一种检测阿尔茨海默病易感性的试剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测阿尔茨海默病易感性的试剂，属于医学生物【技术领域】。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的AR基因rs139374285 T>C位点的基因型，预测受试者对阿尔茨海默病的易感性。本发明的优点是：首次阐明了AR基因多态性位点与AD的相关性，提供了一种预测AD易感性的方法，该方法可用于AD的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
【专利说明】一种检测阿尔茨海默病易感性的试剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测阿尔茨海默病易感性的试剂，更具体的说是通过测定受试者 的AR基因 rsl39374285T>C位点的基因型，预测受试者对阿尔茨海默病的易感性；该方法可 用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimer，s disease，AD)是1906年德国医生阿尔茨海默首次 提出的表现为认知和记忆功能不断恶化的慢性神经退行性疾病，是老年人常见的神经系统 变性病。据估计，2011年全球痴呆患病率高达2400万，预计到2040年，每20年加倍，而且 随着人口老龄化的进展，其发病率呈上升趋势。据2011年世界卫生组织估计，全球AD患者 的相关费用占60岁以上人口疾病总支出的11.2%。2005年的统计资料显示我国60岁以 上人口有1. 2亿，痴呆患病率为3-8%，其中60%以上为AD，随着人口老龄化的进一步加剧， 50年后AD人数将达到2000万。我国是人口大国，目前尚无 AD的卫生经济学统计数字，由 AD所造成的经济损失不可低估。流行病学调查显示阿尔茨海默病具有较高的致残率和死亡 率，主要原因在于阿尔茨海默病属于不可逆性疾病，患者就诊时，往往属于病程"中晚期"， 已失去最佳治疗时机，此时对患者实施干预措施收效甚微。并且阿尔茨海默病病理性质比 较复杂，目前尚缺乏特异、可靠、高效的实验诊断方法，能够在患者出现痴呆症状前做出准 确的判断并进行治疗。随着分子生物学技术的进步和AD遗传学研究上的新发现，遗传因素 在AD发生、发展中的作用逐步受到重视。在阿尔茨海默病的诊断标准进行修订时，将遗传 学证据和生物标志物纳入AD的诊断标准。
[0003] 目前进行AD遗传病因研究，多采用SNP作为基因组标志的关联分析方法，是有效 的，已得到证明。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在 人群中的频率需>1 %，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70. 1 %为同型碱基之 间的转换：如G/A或T/C，29. 1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶）是人类基因 组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧 啶），SNP包含了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。
[0004] 由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。 SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个（Brookes AJ，The essence of SNPs. Gene, 1999 ;234:177-186.)。SNP以其密度高（平均每Ikb就有1个）、代表性强 (位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平）、遗传稳定性好（同微卫星多 态性比较而言）、易于自动化分析（因 SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以"+/ - 或1/0"直接分型）等特点成为很好的遗传标志。
[0005] 目前已明确四种基因的突变或多态性与AD有关。这些AD相关基因包括：第21号 染色体上的淀粉样前体蛋白（APP)基因，第14号染色体上的早老素（PSl)基因，第1号染 色体上的早老素（PS2)基因和第19号染色体上的载脂蛋白E(ApoE)基因。
[0006] AR (Androgen Receptor,雄激素受体）基因被定位于X染色体（XqlL 2-12)，包含 8个外显子和7个内含子，全长约90kb，编码918个氨基酸。该基因由4个结构域组成：低 保守的氨基端结构域，高保守的DNA结合结构域，铰链区以及高保守的羧基端配体结合结 构域。该基因的突变与完整的雄激素不敏感性有关，介导核受体和转录雄激素受体核信号。
[0007] 目前尚无任何关于AR基因与AD相关联的研究结果。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的是提供一种预测阿尔茨海默病易感性的方法。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种预测阿尔茨海默病易感性的试剂，包括PCR引物 和含有该引物的试剂盒。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] -种分离核酸序列，具有序列表SEQ ID No. 1所不的碱基序列，其rsl39374285T>C 即是变异位点，以字母" Y"标示出。该核酸序列为AR基因第4内含子序列的一部分。图1 为AR基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有7个内含子，rsl39374285T>C 位点标在AR基因图中第4内含子区的相应位置。
[0012] 一种预测阿尔茨海默病易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试 者的AR基因 rsl39374285T>C多态性位点的基因型，预测受试者对阿尔茨海默病的易感性： AR基因 rsl39374285T>C的基因型为TT时，受试者的易感性最低；携带C等位基因时，受试 者的易感性升高。
[0013] 一组检测阿尔茨海默病易感性的引物，引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示，长度分别为24bp和18bp，而且可以特异性地扩增出包含 有SEQ ID No. 1所示序列中rsl39374285T>C位置的产物。
