一种骨髓间充质干细胞及其建立方法和用途

一种骨髓间充质干细胞及其建立方法和用途
【专利摘要】本发明涉及一种骨髓间充质干细胞，该细胞携带HIV-1受体及HIV-1协同受体。当HIV-1感染该BMSCs时，HIV-1上的囊膜蛋白gpl20与HIV-1受体结合，使得HIV-1上的gp41暴露出来，暴露后的gp41与HIV-1协同受体结合而介导HIV-1进入BMSCs内，通过研究HIV-1在BMSCs内的逆转录和复制情况，研究HIV-1/AIDS的发病机制、病理特点和进行抗HIV-1的药物研究等。
【专利说明】一种骨髓间充质干细胞及其建立方法和用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞及其建立方法和用 途。

【背景技术】
[0002] 人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，以下简称HIV)，是一种感染 人类免疫系统细胞的慢病毒，它会破坏人体的免疫能力，使免疫系统失去抵抗力，从而导致 各种疾病在人体内生存，并最终导致艾滋病。目前尚无有效疗法治疗该致命性的传染病。
[0003] HIV分为1型和2型，1型是目前全球流行的主要毒株，用HIV-I表示。对于HIV-I 的感染研究，有动物模型和细胞模型两种。动物模型主要有非人灵长类动物模型、嵌合体鼠 感染HIV动物模型等；细胞模型主要是一些⑶4阳性细胞，如T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、 树突状细胞等。这些细胞表面带有⑶4分子，是HIV-I受体，HIV-I的囊膜蛋白gpl20能 与这些⑶4分子结合，使得包膜蛋白gp41暴露出来。暴露后的gp41与细胞上的协同受体 CXCR4或CCR5结合而介导HIV-I进入这些细胞内。通过研究HIV-I在宿主细胞内的逆转录 和复制情况，进而进行抗HIV-I病毒药物研究。然而，T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状 细胞等CD4阳性细胞在人体存在的数量较少，且分离困难。
[0004] 现有技术中一般通过在细胞表面加载⑶4分子及协同受体CXCR4或CCR5分子来 建立HIV-I感染的细胞模型。如，TZM-bl细胞系，是基于人宫颈癌HeLa细胞，通过植入⑶4 和CCR5基因，使细胞膜表面高强度的表达⑶4和CCR5分子，改造成的TZM-bl细胞对不同 群簇的HIV-I具有高度易感染性；GM95细胞系，是基于鼠黑色素瘤细胞，应用逆转录病毒整 合⑶4、CXCR4和CCR5基因后进行转录，使其细胞膜上表达⑶4、CXCR4和CCR5分子，从而应 用于HIV-I的感染研究。然而，TZM-bl与GM95细胞均为肿瘤细胞，一些肿瘤细胞中许多不 明确的特性会影响抗HIV-I药物研究的结果；另外，GM95细胞中CD4、CXCR4和CCR5分子的 表达欠稳定，亦可造成HIV-I感染的不稳定性。
[0005] 骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)，是一类未分化的细 胞或原始祖细胞，其最显著的特征是具有慢周期性和自我更新能力，在合适的条件下可以 分化为机体内的许多不同细胞。如分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、成纤维 细胞及肝细胞等间叶细胞和其他胚层细胞，具有极大的可塑性；同时，容易获得，体外扩增 10倍以上而不丢失其多向分化潜能；此外，外源基因易于植入，并稳定表达而不影响其干 细胞特性，植入反应较弱等，是一类理想的HIV-I感染模型。
[0006] 然而，BMSCs若作为HIV-I感染的细胞，其细胞膜上缺乏HIV-I感染所需的受体分 子和HIV-I协同受体分子。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于提供一种容易获得、植入反应弱且能稳定表达HIV-I受体及 HIV-I协同受体的BMSCs及其构建方法和用途。
[0008] 本发明提供了一种骨髓间充质干细胞，所述细胞携带HIV-I受体及HIV-I协同受 体。
[0009] 优选地，所述HIV-I受体为⑶4分子；所述HIV-I协同受体为CCR5分子；所述⑶4 分子由位于所述骨髓间充质干细胞内且核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的⑶4基因表达， 所述CCR5分子由位于所述骨髓间充质干细胞内且核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的CCR5 基因表达。
