一种从绿色松针中提取红色素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从绿色松针中提取红色素的方法。该方法采用1％盐酸甲醇溶液或者1％盐酸乙醇溶液浸提绿色松针获得红棕色浸提液，然后加入碱沉淀，经离心、干燥后得到的紫红色粉末，即为松针红色素粗制品。经过试验证明，本发明提取的松针红色素是高聚合原花青素和花色素及其衍生物的混合物。本发明证明红色的高聚合原花青素和花色素是在提取过程中产生的，这使得松针红色素的产量大幅提高，同时松针红色素的大量生产为增加松针茶汤色、改善松针茶品质提供了一种可行的选择。本方法简单实用、成本低廉，适合于工业用大量生产。
【专利说明】一种从绿色松针中提取红色素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种色素提取方法，具体地说涉及一种从绿色松针中提取红色素的方法。
【背景技术】
[0002]在植物器官尤其是花瓣、果皮、嫩叶以及秋季落叶之中广泛存在着各式各样的色素，如花色素(Chalker-Scott, 2002 ；Field et al., 2001 ；Gould et al., 1995 ；Zhang andWang, 2008)。而且许多植物果实中的红色素常成为食品加工业和医药工业的原料和添加剂。相关产品中，国内曾有茶红素的发明和报道(萧伟祥等，1987，1997)。松针茶作为一种特殊的保健饮品已有商品销售，但汤色偏淡。松树的常绿针叶，尤其是生长季节内绿色的松针，红色素含量微乎其微，而无色的原花青素(儿茶素及其衍生物)含量较高。普通松科植物的原花青素具有明显的抗氧化活性和抗癌活性(黄启亮，2012;王秋月等，2009)。因此，松树原花青素的提取工艺成为人们关注的生产加工工艺之一。以往的研究表明，松树原花青素大多从松树的树皮中提取(王秋月等，2009)。相对于松针而言，松树树皮资源数量较少，尤其是从立木上扒皮较为不便。尽管有从松针中提取原花青素的报道(黄启亮，2012)，但从新鲜的绿色松针中直接提取红色素的工艺未见报道。
[0003]本发明的发明人在使用盐酸甲醇(或盐酸乙醇)浸提松针的过程中发现无色原花青素氧化聚合形成红色聚合原花青素和花色素(矢车菊素-3-0-葡萄糖苷等)，从而不断地有红色素的混合物被浸提出来。目前常用的提取原花青素的方法大多从葡萄等果实中提取，产量受季节的影响，受果实生产的大小年影响。相对于其他的器官而言，松针资源量较大，且生长季节适度采集松针对松树的生长和存活影响不大，这为大量生产松针红色素创造条件。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于寻求一种能够提高提取松针红色素效率的方法，为全天候、大批量生产松针红色素奠定基础。
[0005]本发明的技术方案是:一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是，采用1%盐酸甲醇溶液浸提绿色松针获得红棕色浸提液，然后加入碱沉淀，经离心、干燥后得到的紫红色粉末，即为松针红色素粗制品。
[0006]具体包括以下步骤:
[0007](I)采取中龄或成熟龄松树二年生以上的绿色松针，洗净后自然晾干；然后将绿色干松针切成小段后待用；
[0008](2)将绿色干松针和1%盐酸甲醇溶液加入浸提容器中，在室内自然温度下浸提16-18小时，且松针表面已经吸附大量的红色素而变成棕红色时倒出浸提液(弃用)；
[0009](3)再加入1%盐酸甲醇溶液洗脱吸附在松针表面等部位的红色色素，不断地搅动以便提高提取效率，持续浸提70-100小时，倒出红棕色浸提液待用；再加入1%盐酸甲醇溶液于浸提容器之中继续浸提70-100小时；将上述两次浸提液过滤残渣或离心除去杂质后混合待用；
[0010](4)往步骤(3)提取的红棕色提取原液中加入NaOH，调整溶液pH值至12_14，待红色色素完全转化成紫色沉淀析出后，经离心、干燥后得到的紫红色粉末，即为松针红色素粗制品。
