一种光学纯r-乙偶姻的生产方法
【专利摘要】一种光学纯R-乙偶姻的生产方法，包括如下步骤：将(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因(bdh)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh)在大肠杆菌中共表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻。葡萄糖脱氢酶能够提供(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶所需的辅酶NADH，而(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶在NADH存在的条件下具有催化丁二酮生成光学纯R-乙偶姻的特性，R-乙偶姻的产量可达26g/L，光学纯度为99.6％。本发明的方法培养基简单，操作过程简便，产物分离方便，不需要复杂的手性拆分步骤，并且实现胞内辅酶的再生，成本低，极具工业应用前景。
【专利说明】一种光学纯R-乙偶姻的生产方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种光学纯R-乙偶姻的生产方法，具体是将（R，R)_2,3-丁二醇脱氢 酶基因（bdh)和葡萄糖脱氢酶基因（gdh)在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细 胞为生物催化剂，以丁二酮和葡萄糖为底物高效生产光学纯R-乙偶姻的方法。 【背景技术】
[0002] 乙偶姻（acetoin)，即 3_ 轻基 _2_ 丁酮（3-hydroxy-2_butanone)，有两种旋光异 构体（R-乙偶姻和S-乙偶姻），天然地存在于乳品、黄油、干酪、酒类、玉米、葡萄、苹果、草 莓、可可等各类食品中，国家标准GB2760-86规定其为允许添加食用的食品香料。乙偶姻应 用广泛，其具有明显的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生产。此 夕卜，乙偶姻是一种重要的化学合成中间体和多功能材料，2004年美国能源部将乙偶姻列为 30种优先开发利用的平台化合物之一，可广泛应用于食品、制药、化工等领域。例如，80%含 量的乙偶姻俗称"醋嗡"，是酒类调香中一个极其重要的品种。含有乙偶姻和丁二酮的混合 物还可以用来治疗乳腺炎。在制药工业中，光学纯乙偶姻作为具有立体结构专一的化合物 可以用来合成合成具有光学活性的手性药物，从而较大程度地提高药效，减轻药物的副作 用。此外，光学纯乙偶姻还可用于合成手性液晶复合材料。
[0003] 光学纯乙偶姻的生产方法主要分为两类：化学合成法与生物合成法。化学合成 的原料来源于不可再生的化石资源--石油，原料来源受到限制，且合成过程繁琐，最后 还需要通过化学法进行复杂的手性拆分，存在成本高、收率低、光学纯度低、高能耗、高污 染的问题，因此难以实现低成本大规模生产。生物合成方法生产乙偶姻具有诸多优点， 如产品绿色天然、反应条件温和、污染少、能耗低，是一种十分具有发展前景的环境友好 合成方法，近年来受到了越来越多的关注。然而，天然微生物发酵产生的一般都是R-乙 偶姻和S-乙偶姻的旋光异构体混合物，发酵产物手性拆分工艺繁琐，成本高昂。1984 年，Ui等报道了利用Pseudomonas sp. S-4发酵法合成单一构型R-乙偶姻【]\?61'1116111:· Technol·，1984, 62:151-156】。该法存在产物浓度低（1.72g/L)和发酵周期长（48h)的 问题。中国专利申请号CN201310346916. 8于2013年公开了郝健等利用一株克雷伯氏 肺炎菌（Klebsiella pneumoniae)突变菌株发酵生产R-乙偶姻，最高产量为35. 7g/ L。然而，Κ· pneumoniae被世界卫生组织列为致病菌株（Risk group2, pathogenic microorganisms)，大规模工业化生产的安全性原则在很大程度上限制了其应用 [Biotechnol. Adv. , 2009, 27:715-725 ；Appl.Environ. Microbiol. , 2011, 77:5467-5475 ； Bioresour. Technol. , 2012, 124:237-244】。
[0004] 鉴于此，人们尝试构建大肠杆菌基因工程菌株来合成R_乙偶姻。1998年，Ui 等将Κ· pneumoniae编码α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和meso-2, 3-丁二 醇脱氢酶的基因簇整合到大肠杆菌中，然后将meso-2, 3-丁二醇脱氢酶的编码基因敲 除，获得的重组大肠杆菌可以发酵葡萄糖产生17. 5g/L光学纯R-乙偶姻【Lett. Appl. Microbiol.，1998, 26:275-278】，但发酵法由于发酵液成分复杂，导致发酵产物分离提取困 难。此外，该法还存在发酵周期长和底物转化率低的问题，限制了其产业化应用。