[0010] 本发明还提出一种构建如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞的方法，其包括以 下步骤：
[0011] S10,将含Hiv-I受体基因和Hiv-I协同受体基因的第一外源基因片段导入慢病毒 表达载体中，形成重组病毒质粒，所述重组病毒质粒与包装质粒一起在慢病毒包装细胞中 进行包装，产生假性病毒；
[0012] S20,从骨髓中分离骨髓间充质干细胞；
[0013] S30,用步骤SlO产生的假性病毒感染经步骤S20分离出的骨髓间充质干细胞；
[0014] S40,对感染后的骨髓间充质干细胞内HIV-I受体基因及HIV-I协同受体基因进行 检测与鉴定。
[0015] 优选地，步骤SlO还设置对照组，所述对照组是将第二外源基因导入慢病毒表达 载体中形成空载重组病毒质粒，且所述第二外源基因含绿色荧光蛋白基因，不含HIV-I受 体基因和HIV-I协同受体基因；所述空载重组病毒质粒与包装质粒一起在慢病毒包装细胞 中进行包装产生空载病毒，并在步骤S30及S40中与所述假性病毒进行实验对照。
[0016] 优选地，步骤SlO中所述第二外源基因片段为CMV-GFP-Pgk-Puro,其中GFP为绿色 荧光蛋白基因，CMV为启动GFP基因表达的启动子；Puro为抗性基因，Pgk为启动Puro抗性 基因表达的启动子。
[0017] 优选地，步骤SlO中所述HIV-I受体基因为⑶4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示；所述HIV-I协同受体基因为CCR5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述第一 外源基因片段为CMV-CD4-IRES-CCR5-Pgk-Puro,其中，CMV为启动CD4基因表达的启动子； IRES序列用以连接CD4和CCR5基因，并启动CCR5基因的表达；Puro为抗性基因，Pgk为启 动Puro抗性基因表达的启动子；所述慢病毒表达载体为PLV. ExBi. P质粒，所述包装质粒为 pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5,所述慢病毒包装细胞为 293FT 细胞。
[0018] 优选地，所述步骤SlO还包括对所述假性病毒进行滴度测定、PCR检测及预转染， 以确保所述假性病毒能够进行感染，并能在宿主细胞中进行转录；所述步骤S20还包括应 用抗体孵育对分离的骨髓间充质干细胞进行鉴定。
[0019] 优选地，所述步骤S40进行检测与鉴定的具体方法为：提取感染后的骨髓间充质 干细胞内的总RNA，分别进行凝胶电泳和实时定量PCR检测，以确认假性病毒携带的CD4基 因和CCR5基因已经整合入骨髓间充质干细胞中，并能进行转录；提取感染后的骨髓间充质 干细胞内的总蛋白质进行免疫印迹法检测，以确认CD4基因和CCR5基因能在骨髓间充质干 细胞中进行表达。
[0020] 优选地，所述步骤S40还包括对感染后的骨髓间充质干细胞进行免疫荧光显微镜 检测和激光共聚焦显微镜检测，观察骨髓间充质干细胞上⑶4和CCR5分子的表达情况，确 认⑶4基因和CCR5基因已经整合入骨髓间充质干细胞中，并能进行表达。
[0021] 本发明还提出一种上述骨髓间充质干细胞的用途，其可应用于HIV-ι病毒研究领 域。
[0022] 当HIV-I感染上述BMSCs时，HIV-I上的囊膜蛋白gpl20与上述HIV-I受体分子 结合，使得HIV-I上的gp41暴露出来，暴露后的gp41与上述HIV-I协同受体分子结合而介 导HIV-I进入BMSCs细胞内，因此该BMSCs细胞可用于HIV-I病毒研究领域，如HIV-1/AIDS 的发病机制、病理特点、抗HIV-I的药物研究等等。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图 1 为重组病毒质粒 PLA. ExBi. P/pur〇-CMV-CD4-IRES-CCR5 示意图；
[0024] 图 2-1 为第一外源基因片段 CMV-CD4-IRES-CCR5-Pgk-Puro 示意图；
[0025] 图2-2为第二外源基因片段CMV-GFP-Pgk-Puro示意图；
[0026] 图3为假性病毒中⑶4基因和CCR5基因凝胶电泳结果；
[0027] 图4为⑶4基因和CCR5基因在293T细胞中实时定量荧光PCR结果，其中N-T为 空载病毒对照组，T为假性病毒组；
[0028] 图5-1至图5-7为hBMSCs表型的细胞流式分析结果。其中图5-1、5-2、5-3、5-4、 5-5、5-6、5-7分别为0)29、0)44、0)73、0)166、0)14、0)34、0)45的流式分析结果；