[0011]上述提取方法中，分三次加入1%盐酸甲醇溶液，优选地，第1、2、3次加入的1%盐酸甲醇溶液与绿色干松针的质量比为12-20:12-20:12-20:1，优选配比为16:16:16:1。I %盐酸甲醇溶液的配制方法为:2.77ml的浓度为36.5%的盐酸加入甲醇定容至100ml。
[0012]上述步骤(4)中优选加入红棕色提取原液体积1/13的IM氢氧化钠，调节pH值为13。
[0013]上述步骤⑷中的离心，优选为8000转/分离心10分钟。
[0014]上述提取方法中应用1%盐酸乙醇替代1%的盐酸甲醇同样可以获得松针红色素，且用乙醇提取对人体无害，但红色素提取量稍有差异。
[0015]上述提取方法中可以应用蒸馏装置回收上述过程废弃的甲醇。
[0016]经过试验证明，本发明提取的松针红色素是高聚合原花青素和花色素及其衍生物的混合物。该混合物主要为水溶性色素，在碱性环境中呈蓝紫色，在酸性环境下呈棕红色。
[0017]应用:加入松针茶中，增加松针茶汤色，还可以用作食品或药品添加剂。
[0018]本发明通过试验研究证明，该工艺可以从绿色松针中提取出红色色素，且伴随着干燥处理程度的增加而提高红色素的提取量。本方法利用松针角质层的大分子脂肪酸酯吸附红色色素的原理，通过设计合理的提取和洗脱过程，起到了大分子吸附树脂法提纯色素的效果。方法简单、便捷、实用，且成本低廉，适合于工业用大量生产松针红色素。经分析红色素的提取率在5% -8%之间(以鲜松针计)，若选择合适的松针材料和优化的工艺提取率可提高到10% -18%。
[0019]由于松针产量大、四季常青，从松针提取红色素基本不受资源量和季节性的影响。本发明证明红色的高聚合原花青素和花色素是在提取过程中产生的，这使得松针红色素的产量大幅提高，甚至超过树皮。松针红色素的大量生产为增加松针茶汤色、改善松针茶品质提供了一种可行的选择。本方法简单实用、成本低廉，适合于工业用大量生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为用盐酸甲醇溶液浸提松针时红色素产生部位的显微观察和浸提液颜色的变化；a.盐酸甲醇浸提24小时后松针表皮角质层变化，发现有花色素苷形成；b.盐酸甲醇浸提24小时后松针内皮层中变化，发现有花色素苷的形成；c.盐酸甲醇:水(50%:50% )混合液浸提24小时后松针表皮角质层和内皮层变化，发现松针表皮角质层和内皮层无明显的花色素苷的形成；d.盐酸甲醇浸提8小时的提取液颜色，提取液为绿色；e.盐酸甲醇浸提120小时的提取液颜色，提取液为棕红色；
[0021]图2为在盐酸甲醇(100% )以及酸性甲醇-水混溶序列提取液(90%、80%、70%和50% )浸提下，浸提液在525nm波段吸光度值随浸提时间而变化的趋势；
[0022] 图3为盐酸甲醇及甲醇-水混溶提取液中红色素提取量的变化；a.在盐酸甲醇(100% )以及甲醇-水混溶序列提取液(95%、90%、85% )浸提下，在525nm波段吸光度的变化趋势。b.在盐酸甲醇(100%)以及甲醇-水混溶序列提取液(98.75%、97.5%、96.26%,95% )浸提下，在525nm波段吸光度的变化趋势；
[0023]图4为松针脱水和复水后红色素提取量的差异；a.松针干燥脱水后含水量与盐酸甲醇提取液在525nm下的OD值的相关关系；b.干燥失水的松针再度浸水后花色素苷提取液的0D525/645值比较；其中CK是正常松针作为对照，Rw是失水后再复水的针叶；
[0024]图5为黑松鲜针叶、干针叶、当年针叶、多年针叶、黑松皮和赤松皮的花色素苷提取量的对比；
[0025]图6为松针和树皮提取液和沉淀物的RGB图像分析；a.松针色素粉末复溶物(L-n)、树皮色素粉末复溶物(P-n)、松针提取液(L-o)、树皮提取液(P_o)、松针沉淀物(L-d)和树皮沉淀物(P-d)图像的G/R值；b.a所示图像的B/R值；
[0026]图7为原花青素和花色素主要成分高效液相色谱波谱图像；a.原花青素基本单元成分(儿茶素)的波谱图像；b.花色素基本单元成分(矢车菊素-3-0-葡萄糖苷)的波谱图像；