[0005] 多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)的（R, R)-2, 3- 丁 二醇脱 氢酶在NADH存在的条件下可以催化丁二酮还原为R-乙偶姻【Appl. Environ. Microbiol.，2011，77:4230-4233】。两株 P. polymyxa(ATCC12321 和 ZJ-9)的 bdh 基因已 被证明编码（R，R)-2, 3- 丁二醇脱氢酶【Appl. Environ. Microbiol.，2011，77:4230-4233 ; J. Basic.Microbiol.，2012, 52, 1-9】，但目前尚未有 P. polymyxa DSM365 菌株 bdh 基因 的相关信息报道。中国专利申请号CN201010564858公开了一种使用纯酶催化还原丁 二酮的方法制备光学纯R-乙偶姻，通过构建重组大肠杆菌表达P. polymyxa ATCC12321 菌株的（R，R)_2, 3- 丁二醇脱氢酶，然后破碎细胞，通过表达产物分离纯化获得纯化的 (R，R) -2, 3- 丁二醇脱氢酶。在加入辅酶NADH的条件下，纯化的（R，R) -2, 3- 丁二醇脱氢酶 可以转化丁二酮产生光学纯R-乙偶姻。纯酶催化方法具有产物分离纯化简便的优点，但需 要破碎细胞和分离纯化酶，而且需要加入昂贵的辅酶NADH，工艺繁琐，成本较高。
[0006] 休止细胞催化是指利用完整的休止细胞作为生物催化剂进行生物转化，其本质 是利用细胞内的各种酶进行催化反应，综合了发酵法和酶法催化这两种技术的优点，克 服了发酵法存在的诸多缺点。至今有两篇文献报道使用休止细胞催化的方法制备光学 纯R -乙偶姻。2002年，Yamada-Onodera等在大肠杆菌中表达Hansenula polymorpha 的甘油脱氢酶，然后将重组大肠杆菌休止细胞作为全细胞生物催化剂转化光学纯 〇?，1〇-2,3-丁二醇为1?-乙偶姻，产物光学纯度达到了99.9%，但是产量很低（9.68 8/ L)【Acta Biotechnol, 2002, 22:355-362】。此外，中国专利申请号 CN200910013902. 8; PLoS ONE, 2010,5:e8860等通过构建重组大肠杆菌异源表达来自于Bacillus subtilis的 (R, R)-2, 3-丁二醇脱氢酶和来自于Lactobacillus brevis的NADH氧化酶，获得能够催 化光学纯（R，R)-2, 3- 丁二醇成为光学纯R-乙偶姻的重组大肠杆菌生物催化剂，但产物光 学纯度较低（96%)。然而，上述的休止细胞催化反应均需要使用工业难以制备的昂贵原 料--光学纯（R，R)_2, 3-丁二醇，难以实现大规模的商业化生产。而丁二酮价格远远低于 光学纯（R，R)-2, 3- 丁二醇，若能利用其为前体合成光学纯R-乙偶姻，则能有效降低R-乙 偶姻的生产成本，从而更具有商业化应用前景。
[0007] 经广泛的文献和专利检索，我们发现来源于枯草芽孢杆菌168的葡萄 糖脱氧酶基因 gdh，作为辅酶在文献Engineering of cofactor regeneration enhances (2S，3S)-2, 3-butanediol production from diacetyl·中已被报道[SCIENTIFIC REPORTS.，2013, 3:1-6]。但目前尚未有 P. polymyxa DSM365 菌株（R, R)-2, 3- 丁二醇脱氢 酶基因（bdh)的相关信息报道；而将该基因与葡萄糖脱氢酶基因（gdh)在大肠杆菌中进行 共表达，并以此重组菌株制备休止细胞生物催化剂实现偶联丁二酮还原和辅酶NADH再生 的R-乙偶姻生产方法，国内外亦无公开文献专利报道。
【发明内容】
[0008] 针对上述现有方法中存在的R-乙偶姻产量低、光学纯度低、产物提取困难、成本 高、难以大规模低成本生产的不足，本发明提供一种光学纯R-乙偶姻的生产方法。
[0009] 本发明是利用（R，R)_2, 3- 丁二醇脱氢酶可以立体专一的催化丁二酮生成光学纯 R-乙偶姻，以及葡萄糖脱氢酶能够实现胞内辅酶NADH再生的性质，将（R，R)-2, 3-丁二醇脱 氢酶基因（bdh)和葡萄糖脱氢酶基因（gdh)导入大肠杆菌中进行共表达，以此重组大肠杆 菌休止细胞为生物催化剂转化丁二酮，实现光学纯R-乙偶姻的高效低成本合成。
[〇〇1〇] 本发明所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，是将（R，R)_2, 3-丁二醇脱氢酶基因 (bdh)和葡萄糖脱氢酶基因（gdh)导入大肠杆菌中进行共表达，以此重组大肠杆菌休止细 胞为生物催化剂，以丁二酮为前体，葡萄糖为辅酶再生原料，实现光学纯R-乙偶姻的高效 低成本合成。
[0011] 其中：所述（R，R)-2, 3- 丁二醇脱氢酶基因可来源于多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、解淀粉芽抱杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯 菌（Klebsiella oxytoca)、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes)、粘质沙雷菌（Serratia marcescens)、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)和地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)〇
