一种猕猴桃自然杂合子的鉴定方法

一种猕猴桃自然杂合子的鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种猕猴桃自然杂合子的鉴定方法，涉及植物遗传资源评价和生物【技术领域】。本方法具体步骤是：①采集待鉴定的自然杂合子样本和假定的对照亲本；②采用微卫星分子标记对所有样本进行基因组遗传分析；③构建所有样本的微卫星分子基因表型数据库；④利用分子表型数据的多元对应分析确定真正的对照亲本；⑤基于对照亲本鉴定自然杂合子。本发明相比传统的猕猴桃自然杂合子鉴定方法，具有分子实验方法简便，分析鉴定流程快速高效等特点；同时本方法可以克服猕猴桃纯和对照样本确定困难、基因组倍性复杂数据不好处理等问题；本方法还可以减轻遗传共祖对杂合子鉴定带来的影响。
【专利说明】一种猕猴桃自然杂合子的鉴定方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物遗传资源评价和生物【技术领域】，尤其涉及一种猕猴桃自然杂合子 的鉴定方法。具体涉及猕猴桃属植物不同物种内和物种间自然杂合子和对照亲本的基因组 微卫星分子标记遗传评价，利用改进的分子基因表型数据处理和分析方法辅助确定真正的 对照亲本，在此基础上利用参数优化的分析软件对自然杂合子进行筛选和鉴定。

【背景技术】
[0002] 称猴桃隶属称猴桃科（Actinidiaceae)称猴桃属（Actinidia Lindl.)，为多年 生木质藤本植物。该属植物共有54个种，21个变种共约75个分类单元。中华猕猴桃 (A.chinensis Planchon)复合体的两个变种中华称猴桃（A.Chinensis var.chinensis) 和美味称猴桃（A. chinensis var. deliciosa)是现代栽培称猴桃育成品种的主要来源， 同时还包括毛花称猴桃（A. eriantha Bentham)、软麥称猴桃（A. arguta(Siebold and Zuccarini))等其他物种。我国是猕猴桃的原产国，自然资源异常丰富。先前的研究表明， 猕猴桃属植物种内种间存在广泛的自然杂交渐渗现象，连同多倍化一起共同促进了猕猴桃 属植物的形态和生态适应性多样化。同时，对现有的猕猴桃主栽品种的分析表明，大多数 好的品种都源自于猕猴桃的自然杂交带种质，经过短暂的一代或者几代的人工驯化培育而 成。因此，自然杂合子种质的遗传鉴定是利用其进行猕猴桃遗传育种的前提。然而，由于猕 猴桃本身的植物学特性（如多年生和雌雄异株）和复杂的倍性基因组遗传，迄今为止缺乏 快速高效的对猕猴桃自然杂合子的鉴定方法。
[0003] 植物自然杂交带的出现是由于两个或者多个具有不同地理分布、生物学特性或者 遗传与生态属性的物种或者种内进化单元相遇并交配形成可育的后代，从基因组遗传变异 的角度即形成不同程度的基因组混合现象。对自然杂合子的遗传鉴定评价，其关键在于对 其基因组遗传混合情况的测定。现有的植物自然杂交带杂合子的鉴定方法通常需要清晰 的杂交带居群样本取样和杂交亲本纯和对照居群的设置，同时利用分子标记对杂交居群样 本和对照样本进行遗传变异检测，并进一步利用相关分析软件对具有基因组遗传混合的杂 合子进行识别鉴定。然而，对于猕猴桃而言，采用这一常规的方法具有几个困难：（1)由于 不同猕猴桃物种种间或者变种间存在广泛的重叠分布现象以及其固有的雌雄异株的特性， 加上本身猕猴桃自然分布的广泛和地方适应性进化的存在，参与杂交的亲本其自然纯和对 照居群很难简单的从形态学上确定；（2)猕猴桃物种间和物种内存在复杂的基因组倍性变 异，这样常规的分子标记数据处理方法不适用于猕猴桃的分子数据分析；（3)猕猴桃属于 富含多糖多酚类植物，获取高质量的基因组DNA比较困难，不适用于大多数分子标记技术 的有效开展。如何平衡实验方法的可用性和统计分析的困难之间的矛盾是猕猴桃杂合子鉴 定的难题之一。
