA
[0129]取鲑鱼组织样品lg，依据实施例2所述样品基因组DNA提取方法抽提组织样品DNA。
[0130]2、PCR方法扩增目的基因
[0131](I) PCR 反应
[0132]a、引物:取实施例1所得引物5，所述引物5中的正反向引物序列分别如序列表中SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:10所示。按照合成引物给定的浓度，配制成浓度为10 μ mol/L的溶液备用。
[0133]b、PCR反应体系如实施例2所述。
[0134]c、PCR扩增程序如实施例2所述。
[0135]3、目的基因的测序和比对
[0136]将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。
[0137]将所得目的基因测序结果的5’ ->3’序列，在NCBI数据库运行Blast，与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为JX960914(Max ident = 99% )，在NCBI查询序列JX960914,得到其种属信息为:0ncorhynchus keta,从而判断该鱼组织样品属于大马哈鱼(Oncorhynchus keta)。
[0138]对比实施例1
[0139]1、提取样品基因组DNA
[0140]取市售鲤鱼鱼肉组织，提取方法同实施例2，得到基因组DNA约0.2 μ g。
[0141]2、PCR方法扩增目的基因
[0142](I) PCR 反应
[0143] a、引物:取实施例1所得引物1，所述引物I中的正反向引物序列分别如序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。按照合成引物给定的浓度，配制成浓度为lOymol/L的溶液备用。
[0144]b、PCR反应体系如实施例2所述。
[0145]c、PCR扩增程序如实施例2所述，所述PCR扩增程序中的阴性对照为以蒸馏水为模板进行PCR扩增，其中的阳性对照组为以实施例1所述大西洋鲑鱼的基因组DNA为模板进行PCR扩增实验。
[0146]3、目的基因的测序和比对
[0147]利用实施例2所述PCR方法，无法从阴性对照组和鲤鱼的鱼肉组织中扩增出特异性的目的基因条带，在阳性对照组中能够扩增出特异性条带，说明样品中完全不含与引物I匹配的DNA模板，因此所检测样品不是来自鲑鱼。
[0148]对比实施例2
[0149]1、提取样品基因组DNA
[0150]取金鱼的鱼肉组织，基因组DNA的提取方法同实施例2，得到基因组DNA约
0.2 μ go
[0151]2、PCR方法扩增目的基因
[0152](I) PCR 反应 [0153]a、引物:取实施例1所得引物2，所述引物2中的正反向引物序列分别如序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。按照合成引物给定的浓度，配制成浓度为10 μ mol/L的溶液备用。
[0154]b、PCR反应体系如实施例2所述。
[0155]c、PCR扩增程序如实施例2所述，该PCR扩增程序中的阴性对照为以蒸馏水为模板进行PCR扩增，其中的阳性对照组为以实施例2所述大西洋鲑鱼的基因组DNA为模板进行PCR扩增实验。
[0156]3、PCR扩增结果及其分析
[0157]利用实施例2所述PCR方法，无法从阴性对照组和金鱼的鱼肉组织中扩增出特异性条带，在阳性对照组中能够扩增出特异性条带，说明样品中完全不含与引物I匹配的DNA模板，因此所检测样品不是来自鲑鱼。
[0158]对比实施例3
[0159]1、提取样品基因组DNA
[0160]取不同来源的鱼肉组织，其基因组DNA的提取方法同实施例2，得到基因组DNA约
0.2 μ go
[0161]2、PCR方法扩增目的基因
[0162](I) PCR 反应
[0163]a、引物:取实施例1中所有引物1-5。按照合成引物给定的浓度，配制成浓度为
10μ mol/L的溶液备用。
[0164]b、PCR反应体系如实施例2所述。
[0165]c、PCR扩增程序如实施例2所述，该PCR扩增程序中的阴性对照为以蒸馏水为模板进行PCR扩增，其中的阳性对照组为以实施例2所述大西洋鲑鱼的基因组DNA为模板进行PCR扩增实验。
[0166]3、PCR扩增结果及其分析[0167]目的基因的分析、测序和比对方法如实施例2所述。在阴性对照组中无法扩增出特异性条带，在阳性对照组中能够扩增出特异性条带。
[0168]所得结果及分析如表1-5所示:
[0169]表1引物I的扩增结果和测序结果
[0170]
【权利要求】
1.一种检测鲑鱼种类的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)提取待检测样本的基因组DNA，以其为模板，以特异性扩增引物对扩增待检测样本的基因组DNA，所述特异性扩增引物对的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，或 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4，或 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6，或 SEQ ID NO: 7 和 SEQID NO: 8，或 SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10 所示， (2)将步骤⑴所得PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，有特异性条带的待测样本属于大西洋鲑鱼(Salmo salar)或大马哈鱼(Oncorhynchus keta)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(3)，将步骤(1)所得PCR扩增产物进行测序，将测序结果与鲑鱼科的COI基因进行序列比对，样品基因序列与大西洋娃鱼(Salmo salar)或大马哈鱼(Oncorhynchus keta)的COI基因的匹配度> 99%,则确定待测样本为大西洋娃鱼(Salmo salar)或大马哈鱼(Oncorhynchus keta)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，所述PCR反应中，PCR的反应体系为:1XPCR 反应缓冲液，10 ~15mmol/L Mg2+，0.2 ~0.3mmol/L dNTP，0.1 ~0.3 μ M特异性扩增引物对，Taq酶0.01~0.1U/ μ L, DNA模板10~100ng/ μ L。
4.一种检测鲑鱼种类的试剂盒，其特征在于，其包括特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:2，或SEQ ID Ν0:3和SEQ IDNO: 4，或 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO: 6，或 SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 8，或 SEQ ID NO: 9 和SEQ ID NO: 10 所示。
5.一种检测鲑鱼种类的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:1所示或者如SEQ IDNO:2所示。
6.一种检测鲑鱼种类的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID Ν0:3所示或者如SEQ IDNO:4所示。
7.一种检测鲑鱼种类的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID Ν0:5所示或者如SEQ IDNO:6所示。
8.一种检测鲑鱼种类的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID Ν0:7所示或者如SEQ IDNO:8所示。
9.一种检测鲑鱼种类的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID Ν0:9所示或者如SEQ IDNO: 10所示。
【文档编号】C12N15/11GK103966347SQ201410231413
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】江文涛, 黄臻辉 申请人:上海第一生化药业有限公司