[0012] 进一步的，所述（R，R)_2, 3-丁二醇脱氢酶基因来源菌株优选是Paenibacillus polymyxa DSM365。该菌株购于德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，菌株编号是 DSM365。
[0013] 上述的重组大肠杆菌是采用常规的方法先克隆（R，R)_2, 3- 丁二醇脱氢酶基因 (bdh)和葡萄糖脱氢酶基因（gdh)，再构建pETDuet-bdh-gdh重组质粒，转化到大肠杆菌，优 选大肠杆菌BL21中，然后经筛选获得；其含有bdh和gdh基因，为革兰氏阴性菌，需氧或兼 性厌氧生长，较佳培养温度为37°C，其休止细胞可用于催化丁二酮生产光学纯R-乙偶姻。
[0014] 其中，上述重组大肠杆菌所含的Paenibacillus polymyxa DSM365的 (R，R)-2, 3-丁二醇脱氢酶基因（bdh)序列长度为1053个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所含的Bacillus subtilisl68的葡萄糖脱氢酶基因（gdh)序列长度为786个 碱基，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0015] 本发明所述生产光学纯R_乙偶姻的方法中，以重组大肠杆菌/pETDuet-bdh-gdh 休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻的具体方法是：
[0016] (1)平板培养：将重组大肠杆菌划线到含有质量体积比为1. 5?1. 8%琼脂的并含 有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养12小时；
[0017] (2)种子培养：在无菌的条件下，用牙签挑取步骤（1)平板上的一个单菌落，然后 接种到10?100mL含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养；
[0018] (3)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤（2)所得的菌液以体积比为1?10%的接 种量接种到〇. 5?10L的含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养2?10 小时，然后再加入终浓度为〇. 1?3mM的IPTG，10?37°C诱导2?20小时，得到一种培养 物；
[0019] 其中，上述步骤（1)?⑶中所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母 粉，10g/L NaCl，121°C条件下灭菌15分钟；
[0020] (4)收集菌体：将步骤（3)培养得到的培养物5, 000?8, OOOrpm离心5?15分 钟；并用生理盐水洗涤菌体2?3遍，然后将细胞悬浮于pH6?8的缓冲液中，使细胞干重的 终浓度为2?20g/L，即得到重组大肠杆菌休止细胞生物催化剂，置于4°C的冰箱中待用；
[0021] (5)转化反应制备光学纯R-乙偶姻：以细胞干重浓度为2?20g/L的生物催化剂， 在10?42°C、pH5?9条件下，50?200rpm震荡条件下对底物进行转化，转化初始浓度为 5?25g/L的丁二酮，并加入10?100g/L的葡萄糖以补充反应所需辅酶因子的消耗；每隔 3小时取样，样品以8, 000?12000rpm离心5?15分钟，去除所加入的全细胞生物催化剂； 利用气相色谱方法检测上清中丁二酮的浓度，间隔补加丁二酮，使反应体系中的丁二酮浓 度维持在5?25g/L之间；利用SBA生物传感分析仪检测葡萄糖浓度，使反应体系中的葡萄 糖浓度维持在5?50g/L之间。对上清进行气相色谱分析测定转化液中乙偶姻的浓度及光 学纯度，R-乙偶姻光学纯度的计算方法：ee= ([R] - [S]V([R] + [S])X100% ;当R-乙偶 姻的浓度不再增加时，停止转化。
[0022] 上述生产光学纯R-乙偶姻的方法中：
[0023] 步骤（3)所述诱导温度优选10?30°C ;诱导时间优选10?20小时。
[0024] 步骤（5)所述转化反应优选细胞干重浓度为5?20g/L，在20?37°C，pH6?9条 件下对丁二酮进行转化。
[0025] 步骤（5)所述初始丁二酮浓度优选10?20g/L，初始葡萄糖浓度优选20?50g/ L〇
[0026] 步骤（5)所述转化反应过程中补加丁二酮和葡萄糖，丁二酮浓度优选维持在10? 20g/L，葡萄糖浓度优选维持在10?50g/L。
[0027] 本发明首次成功的实现了将（R，R)_2, 3- 丁二醇脱氢酶基因（bdh)和葡萄糖脱氢 酶基因（gdh)在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞作为生物催化剂，以丁二 酮为前体，葡萄糖为辅酶再生原料，高效生产光学纯R-乙偶姻。
[0028] 本发明具有以下特点：
[0029] (1)首次构建并应用了可以共表达（R，R)_2, 3-丁二醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的 重组大肠杆菌，其休止细胞可作为生物催化剂用于转化丁二酮高效生产光学纯R-乙偶姻。
[0030] (2) (R，R)-2, 3-丁二醇脱氢酶催化丁二酮生成光学纯R-乙偶姻；葡萄糖脱氢酶能 够实现胞内辅酶的再生，提供（R，R)-2, 3- 丁二醇脱氢酶所需的NADH。