[0004] 先前的研究表明，在猕猴桃植物的野生居群中，自然杂交的发生往往包含多于两 个亲本的网状基因流，这为猕猴桃自然杂合子的鉴定带来进一步的困难。不同于简单的人 工杂交体系，有的猕猴桃自然杂合子可能同时混合了多个亲本的基因组遗传信息，其形成 过程也可能包括了不同形式或者多个不同世代的杂交渐渗。如何初步的分析和识别鉴定这 些不同类型的杂合子也是猕猴桃自然种质发掘利用的技术需求之一。同时，从进化遗传学 的角度，基因组共有等位基因的共祖现象会在一定程度干扰杂合子识别，因而需要优化识 别基因组混合频率的起始值。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种猕猴桃自然杂合子的鉴定方法。
[0006] 本发明的目的是这样实现的：
[0007] -、方法
[0008] 通过对猕猴桃属植物不同物种内和物种间自然杂合子和对照亲本的基因组微卫 星分子标记遗传评价，采用改进的分子分析方法识别确定对照亲本并在此基础上形成自然 杂合子快速高效的鉴定流程。
[0009] 其技术方案包括待鉴定猕猴桃自然合子和假定的对照亲本居群进行样本采集，利 用微卫星分子标记对采集样本进行居群基因组遗传变异检测，同时利用改进的分子基因表 型数据处理和分析方法辅助确定真正的对照亲本，在此基础上利用参数优化的分析软件对 自然杂合子进行筛选和鉴定。
[0010] 具体地，本方法包括下列步骤：
[0011] ①采集待鉴定的自然杂合子样本和假定的对照亲本；
[0012] ②采用微卫星分子标记对所有样本进行基因组遗传分析；
[0013] ③构建所有样本的微卫星分子基因表型数据库；
[0014] ④利用分子表型数据的多元对应分析确定真正的对照亲本；
[0015] ⑤基于对照亲本鉴定自然杂合子。
[0016] 二、应用
[0017] 基于该方法的应用：针对猕猴桃主要商业利用物种中华猕猴桃复合体的两个变种 中华猕猴桃和美味猕猴桃，本实施例共鉴定出具有基因组遗传混合的自然杂合子198份， 其中76份具有三种遗传来源；针对阔叶猕猴桃和毛花猕猴桃等代表性的种间杂合子鉴定， 本实施例共鉴定到种间杂合子35份；本方法还成功应用到其他的猕猴桃种间杂合子鉴定， 涉及软枣猕猴桃、黑蕊猕猴桃、大籽猕猴桃、山梨猕猴桃、京梨猕猴桃、柱果猕猴桃、黄毛猕 猴桃等。
[0018] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0019] ①利用分子标记数据的对应分析可以克服猕猴桃野生样本采集过程中基于形态 确定对照亲本的困难；
[0020] ②使用微卫星分子标记，具有操作简便，扩增高效且对基因组DNA模板质量要求 低等特点，大大解决了猕猴桃干燥叶片基因组DNA提取质量较差不能满足其他类型分子标 记试验需求的问题；
[0021] ③本发明采用分子基因表型处理分子标记数据，可以避免具有不同基因组倍性变 异样本带来的数据分析困难；
[0022] ④本发明优化了自然杂合子探测分析软件的设置参数，减轻了遗传共祖对杂合子 鉴定带来的影响。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1为本方法流程图；
[0024] 图2为基于该方法筛选鉴定中华猕猴桃和美味猕猴桃种内变种间自然杂合子的 示意图；
[0025] 图3为基于该方法筛选鉴定阔叶猕猴桃和毛花猕猴桃种间自然杂合子的示意图。

【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图和实施例详细说明：
[0027] -、方法
[0028] 1、如图1步骤①采集待鉴定的自然杂合子样本和假定的对照亲本。根据现有的中 华称猴桃复合体物种的地理分布，两个变种中华称猴桃（A. chinensis var. chinensis，AC) 和美味称猴桃（A. chinensis var. deliciosa，AD)具有不同的地理分布区域和生态适应 性，其中中华猕猴桃变种在我国偏东南分布，主要适应中低海拔山地丘陵地带，而美味猕猴 桃变种多分布在我国中西部山地和较高海拔的生态区域。然而，在我国中西部两个变种存 在较大范围的地理重叠分布区，涉及的省份包括陕西、河南、湖北、湖南、贵州、云南、广西等 从北到南连续的区域，主要重叠分布的垂直海拔范围为800-1200m。