[0029] 图6为不同感染复数（简称Μ0Ι)时，hBMSCs的感染效率；
[0030] 图7为感染假性病毒后的hBMSCs中⑶4基因和CCR5基因的凝胶电泳结果，其中 N-T为空载对照组；
[0031] 图8为感染假性病毒后hBMSCs中⑶4和CCR5的RNA实时荧光定量结果，其中N-T 为空载对照组；
[0032] 图9为感染假性病毒后hBMSCs中⑶4蛋白和CCR5蛋白免疫印迹结果。其中N-T 为空载对照组；
[0033] 图10-1至图10-8为感染假性病毒后hBMSCs中⑶4和CCR5蛋白的免疫荧光和激 光共聚焦结果。图10-1、图10-2为空白对照组（即正常hBMSCs)细胞形态的显微结果；图 10-3、图10-4为hBMSCs感染空载病毒后的荧光结果；图10-5、图10-6为hBMSCs感染假性 病毒后CD4分子的共聚焦结果；图10-7、图10-8为hBMSCs感染假性病毒后CCR5分子的共 聚焦结果。

【具体实施方式】
[0034] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。
[0035] 本发明提供了一种骨髓间充质干细胞，该细胞携带HIV-I受体及HIV-I协同受体。
[0036] 优选地，上述HIV-I受体为CD4分子，上述HIV-I协同受体为CCR5分子；所述CD4 分子由位于上述骨髓间充质干细胞内且核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的⑶4基因表达， 所述CCR5分子由位于上述骨髓间充质干细胞内且核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的CCR5 基因表达。
[0037] 当HIV-I感染上述BMSCs时，HIV-I上的囊膜蛋白gpl20与上述HIV-I受体分子 结合，使得HIV-I上的包膜蛋白gp41暴露出来，暴露后的gp41与上述HIV-I协同受体分子 结合而介导HIV-I进入BMSCs细胞内，通过研究HIV-I在BMSCs内的逆转录和复制情况，研 究HIV-1/AIDS的发病机制、病理特点和进行抗HIV-I的药物研究等，因此该BMSCs细胞可 用于HIV-I病毒研究领域。
[0038] 本发明还提出一种构建上述BMSCs的方法，其包括如下步骤：
[0039] S10,将含HIV-I受体基因和HIV-I协同受体基因的第一外源基因片段导入慢病毒 表达载体中，形成重组病毒质粒，所述重组病毒质粒与包装质粒一起在慢病毒包装细胞中 进行包装，产生假性病毒。
[0040] 具体地，本实施例中，所述HIV-I受体基因为⑶4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述HIV-I协同受体基因为CCR5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所 述第一外源基因片段为CMV-CD4-IRES-CCR5-Pgk-Puro,所述慢病毒表达载体为PLV. ExBi. P质粒。该载体采用双顺反子表达模式，启动子为CMV，其启动⑶4基因的表达；IRES序列 用以连接⑶4和CCR5基因，并启动CCR5基因的表达；Puro为抗性基因，Pgk为启动该抗性 基因表达的启动子；所述包装质粒为 pLV/helper_SL3、pLV/helper_SL4、pLV/helper_SL5 ; 所述慢病毒包装细胞为293FT细胞。
[0041] 优选地，步骤SlO还设置对照组，所述对照组是将第二外源基因导入上述慢病毒 表达载体中形成空载重组病毒质粒，且所述第二外源基因含绿色荧光蛋白基因（以下简称 GFP基因），不含HIV-I受体基因和HIV-I协同受体基因；所述空载重组病毒质粒与包装质 粒一起在慢病毒包装细胞中进行包装产生空载病毒，并在步骤S30及S40中与所述假性病 毒进行实验对照。优选地，第二外源基因片段为CMV-GFP-Pgk-Puro,其中，GFP为绿色荧光 蛋白基因，CMV为启动GFP基因表达的启动子；Puro为抗性基因，Pgk为启动Puro抗性基因 表达的启动子。
[0042] 优选地，为了了解假性病毒的感染力，步骤SlO还包括对病毒液进行滴度测定。首 先，准备好宿主细胞，接种于细胞培养板中；然后，取上述步骤产生的病毒液接种到宿主细 胞内进行转染；接着，去除培养液，加入含有G418完全培养液以筛选稳定转导的细胞。最 后，根据荧光图片中GFP表达情况，通过带有荧光的细胞数除以病毒原液量，以获得病毒的 滴度。