[0014] 本发明提供了一种检测阿尔茨海默病易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异 性扩增AR基因 rsl39374285T>C位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、 试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组 分、含量、来源和使用方法如下：
[0015] 一种检测阿尔茨海默病易感基因的试剂盒，由以下试剂组成：
[0016] (1) 10 μ L 10XPCR 缓冲液；
[0017] (2) 2 μ L IOmMdNTP 混合液；
[0018] (3)2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ;
[0019] (4) 1 μ L Fl引物，为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/μ L ;
[0020] (5) 1 μ L Rl引物，为SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/μ L ;
[0021] (6) 8 μ L 10 X LC-Green Plus 饱和荧光染料；
[0022] (7)2μ L寡核苷酸内参，由4种内参引物各0. 5μ L组成，浓度为lOpmol/μ L，其中 低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游 引物R为SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO. 6 所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；
[0023] (8) 64 μ L 纯水。
[0024] 使用方法：
[0025] (I)PCR扩增：通过PCR扩增AR基因的第4内含子区部分片段，制备混合液： 10 X PCR 反应缓冲液 1 μ L，10mM/LdNTP0· 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 2 μ L，10pM/L 上游引物 0· lyL，10pM/L下游引物0· lyL，10XLC-Green Plus饱和荧光染料0.8yL，寡核苷酸内参 0. 2 μ L(高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0. 05 μ L)(序列见表1)，基因组DNAl μ L，加 纯水至1(^1^。？〇?反应条件为951：预变性31^11，951：变性308,561：退火308,721：延伸 4s，总共45个循环，72°C总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处 理：95°C 30s，25°C 2min，94°C 30s，24°C 4min。PCR 前于每一体系中加入 20μ L 的石蜡油， 以防止液体挥发。
[0026] (2)基因型判定：将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light Scanner TMHR-I96 上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据烙解曲线 的差异判定基因型。
[0027] AR基因 rsl39374285T>C多态性位点在制备诊断阿尔茨海默病的试剂中的用途。
[0028] AR基因 rsl39374285T>C多态性位点在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
[0029] 本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如：体液（血 液、腹水及尿液等）、组织细胞（如肝组织）等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组 DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含AR基 因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含AR基因变异点的DNA片 段获得的样品，特别适于用作测定材料。
[0030] 在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据AR基因的突变类型存在的 辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定AR基因突 变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩 增步骤的引物。
[0031] 本发明的优点是：本发明首次阐明了 AR基因多态性位点与AD的相关性，提供了一 种预测AD易感性的方法，该方法可用于AD的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
[0032] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步叙述，以便公众对
【发明内容】
有更 深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换， 均属于本发明的保护范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为AR基因结构及其多态性变异位点的示意图
[0034] 图2为AR基因变异位点经HRM方法的基因分型图
[0035] 图3为AR基因变异位点的测序图
【具体实施方式】
[0036] 用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下：
[0037] 10XPCR 缓冲液：IOmM Tris-HCI(pH = 8. 3)，500mM 氯化钾（KCl)，IOmM 氯化镁 (MgCl2)，0· 01% (W/V)白明胶
[0038] dNTP :脱氧核苷三磷酸
[0039] EDTA :乙二胺四乙酸二钠
[0040] TE : IOmM Tris-HCl (pH = 7. 5)，ImM EDTA (pH = 8. 0)
[0041] 实施例I :血液样本收集和基因组DNA的提取：
[0042] - .病例入选：