本实施例基因组杂合 子待鉴定样本的采集源自中华称猴桃（A. chinensis var. chinensis，AC)和美味称猴桃 (A. chinensis var. deliciosa，AD)自然重叠分布区的同域混生居群。样本共米集自5个不 同地理混合分布点（陕西商南、河南西峡、湖北五峰、湖南遂宁、广西资源），总共待鉴定种 质355份。两个变种的纯合对照样本采自湖北利川（AD :50份）和广西龙胜（AC :20份）。 两个变种的形态初步判定依据猕猴桃UP0V标准的5个易观察的形态描述特征，分别为一年 枝芽眼大小、花枝被毛、成熟果实被毛、成熟果肉颜色、叶片质地。所有样本分别采集一年生 枝条上的嫩叶若干，将其迅速放置于硅胶密封袋中干燥保存。
[0029] 提取所有样本的基因组总DNA，具体步骤包括：取50-100mg硅胶干燥保存的叶片 组织样本，在液氮中充分研磨，将粉末转移至1. 5mL离心管，添加 lmLCTAB裂解试剂在65°C 水浴中充分裂解细胞核至少30分钟，然后经过氯仿分层和异丙醇沉淀以及乙醇洗涤，最后 将获取的基因组总DNA溶解于50uL的0. 1 X TE溶液中。DNA溶液通过凝胶电泳和紫外分光 光度计Nanodrop2000c (ThermoFisher scientific公司，下同）检测其质量和产量，达到SSR 试验要求（其DNA质量的纯度衡量指标A260/280的吸收峰比值在1. 5-2. 5之间均可以使 用），随即存于-20°C备用。
[0030] 2、如图1步骤②采用微卫星分子标记对所有样本进行基因组遗传分析。植物微卫 星分子标记是散布在其基因组上的简单重复序列，具有进化中性、实验操作步骤简单（仅 包括一步PCR扩增步骤）、遗传稳定等特点。本实施例所用的基因组微卫星分子标记实验方 法主要包括特异SSR引物的PCR扩增、PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分型和银染染色条 带判读三个步骤。PCR扩增所用的DNA模板浓度为50ng/ul，PCR反应总体系为10ul，其中 包括25-50ng模板DNA，0. 25uM的正向引物和0. 25uM的反向引物，0. 2mM的dNTPs，l. 5mM的 MgCl2, (λ 5单位的Taq PCR反应聚合酶以及lXTaq酶反应缓冲液（75mM Tris-HCl，pH8. 8 ; 20mM(NH4)2S04 ;0. 01% Tween20)等。所使用的微卫星引物的优化扩增条件为：95°C条件下 初始模板变性7min，然后接着33个循环，每个循环包括94°C变性30s，55°C引物结合40s， 72°C引物延伸55s，在这些循环完成后，最后为72°C延伸9min。PCR产物的分离可以在3% 的琼脂糖胶或者6 %的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，然后利用溴化乙锭或者银染染色进行 条带的判读。本实施例是利用6 %的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离PCR扩增条带并结合银染 染色。主要步骤为：配置好凝胶出％的聚丙烯酰胺，7M尿素）后在Bio-Rad凝胶电泳仪（美 国）对PCR产物进行电泳分离，点样前对PCR产物加入变性剂在95°C下变性7min，然后每个 点样孔上样3ul，电泳功率为55W，电泳缓冲液为1. 2XTBE，电泳时间为1. 5小时。电泳结束 利用银染染色DNA谱带，包括10%的冰醋酸固定液脱色5min，然后染色液（每100ml水中 溶解0· lgAgN03和150ul37%甲醛）染色30min，最后显影液（每100ml水中溶解3gNaC03， 150ul37%甲醛和20ulNa 2S203)显色5min并固定（10%的冰醋酸）。