[0043] 优选地，为了确保产生的假性病毒携带⑶4基因和CCR5基因，且具有感染性，步骤 SlO还包括对所述假性病毒进行PCR检测及预转染。所述PCR检测是提取假性病毒的总RNA 进行PCR扩增，进行凝胶电泳；所述预转染，是用产生的假性病毒去感染宿主细胞，如293T 细胞等，然后对感染后的宿主细胞提取其总RNA，进行PCR扩增，应用实时荧光定量PCR检 测，观察假性病毒是否能感染宿主细胞，并在宿主细胞内进行转录。
[0044] S20,从骨髓中分离骨髓间充质干细胞。
[0045] 具体地，本实施中，抽取人骨髓液，去掉经自然沉淀的血凝块、骨组织、肌肉组织、 筋膜组织等，经密度梯度离心，弃上清液，收集离心管中沉淀的人骨髓间充质干细胞。
[0046] 优选地，对分离出的细胞进行 anti-humanCD29、anti-human CD73、anti-human CD166、anti_humanCD44、anti-human CD14、anti-human CD45 和 anti-human CD34 的抗体 孵育，并用抗体上链接的FITC进行流式细胞分析检测，选出对于⑶29、⑶73、⑶44、⑶166呈 阳性表达且对⑶14、⑶34、⑶45呈阴性表达的细胞即为所需的hBMSCs细胞。
[0047] S30,用经步骤SlO处理的假性病毒感染经步骤S20鉴定的骨髓间充质干细胞。
[0048] S40,对感染后的骨髓间充质干细胞内HIV-I受体基因及HIV-I协同受体基因进行 检测与鉴定。
[0049] 具体地，提取感染后的BMSCs的总RNA，进行凝胶电泳检测，确保假性病毒携带的 ⑶4和CCR5基因已经整合入BMSCs中；提取感染后的BMSCs的总RNA，进行荧光定量PCR检 测，确保CD4基因和CCR5基因能在BMSCs中进行转录；提取感染后的BMSCs的总蛋白质，进 行免疫印迹法检测，确保⑶4基因和CCR5基因能在BMSCs中进行表达。
[0050] 优选地，对感染假性病毒后的BMSCs，还可以进行免疫荧光显微镜检测和激光共聚 焦显微镜检测，从而更直观观察到BMSCs细胞膜上有⑶4和CCR5分子的表达。
[0051] 进一步地，以本实施例为例，步骤SlO包括顺次进行的以下几步（试验中的质粒和 引物购自上海生工生物工程有限公司）：
[0052] S11，扩增 attBl-CD4_attB2。
[0053] 采用重叠 PCR 法。反应体系为 5XPrimer STAR?Buffer (Mg2+Plus) 10 μ 1，dNTP Mixture (10 μ mol) 4 μ 1，引物-F(10 μ mol) 1 μ 1，引物-R(10 μ mol) 1 μ 1，模板 DNAl μ 1， Primer STARTM HS DNA Polymerase 0.5 μ 1，补加 ddH20至总体积 50 μ 1。扩增程序为 98°C， 3min ;接着 98°C，10s、60°C，10s、72°C，60s，共 30 个循环；然后 72°C，5min ;最后 6 X loading buffer终止反应。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。DNA琼脂糖凝胶电泳回收采用QIAquick 琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒，一 20°C冰箱保存。
[0054] S12，构建 pDown_CD4。
[0055] 利用 Gateway 技术。25 °C，BP 反应 3h(反应体系为 attBrQM-attBJOOng， pDonr221100ng，BP clonase 1μ1，ΤΕ buffer up to 5μ1),加入蛋白酶 K 终止反应 (10min，37°C);转化BP反应产物到大肠杆菌Stbl3,菌落PCR筛选阳性克隆（PCR反应体 系，灭菌水 16.1yl，10XTaq Buffer with(NH4)2S043 yl，dNTP Mixture(10ymol)3yl， MgCl22 μ 1，弓I 物 _F(10 μ mol) 1.2 μ 1，弓I 物-R(IOymol) 1.2 μ 1，Taq DNA polymerase I. 5 μ 1，模板 DNA 2 μ 1，总体积 30 μ 1。扩增程序为 94°C，3min ;接着 94°C，30s、60°C，30s、 72°C，Imin (2kb/min)，共29个循环；然后72°C，lmin。）挑取阳性克隆质粒，送交阳性克隆 测序。
[0056] S13,构建 pUP-CMV。