[0027]图8为本发明实施例4从绿色松针中提取红色色素的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0028]实施例1提取时间及提取液的含水量等对提取效果的影响
[0029]本发明采用1%盐酸甲醇提取黑松(Pinus thunbergii Parl.)松针红色素。研究发现，用盐酸甲醇浸提黑松松针时，开始浸提液中以绿色色素为主，几乎没有红色素提取出来(5小时以内)(图1d)。伴随着浸提时间的延长，盐酸甲醇溶液中也渐渐由兰绿色转化成黄绿色。在松针表面(图1a)和内皮层细胞(图1b)内逐渐出现红色色素，这时产生的红色素大多被吸附在角质层的大分子脂肪酸酯上面。随提取时间的继续延长，伴随着提取出来的叶绿素成分在光照下的分解(Feng et al., 2009)提取液经紫红色变成棕红色(图1e) 0正常室温环境中，完成提取需要300到400小时之间。该提取过程受环境温度影响较大，加温可以缩短提取时间并加快提取的进度。为了节约提取成本，本发明只在自然室温下进行提取。相比之下，使用50%:50%盐酸甲醇-水混合液体(Gong等2004)浸提时无明显的红色素形成(图1c)且几乎没有红色素被提取出来。
[0030]使用可见光分光光度计在525nm波段测定松针的100 %的盐酸甲醇提取液的吸光度发现，伴随着提取时间的增加相应的OD值逐渐提高，直到300多小时才逐渐稳定下来(图2-100)。在90%的酸性甲醇-水混溶体系(10%水+90%盐酸甲醇)中提取相同的松针时(图2-90)，提取液在525nm波段的光吸收值明显的低于100%盐酸甲醇纯溶液的提取液。在50%的酸性甲醇-水混溶液体(50%水+50%盐酸甲醇)中提取相同的松针时(图2-50)，提取液在525nm波段的光吸收值小到几乎难以测得出来(图2_50)。
[0031]进一步缩小甲醇-水混溶液体梯度到85%和100%之间(图3a)，到95%和100%之间(图3b)，甚至到99%到100%之间，随含水量的增加红色色素生成量减少的趋势依然存在。因此，用盐酸甲醇提取松针红色素受提取液的含水量的影响。而且，采用盐酸甲醇提取松针红色素需要有一个持续浸泡使松针氧化聚合且转换无色原花青素成红色素的过程。
[0032]实施例2松针含水率对提取效果的影响
[0033]松针含水率对提取效果的影响见图4和图5，图4的数据表明，脱水处理的针叶红色素提取量明显增加，且在松针含水率与提取液的红色素吸光度值之间存在明显的线性相关关系(图4a)。干燥处理的松针再复水处理后，与未进行干燥处理的对照松针相比，红色素提取液没有统计学意义上的差异(图4b)。
[0034]该试验说明，用盐酸甲醇提取松针红色素的过程是一个逐渐氧化聚合的过程，干燥处理松针有利于提高松针红色素的提取量。另外，除了干燥脱水可提高松针红色素提取量以外，多年生松针比当年新生松针的红色素产出量高(图5)。松针红色素的提取量甚至高于树皮(图5)，尤其是干燥后的针叶。从干燥的绿色松针提取的红色色素量甚至高于红褐色的枯萎松针。
[0035]实施例3松针红色素成分分析
[0036]研究表明，在酸性甲醇溶液中持续浸提绿色松针产生的红色溶液经碱性沉淀后颜色变成蓝紫色(图6a-Ld，图6b-Ld)，树皮提取液的碱性沉淀物尽管也有变成淡紫色的趋势，其程度比松针要低得多(图6a-Pd，图6b-Pd)。这间接提示松针浸提过程中有花色素或花色素苷的形成。而且，在酸性环境条件下原花青素易于转化成花色素。
[0037]同时，本发明用盐酸甲醇提取松针红色素的过程是一个逐渐氧化聚合的过程，无色的低聚原花青素经氧化聚合转化为红棕色的高聚合原花青素(黄启亮，2012)。
[0038]为了进一步证明高聚合原花青素和花色素的存在进行如下的试验:取Ig黑松松针，剪切成Imm长，置入试管并加I %盐酸甲醇20ml浸提至稳定，取红色提取液分析其矢车菊素-3-0-葡萄糖苷(花色素基本单元成分)和儿茶素(原花青素基本单元成分)，经过高效液相色谱和质谱连用分析表明该提取液中既有高聚合原花青素也有花色素。其波谱图像见图7，其含量测定结果如表1。因此，证明在盐酸甲醇溶液持续的浸提过程中形成的红色色素是高聚合原花青素和花色素及其衍生物的混合物。应用适当的分离手段可以生产出具有一定活性的松针红色素。