[0031] 3、如图1步骤③构建所有样本的微卫星分子基因表型数据库。样本SSR分析指 纹条带的判读采用分子基因表型的形式进行，即只计算样本间同一水平线上扩增条带的有 (记为"1"）和无（记为"〇"），最终形成0-1矩阵数据库。具体操作方式为，针对任意单一 的引物对，将所有样本扩增的基因条带依据DNA片段大小（根据50bp Ladder确定）排序， 然后从小到大对所有不同大小的等位基因按照所分析样本扩增条带的有无进行1或0的计 数，最终形成Excel表格的数据矩阵供后续分析。
[0032] 4、如图1步骤④利用分子表型数据的多元对应分析确定真正的对照亲本。为了确 定最能代表杂交亲本遗传属性的纯合对照样本，本实施例利用多元对应分析对所采集的中 华猕猴桃和美味猕猴桃的两个假定纯合居群样本（基于UP0V形态的特征值判定）进行了 排序分析，其具体实施方法为：将湖北利川采集的美味猕猴桃和广西龙胜采集的中华猕猴 桃的SSR指纹图谱数据单独挑出，将每一个等位基因座位（大小）作为一个单独的属性变 量，针对所有样本形成数据表，利用任意方便的统计软件进行多元对应MCA分析。本实施例 采用R软件包中的ADE-4模块进行多元对应MCA分析。对排序结果进行5%的双尾置信区 间统计检验，筛选其中的90%的具有统计重要性的样本形成两个新的数据表，并作为两个 变种分别的纯合对照样本共后续基因组杂合子鉴定分析。
[0033] 5、如图1步骤⑤基于对照亲本鉴定自然杂合子。在确定中华猕猴桃和美味猕猴 桃变种的对照样本之后，利用基于贝叶斯分析方法的STRUCTURE软件确定待鉴定样本的基 因组杂合情况。其具体的实施方法为：将对照样本和待检测样本（以样本地理来源归类） 的SSR指纹数据整合成一个完整的数据表并利用R软件转换成适用于STRUCTURE软件分 析的数据输入格式（此处还可以利用其他软件转换或者直接在STRUCTURE软件中人工输 入数据），缺失的数据输入"-1"。STRUCTURE软件参数设置为：采用Admixture模型（Use Admixture Model on)，独立等位基因频率（Allele Frequencies Independent on)，其他的 使用默认值。将预评估的K值（所分析样本中潜在的不同的基因组遗传类型）设置成所分 析样本采样群体的2倍（本实施例为7X2 = 14,即从Κ = 1到14进行评估）进行最合适 的Κ值筛选，估算时贝叶斯的迭代数为1000, 000,其中初始的50, 000个迭代数据不收集。 最合适Κ值的判断根据公式Λ K = LnP⑶k-LnP⑶η进行，取最大Λ Κ对应的Κ值。本实 施例最合适为Κ = 3.
[0034] 依据Κ = 3,在STURCTURE软件中鉴定基因组杂合子样本。本实施例结果如图2 所示。根据纯和对照样本95%的纯和性确认优化的Q值（本实施例Q = 0. 2或0. 8)，即在 Q = 0. 2-0. 8的区间进行杂合子鉴定。
[0035] 二、应用
[0036] 基于该方法，本实施例筛选鉴定出中华猕猴桃和美味猕猴桃种内变种间具有基因 组遗传混合的自然杂合子198份，其中76份具有三种遗传来源（K = 3)的混合（图2);针 对阔叶猕猴桃和毛花猕猴桃等代表性的种间杂合子鉴定，本实施例共鉴定到种间杂合子35 份（图3);本方法还成功应用到其他的猕猴桃种间杂合子鉴定，涉及软枣猕猴桃、黑蕊猕猴 桃、大籽猕猴桃、山梨猕猴桃、京梨猕猴桃、柱果猕猴桃、黄毛猕猴桃等。
【权利要求】
1. 一种猕猴桃自然杂合子的鉴定方法，其特征在于： ① 采集待鉴定的自然杂合子样本和假定的对照亲本； ② 采用微卫星分子标记对所有样本进行基因组遗传分析； ③ 构建所有样本的微卫星分子基因表型数据库； ④ 利用分子表型数据的多元对应分析确定真正的对照亲本； ⑤ 基于对照亲本鉴定自然杂合子。
2. 按权利要求1所述一种猕猴桃自然杂和子的鉴定方法的应用，其特征在于： 筛选出的猕猴桃自然居群中的各类种内和种间的杂合子种质。
【文档编号】C12Q1/68GK104152561SQ201410404558
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】刘义飞, 黄宏文, 李大卫, 钟彩虹 申请人:中国科学院华南植物园