[0057] 利用 Gateway 技术。25 °C，BP 反应 3h (反应体系为 attBfCMV-attBJOOng， pDonrP4Plr lOOng，BP clonase Ιμ?，TE buffer up to 5μ1)，加入蛋白酶 K 终止反应 (10min，37°C);转化BP反应产物到大肠杆菌Stbl3,菌落PCR筛选阳性克隆（PCR反应体 系，灭菌水 16.1yl，10XTaq Buffer with(NH4)2S043 yl，dNTP Mixture(10ymol)3yl， MgCl22 μ 1，弓I 物 _F(10 μ mol) 1.2 μ 1，弓I 物-R(IOymol) 1.2 μ 1，Taq DNA polymerase I. 5 μ 1，模板 DNA 2 μ 1，总体积 30 μ 1。扩增程序为 94°C，3min ;接着 94°C，30s、60°C，30s、 72°C，Imin (2kb/min)，共29个循环；然后72°C，lmin。）挑取阳性克隆质粒，送交阳性克隆 测序。
[0058] S14,构建 pTail-IRES/CCR5。
[0059] 利用 Gateway clone。25°C，BP 反应3h (反应体系为 attBflRES/CCRS-attBJOOng， pDonrP2rP3100ng，BP clonase 1μ1，ΤΕ buffer up to 5μ1)，加入蛋白酶 K 终止反应 (10min，37°C);转化BP反应产物到大肠杆菌Stbl3,菌落PCR筛选阳性克隆（PCR反应体 系，灭菌水 16.1yl，10XTaq Buffer with(NH4)2S043 yl，dNTP Mixture(10ymol)3yl， MgCl22 μ 1，弓I 物 _F(10 μ mol) 1.2 μ 1，弓I 物-R(IOymol) 1.2 μ 1，Taq DNA polymerase 1.5以1，模板0嫩2以1，总体积3(^1。扩增程序为941：，31^11;接着941：，3〇8、6〇1：，3〇8、 72°C，lmin(2kb/min)，共29个循环；然后72°C，lmin。）挑取阳性克隆质粒，送交阳性克隆 测序。
[0060] S15,构建重组病毒质粒 PLA. ExBi. P/pur〇-CMV-CD4-IRES-CCR5 (如图 1 所示）。
[0061] 利用Gateway技术。小量提取质粒pDown-CD4和骨架载体，25°C，LR反应3h， 反应体系为 pUP-CMV 12. 89ng，pDown-CD410. 42ng，pTail-IRES/CCR513. 03ng，骨架载体 60.28ng，LR clonaselyl，TE buffer up to 5μ1。加入蛋白酶 K 终止反应 lOmin。转化 LR反应产物到Stbl3,菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆质粒，送交阳性克隆测序。
[0062] S16,在293FT细胞中进行慢病毒包装，产生假性病毒。
[0063] 取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个IOcm的培 养皿5X IO6个细胞数接种于培养皿中，37°C，5% C02的培养箱中培养过夜；第二天转染前 去除旧的培养液，加入5mL新鲜的含10%血清DMEM培养液。
[0064] 准备1支5ml离心管，先加入I. 5ml无血清〇pti-MEM?I培养基，再加入pLV/ helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、PLA. ExBi. P/pur〇-CMV-CD4-IRES-CCR5 各 4 μ g，轻轻颠倒混勻。另取I支5ml离心管，加入I. 5ml无血清Opti-MEM?I_培养液和 40μ 1的Lipofectamine2000,轻轻颠倒混勻。室温孵育5min。将已稀释的DNA加入到含有 Lipofectamine 2000的无血清Opti-MEM?I培养液中，轻轻颠倒混勻。室温孵育20min， 制备获得 DNA-Lipofectamine 2000 复合物。
[0065] 将DNA-Lipofectamine 2000复合物一滴一滴添加到293FT细胞中，轻轻摇晃混匀 后放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱中过夜培养。
[0066] 转染后24h更换IOmL新鲜的含10%血清DMEM培养液；转染后48h，收集培养上清 液进行浓缩；换IOml新鲜的培养液继续培养，转染后72h再次收集上清液浓缩。浓缩方法 为3000r/min低速离心15min，上清用0. 45 μ 1滤器进行过滤，以彻底去除细胞碎片；每个 离心管装20ml滤液，50000 X g高速离心90min沉淀病毒颗粒，弃去上清；每管沉淀用200ul 培养液重悬病毒沉淀，分装进2个0. 5ml进口 AXYGEN管中，每管IOOul。分装好的病毒放 置-80°C保存。