[0039]表1浸提液中的矢车菊素-3-0-葡萄糖苷和儿茶素含量
[0040]
【权利要求】
1.一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是，采用1%盐酸甲醇溶液或者1%盐酸乙醇溶液浸提绿色松针获得红棕色浸提液，然后加入碱沉淀，经离心、干燥后得到的紫红色粉末，即为松针红色素粗制品。
2.如权利要求1所述的一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是， (1)采取中龄或成熟龄松树二年生以上的绿色松针，洗净后自然晾干；然后将绿色干松针切成小段后待用； (2)将绿色干松针和1%盐酸甲醇溶液或者1%盐酸乙醇溶液加入浸提容器中，在室内自然温度下浸提16-18小时，且松针表面已经吸附大量的红色素而变成棕红色时倒出浸提液； (3)再加入1%盐酸甲醇溶液或者1%盐酸乙醇溶液洗脱吸附在松针表面的红色色素，持续浸提70-100小时，倒出红棕色浸提液待用；再加入I %盐酸甲醇溶液或者I %盐酸乙醇溶液于浸提容器之中继续浸提70-100小时；将上述两次浸提液过滤残渣或离心除去杂质后混合待用； (4)往步骤(3)提取的红棕色提取原液中加入NaOH，调整溶液pH值至12-14，待红色色素完全转化成紫色沉淀析出后，经离心、干燥后得到的紫红色粉末，即为松针红色素粗制品O
3.如权利要求2所述的一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是，第1、2、3次加入的1%盐酸甲醇溶液或者1%盐酸乙醇溶液与绿色干松针的质量比为12-20:12-20:12-20:1。
4.如权利要求3所述的一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是，所述第1、2、3次加入的1%盐酸甲醇溶液或者1%盐酸乙醇溶液与绿色干松针的质量比为16:16:16:1。
5.如权利要求2所述的一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是，所述步骤(4)中加入红棕色提取原液体积1/13的IM氢氧化钠，调节pH值为13。
6.如权利要求2所述的一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是，所述步骤(4)中的离心为8000转/分离心10分钟。
7.如权利要求2所述的一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是，应用蒸馏装置回收浸提液中的甲醇或者乙醇。
8.如权利要求2所述的一种从绿色松针中提取红色素的方法，其特征是， (1)采取成熟龄松树二年生以上的绿色松针，洗净表面浮尘；室内自然环境条件下晾干；然后切成1_长的小段后待用； (2)将绿色干松针和其质量16倍的1%盐酸甲醇溶液于浸提容器之中，在室内自然温度下浸提16-18小时，且松针表面已经吸附大量的红色素而变成棕红色时，倒出浸提液； (3)再加入等体积的1%盐酸甲醇溶液用于洗脱吸附在松针表面的红色色素，持续浸提75小时，倒出红棕色浸提液待用；再加入等体积的I %盐酸甲醇于浸提容器中继续浸提75小时，将上述两次浸提液过滤残渣后混合； (4)按体积比13:1的比例往红棕色提取原液中加入IMNaOH，调整溶液pH值至13，半小时后待红色色素完全转化成紫色沉淀析出后以8000转/分离心10分钟,倒掉上清液,干燥后的紫红色粉末即为松针红色素粗制品； (5)应用蒸馏装置回收浸提液中的甲醇。
9.权利要求1-8中任意一项所述的方法提取的松针红色素，其特征是，其主要成分为高聚合原花 青素和花色素。
【文档编号】A23L1/275GK104177863SQ201410457871
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】王斐, 王静, 邢尚军 申请人:山东省林业科学研究院, 王斐