[0031] (3)菌株要求的培养基简单、成本低。
[0032] (4)直接用完整的重组大肠杆菌休止细胞作为生物催化剂进行转化，不需要破碎 细胞和分离纯化酶，操作过程简单。
[0033] (5)反应体系中仅存在单一构型的R-乙偶姻，因此不需要复杂的手性拆分步骤。
[0034] (6)生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续精馏分离提取费用低廉。 【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1大肠杆菌的蛋白电泳图。M:Maker ;1 :大肠杆菌BL21 ;2 :大肠杆菌BL21/ pETDuet-1 ;3 :大肠杆菌 BL21/pETDuet_gdh ;4 :大肠杆菌 BL21/pETDuet_bdh-gdh ;5 :纯化 的（R, R) _2, 3- 丁二醇脱氢酶。 【具体实施方式】
[0036] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所述的内容仅限于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。
[0037] 实施例1
[0038] 重组大肠杆菌BL21/pETDuet-bdh_gdh的构建
[0039] 用常规的方法制备菌株Paenibacillus polymyxa DSM365的基因组DNA，对该 菌株的基因组进行全序列测序和代谢网络解析，并对相关基因进行注释和功能鉴定，获 得了该菌株的（R，R)_2, 3- 丁二醇脱氢酶基因的编码序列；使用合成的引物P1和P2,以 P. polymyxa DSM365的基因组DNA为模板，PCR扩增得到（R，R)-2, 3- 丁二醇脱氢酶基因 (bdh)。Bacillus subtilisl68菌株的基因组序列从NCBI数据库上获得，使用合成的引物 P3和P4,以B. subtilisl68的基因组DNA为模板，PCR扩增得到葡萄糖脱氢酶基因（gdh)。
[0040] 所述的PI、P2、P3和P4序列分别为：
[0041] P1 :5, -GATGCCATGGAAGCATTGAGATGGCATGG-3,；
[0042] P2 :5, -TCGCGAGCTCTTAAGCTTGCGGAGATACCAG-3，。
[0043] P3 :5' -CGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGG-3' ；
[0044] P4 :5' -GATCCAGACGTCTTAACCGCGGCCTGC-3'。
[0045] 上述bdh基因序列长度为1053个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述；gdh基 因序列长度为786个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
[0046] 将PCR扩增得到的两个PCR产物分别双酶切并连接到pETDuet-1质粒，得到重组 质粒pETDuet-bdh-gdh ;将上述重组质粒经过转化导入宿主大肠杆菌BL21，得到重组大肠 杆菌BL21/pETDuet-bdh-gdh。该菌株在含100μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 培养3小时，加入终浓度为0. 5mM的IPTG，16°C诱导10小时，得到表达有（R，R)-2, 3- 丁二 醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌细胞，经12. 5%的SDS-PAGE验证，结果如图1所 /_J、1 〇
[0047] 上述重组大肠杆菌为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，可以用于催化丁二酮 生产光学纯R-乙偶姻。
[0048] 实施例2
[0049] 重组大肠杆菌休止细胞生物催化剂的制备
[0050] (1)平板培养：将重组大肠杆菌BL21/pETDuet-bdh-gdh划线到含有质量体积比为 1. 8%琼脂的并含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养12小时；
[0051] (2)种子培养：在无菌的条件下，用牙签挑取步骤（1)平板上的一个单菌落，然后 接种到20mL的含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养12小 时；
[0052] (3)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤⑵所得的菌液以体积比为1%的接种量 接种到2L含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养3小时，然后再加入终 浓度为〇. 5mM的IPTG，16°C诱导10小时，停止培养；
[0053] 其中，上述步骤（1)?⑶中所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母 粉，10g/LNaCl，121°C条件下灭菌15分钟；
[0054] (4)收集菌体：将步骤（3)培养得到的培养物8, OOOrpm离心5分钟；并用生理盐 水洗涤菌体2遍，然后将细胞悬浮于pH7的缓冲液中，使细胞干重的终浓度为15g/L，即得到 重组大肠杆菌休止细胞生物催化剂，置于4°C的冰箱中待用。