[0067] 实施例（以人的骨髓间充质干细胞为例，以下简称hBMSCs):
[0068] S10,
[0069] 首先，使用Gateway技术，将第一外源基因片段CMV-CD4-IRES-CCR5-Pgk_Puro (图 2-1所示）导入慢病毒表达载体PLV. ExBi. P中，形成重组病毒质粒PLA. ExBi. P/ pur〇-CMV-CD4-IRES-CCR5,如图 1 所示。构建的重组病毒质粒和 pLV/helper-SL3、pLV/ helper-SL4、pLV/helper-SL5包装质粒一起在293FT细胞中进行包装，产生假性病毒。
[0070] 同时，设置第二外源基因片段为CMV-GFP-Pgk-Puro (图2-2所示）的空载重组病 毒质粒，与上述包装质粒一起在293FT细胞中产生空载病毒颗粒，在后续试验中与假性病 毒进行对照。
[0071] 然后，对产生的病毒液进行滴度测定。首先，准备好宿主细胞，接种于6孔细胞培 养板中；然后，吸取上述病毒液10 μ 1，连续作10倍梯度稀释，从1〇_4稀释至1〇_8,每种浓度 梯度各100 μ 1，分别添加完全培养液至Iml ;往上述完全培养液中加入聚凝胺（工作浓度是 6ug/ml，Iml稀释病毒液中加入Iul聚凝胺），以促进病毒感染细胞，轻轻吹打充分混匀；接 着，去除6孔板培养细胞的培养液，分别往各孔中加入ImL不同稀释浓度下的病毒培养液进 行转染，保留一孔不添加病毒培养液，作为空白对照组，将该培养板置于37°C、5% C02饱和 湿度条件下培养；转染24h后，去除含有病毒的培养液，加入2ml新鲜的完全培养液，进行培 养；加入含有G418(400ug/ml)完全培养液以筛选稳定转导的细胞；本实验中，在10_ 8稀释 病毒原液的孔中观察到4个带有荧光的细胞，该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病 毒原液量，说明该病毒滴度为4/(IX KT8) = 4X 108TU/ml。
[0072] 接着，提取假性病毒中的总RNA进行PCR扩增，其中引物为
[0073] CD4 (up-stream: 5，-TGCCTCAGTATGCTGGCTCT-3，；
[0074] downstream:5'-GAGACCTTTGCCTCCTTGTTC-3'）；
[0075] CCR5 (up-stream: 5，-GCTGGTCATCCTCATCCTGATAA-3，；
[0076] downstream:5,-ATGGCCAGGTTGAGCAGGTA-3,）；
[0077] 以及 GAPDH(up-stream: 5' -TTCACCACCATGGAGAAGGC-3'，
[0078] downstream:5, -GGCATGGACTGTGGTCATGA-3,）作为对照；
[0079] 然后，进行凝胶电泳。结果如图3所示。结果可见特异性的193bp的⑶4和75bp 的CCR5基因片断。证实，产生的假性病毒携带有⑶4基因和CCR5基因。
[0080] 最后，应用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于二氧化碳培养箱（37°C、5% C02) 培养293T细胞；当细胞融合率约为50%左右，加入假性病毒，并传代培养；7d后，收集感染 后的细胞，提取总RNA，利用上一步的引物进行PCR扩增，应用实时定量荧光PCR检测，结果 如图4所示。证实，产生的假性病毒能感染293T细胞，并能在细胞内进行转录。
[0081] S20,
[0082] 首先，无菌条件下抽取健康人骨髓液2ml，DMED培养液等倍稀释混匀，600r/min离 心lOmin，弃上层的上清液与脂肪；DMED培养液等倍稀释，沿管壁缓慢加入到含Ficoll淋巴 分离液（密度在I. 075-1. 079之间）的试管中，2500r/min离心30min，离心后液体分为3 层，吸取呈白色云雾状狭窄带的中间层，移入离心管中；加入PBS液2ml，重悬细胞，1200r/ min离心lOmin，弃上清液，重复2次，收集离心管中沉淀物，即为hBMSCs。
[0083] 分离hBMSCs，置于10%胎牛血清的DMEM培养基中，并将培养基置于二氧化碳培养 箱（37°C、5% CO2)进行细胞培养。
[0084] 然后将培养的细胞进行 anti_humanCD29、anti-human CD73、anti_humanCD166、 anti-humanCD44、anti_human CD14、anti_human CD45 和 anti_humanCD34 的抗体孵育，并用 抗体上链接的FITC进行流式细胞分析检测，结果如图5-1至图5-7所示。结果可见，分离 出的hBMSCs上有⑶29、⑶73、⑶44、⑶166的阳性表达以及⑶14、⑶34、⑶45的阴性表达， 符合hBMSCs的基本特征。
[0085] S30,
[0086] 首先，将hBMSCs进行传代培养至细胞融合率为50 %左右，细胞约5X IO5Cells/ 孔；
[0087] 其次，分别加入80 μ 1/孔的假性病毒液和空载病毒液至准备好的培养基（聚凝胺 浓度为8ug/ml);
[0088] 接着，应用空载病毒进行预实验，确定最佳感染复数（简称Μ0Ι)。结果如图6所 示。可见最佳MOI为50 ;在该MOI下，将hBMSCs分成三组。一组加入含假性病毒的培养液 2ml，一组加入含空载病毒的培养液2ml，一组加入不含病毒的培养液2ml作为空白对照。混 匀后置于二氧化碳培养箱（37°C、5 % CO2)孵育；
[0089] 最后，孵育24小时后，换用完全培养基培养感染后的细胞，隔一天换一次培养液， 直至细胞长满、传代。
[0090] S40,
[0091] 经步骤S30处理的hBMSCs培养10-14d。
[0092] 首先，用Primer 5. 0软件进行引物设计：
[0093] hCD4 上游引物为：5' -TGCCTCAGTATGCTGGCTCT-3'
[0094] 下游引物为：5 ' - GAGACCTTTGCCTCCTTGTTC-3 '
[0095] hCCR5 上游引物：5，-GCTGGTCATCCTCATCCTGATAA-3 '
[0096] 下游引物：5，-ATGGCCAGGTTGAGCAGGTA-3 '
[0097] 然后，提取感染后的细胞总RNA，分别进行凝胶电泳检测和实时荧光定量PCR检 测。
[0098] 凝胶电泳结果如图7所示，结果中可见特异性的193bp的⑶4基因和75bp的CCR 基因片断，而空载对照组为阴性。证实，假性病毒携带的⑶4和CCR5基因已经整合入BMSCs 中。
[0099] 实时荧光定量PCR检测结果如图8所示。结果中可见⑶4和CCR5基因的RNA转 录阳性结果，而空载对照组⑶4和CCR5基因的RNA转录接近于0。证实假性病毒中的⑶4 和CCR5基因能在hBMSCs细胞中转录。
[0100] 接着，提取感染后的hBMSCs的总蛋白，进行免疫印迹法检测：配置10%的聚丙烯 凝胶、上样、跑电泳、转膜、染膜、裁膜、脱脂牛奶封闭lh、4°C一抗孵育过夜、用TBST洗涤一 抗20minX5次、二抗孵育lh、用TBST洗涤二抗5minX5,发光成像。结果如图9所示。结 果中显示，经假性病毒感染后的hBMSCs中，可见55KD的⑶4蛋白和40. 6KD的CCR5电泳印 迹阳性带，N-T空载对照组及空白对照组显示为阴性。
[0101] 最后，对步骤S30处理后的三组hBMSCs进行爬片培养，融合至95 % -100 %时分 别进行免疫荧光显微镜检测和激光共聚焦显微镜检测。步骤如下：首先，PBS洗2次，每次 5min，以清除细胞培养液；接着用4%的多聚甲醛室温固定20-30min ;接着，PBS洗3次，每 次5min ;接着用4% BSA室温封闭30min ;然后按说明书上的比例稀释一抗后，4°C孵育过夜 (16h);接着PBS洗3次，每次IOmin ;再按说明书上的比例稀释二抗后，避光孵育Ih ;再用 PBS洗3次，每次5min ;然后lug/ml DAPI避光染核5min ;然后PBS洗3次，每次5min ;最 后置于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察。结果如图10-1至图10-8所示。
[0102] 图10-1、图10-2为空白对照组（即正常hBMSCs)细胞形态的显微结果；图10-3、 图10-4为hBMSCs感染空载病毒后的荧光结果，表明空载病毒可以感染hBMSCs ;图10-5、图 10-6为hBMSCs感染假性病毒后CD4分子的共聚焦结果，在细胞核与细胞膜上可见CD4分子 的表达；图10-7、图10-8为hBMSCs感染假性病毒后CCR5分子的共聚焦结果，在细胞核与 细胞膜上可见CCR5分子的表达。
[0103] 结果证实，hBMSCs经假性病毒感染后，细胞膜上产生⑶4和CCR5分子的表达，具 备HIV-I病毒感染的受体，从而制备了一种HIV-I感染的细胞模型。
[0104]

【权利要求】
1. 一种骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述细胞携带HIV-ι受体及HIV-I协同受体。