[0055] 实施例3
[0056] 利用重组大肠杆菌休止细胞作为生物催化剂制备光学纯R_乙偶姻
[0057] 选择上述获得的重组大肠杆菌休止细胞作为催化剂进行如下转化过程：在30°C、 pH7条件下，180rpm摇床震荡，转化初始浓度为20g/L的丁二酮，并加入20g/L的葡萄糖以 补充反应所需辅因子的消耗；每隔3小时取样，样品以8, OOOrpm离心10分钟，去除所加入 的全细胞生物催化剂，利用气相色谱方法检测上清中丁二酮的浓度，根据丁二酮浓度补加 丁二酮，使丁二酮浓度维持在10?20g/L之间；对上清进行气相色谱分析测定转化液中 R-乙偶姻的浓度及光学纯度；16小时后检测结果显示：R-乙偶姻的浓度为26g/L，其光学 纯度为99. 6%。
[0001]
[0002]
[0003]
【权利要求】
1. (R，R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因 bdh，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
2. -种光学纯R_乙偶姻的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述 (R，R) -2, 3- 丁二醇脱氢酶基因 bdh以及葡萄糖脱氢酶基因 gdh在大肠杆菌中表达，并以此 重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻。
3. 如权利要求2所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，所述以重组大肠杆 菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻的方法，包括如下步 骤： (1) 平板培养：将重组大肠杆菌划线到含有质量体积比为1. 5?1. 8%琼脂的并含有 100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C过夜培养； (2) 种子培养：在无菌的条件下，用牙签挑取步骤（1)平板上的一个单菌落，然后接种 到10?100mL含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养； (3) 发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤（2)所得的菌液以体积比为1?10%的接种量 接种到0. 5?10L的含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C培养2?10小 时，然后再加入终浓度为〇. 1?3mM的IPTG，10?37°C诱导2?20小时，得到一种培养物； 其中，上述步骤（1)?（3)中所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/ LNaCl，121°C条件下灭菌15分钟； (4) 收集菌体：将步骤（3)培养得到的培养物5, 000?8, OOOrpm离心5?15分钟；并 用生理盐水洗涤菌体2?3遍，然后将细胞悬浮于pH6?8的缓冲液中，使细胞干重的终浓 度为2?20g/L，即得到重组大肠杆菌休止细胞生物催化剂，置于4°C的冰箱中待用； (5) 转化反应制备光学纯R-乙偶姻：以细胞干重浓度为2?20g/L的生物催化剂，在 10?42°C、pH5?9条件下，50?200rpm震荡条件下对底物进行转化，转化初始浓度为5? 25g/L的丁二酮，并加入10?100g/L的葡萄糖以补充反应所需辅酶因子的消耗；间隔补加 丁二酮和葡萄糖，使反应体系中的丁二酮浓度维持在5?25g/L之间，葡萄糖浓度维持在 5?50g/L之间，当R-乙偶姻的浓度不再增加时，停止转化。
4. 如权利要求3所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，步骤（3)所述诱导温 度优选10?30°C ;诱导时间优选10?20小时。
5. 如权利要求3所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，步骤（5)所述转化反 应优选细胞干重浓度为5?20g/L，在20?37°C，pH6?9条件下对丁二酮进行转化。
6. 如权利要求3所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，步骤（5)所述初始丁 二酮浓度优选10?20g/L，初始葡萄糖浓度优选20?50g/L。
7. 如权利要求3所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，步骤（5)所述转化反 应过程中补加丁二酮和葡萄糖，丁二酮浓度优选维持在10?20g/L，葡萄糖浓度优选维持 在 10 ?50g/L。
8. (R，R)-2, 3- 丁二醇脱氢酶基因 bdh在光学纯R-乙偶姻生产方面的应用。
【文档编号】C12R1/19GK104087602SQ201410341765
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】谢能中, 黄日波, 李检秀, 郭铃, 黄艳燕, 杜奇石, 王青艳, 李亿 申请人:广西科学院