2. 如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述HIV-I受体为CD4分子； 所述HIV-I协同受体为CCR5分子；所述CD4分子由位于所述骨髓间充质干细胞内且核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示的CD4基因表达，所述CCR5分子由位于所述骨髓间充质干细胞内 且核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的CCR5基因表达。
3. -种构建如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞的方法，其包括以下步骤： S10,将含HIV-I受体基因和HIV-I协同受体基因的第一外源基因片段导入慢病毒表达 载体中，形成重组病毒质粒，所述重组病毒质粒与包装质粒一起在慢病毒包装细胞中进行 包装，产生假性病毒； S20,从骨髓中分离骨髓间充质干细胞； S30,用步骤SlO产生的假性病毒感染经步骤S20分离出的骨髓间充质干细胞； S40,对感染后的骨髓间充质干细胞内HIV-I受体基因及HIV-I协同受体基因进行检测 与鉴定。
4. 如权利要求3所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤SlO还设置 对照组，所述对照组是将第二外源基因导入慢病毒表达载体中形成空载重组病毒质粒，且 所述第二外源基因含绿色荧光蛋白基因，不含HIV-I受体基因和HIV-I协同受体基因；所述 空载重组病毒质粒与包装质粒一起在慢病毒包装细胞中进行包装产生空载病毒，并在步骤 S30及S40中与所述假性病毒进行实验对照。
5. 如权利要求4所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤SlO中所述第 二外源基因片段为CMV-GFP-Pgk-Puro，其中GFP为绿色荧光蛋白基因，CMV为启动GFP基因 表达的启动子；Puro为抗性基因，Pgk为启动Puro抗性基因表达的启动子。
6. 如权利要求3所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤SlO中 所述HIV-I受体基因为⑶4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述HIV-I协同 受体基因为CCR5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述第一外源基因片段为 CMV-CD4-IRES-CCR5-Pgk-Puro,其中，CMV为启动CD4基因表达的启动子；IRES序列用以 连接CD4和CCR5基因，并启动CCR5基因的表达；Puro为抗性基因，Pgk为启动Puro抗 性基因表达的启动子；所述慢病毒表达载体为PLV. ExBi. P质粒，所述包装质粒为pLV/ helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5,所述慢病毒包装细胞为 293FT 细胞。
7. 如权利要求6所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤SlO还包 括对所述假性病毒进行滴度测定、PCR检测及预转染，以确保所述假性病毒能够进行感染， 并能在宿主细胞中进行转录；所述步骤S20还包括应用抗体孵育对分离的骨髓间充质干细 胞进行鉴定。
8. 如权利要求6所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S40进行 检测与鉴定的具体方法为：提取感染后的骨髓间充质干细胞内的总RNA，分别进行凝胶电 泳和实时定量PCR检测，以确认假性病毒携带的⑶4基因和CCR5基因已经整合入骨髓间充 质干细胞中，并能进行转录；提取感染后的骨髓间充质干细胞内的总蛋白质进行免疫印迹 法检测，以确认CD4基因和CCR5基因能在骨髓间充质干细胞中进行表达。
9. 如权利要求8所述的构建骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S40还包 括对感染后的骨髓间充质干细胞进行免疫荧光显微镜检测和激光共聚焦显微镜检测，观察 骨髓间充质干细胞上⑶4和CCR5分子的表达情况，确认⑶4基因和CCR5基因已经整合入 骨髓间充质干细胞中，并能进行表达。
10. -种如权利要求1或2所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述骨髓间充质干 细胞应用于HIV-I病毒研究领域。
【文档编号】C12N15/867GK104212766SQ201410457504
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】曾常春, 聂广, 诸葛福艳, 李丽君 申请人:桂林医学院