[0043] (1)按精神障碍诊断统计手册第三版修订版（DSM-III-R)标准，和美国神经病学、 语言障碍和卒中、老年性痴呆和相关疾病学会（NINCDS-ADRDA)标准入选病例，共选取来自 卫生部北京医院和北京301医院神经内科所收集的AD患者249例（年龄：53-97岁，平均 77岁）和健康体检对照438例（年龄：50-88岁，平均70岁）。所有受检者均为汉族且签 署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员 会的认可，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》：人体医学研究的伦理原则。
[0044] 二·根据下列方法，制备人基因组DNA。
[0045] 1.在已标号的I. 5mLEP管中加 ΙΟΟΟμ L红细胞裂解液，后加入400μ LEDTA抗凝血 (抗凝血加入前颠倒混匀3-5次），颠倒混匀，室温静置10分钟；
[0046] 2. 13000rpm离心30秒后，除去上清液；
[0047] 3.在所得沉淀中加480 μ L核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20 μ L蛋白酶 Κ(用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶Κ)，颠倒混匀，65°C孵箱10分钟，（期间不时上下混匀， 确保无凝块）；
[0048] 4.拿出后降至室温，加300μ L蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm 离心2分钟；
[0049] 5.将上清液移至新EP管中，加入670 μ L预冷的异丙醇，充分颠倒混匀（10次以 上），可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；
[0050] 6.弃上清液并确保沉淀留在EP管中，加入670yL70%乙醇，上下颠倒混匀， 13000rpm离心2分钟；
[0051] 7.弃上清，使管内乙醇挥发干净；
[0052] 8.加入TE溶液（400 μ L)，充分溶解，对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分 析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/ μ L，置于4°C备用，剩余基因组DNA 置-20°C冰箱保存。
[0053] 实施例2 : SNP的识别鉴定
[0054] 本发明采用PCR-高分辨率熔解曲线（HRM)分析法和PCR测序技术同时对AR基因 的第4内含子区的rsl39374285T>C的基因型进行检测。图2为AR基因变异位点经HRM方 法的基因分型图、图3为AR基因变异位点的测序图。
[0055] 一 · PCR-HRM引物的确定
[0056] 从Genebank 中查取 AR基因 rsl39374285T>C 附近的 DNA碱基序列（SEQ ID No. 1)， 引物设计在01ig〇7. 0软件下完成。目的片段定位在AR基因第4内含子区，全长48bp，确定 了正义链Fl与反义链R1，特异性引物序列如下：
[0057] Fl :5' -TAGTGGATAGTCTGGAGAAACCTG-3'（SEQ ID No. 2)
[0058] Rl :5, -CCTAAGCTCCTAAGCCTC-3'（SEQ ID No. 3)
[0059] 二· PCR反应体系及反应条件
[0060] 通过PCR扩增AR基因第4内含子区部分片段，PCR反应体系为：10 XPCR反应缓冲 液 1 μ L，10mM/LdNTP0· 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 2 μ L，10pM/L 上游引物 0· 1 μ L，10pM/L 下游 引物0. I μ L，IOXLC-Green Plus饱和荧光染料0. 8 μ L，寡核苷酸内参0. 2 μ L(高、低温寡 核苷酸内参上、下游引物各0.05 μ L)(序列见表I)，基因组DNAl μ L，加去离子水至10 μ L。 PCR时于每一体系中加入20 μ L石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95°C预变性3min， 95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸4s，总共45个循环，72°C总延伸2min。在进行高分 辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95°C 30s，25°C 2min，94°C 30s，24°C 4min。
[0061] 表I :高、低温寡核苷酸内参引物序列、退火温度及产物片段长度
[0062]
【权利要求】
1. 一种检测阿尔茨海默病易感性的方法，其特征在于：通过提取宿主细胞的基因组 DNA，测定受试者的AR基因rsl39374285T>C多态性位点的基因型，预测受试者对阿尔茨海 默病的易感性。
2. 根据权利要求1所述的一种检测阿尔茨海默病易感性的方法，其特征在于：AR基因 rsl39374285T>C的基因型为TT时，受试者的易感性最低；携带C等位基因时，受试者的易 感性升高。
3. -组检测阿尔茨海默病易感性的引物，其特征在于：引物的核苷酸序列分别为序列 表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。
4. 一种检测阿尔茨海默病易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成： (1) IOii LlO XPCR 缓冲液； (2) 2 ii LlOmMdNTP 混合液； (3) 2 ii L TaqDNA 聚合酶，2unit/ ii L ; (4) I y L Fl引物，为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/ii L ; (5) I ii L Rl引物，为SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/ii L ; (6) 8 ii LlO X LC-Green Plus 饱和荧光染料； (7) 2 ii L寡核苷酸内参，由4种内参引物各0. 5 ii L组成，浓度为lOpmol/ ii L，其中低温 寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R 为SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO. 6所示的 核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； (8) 64 ii L 纯水。 5. AR基因rsl39374285T>C多态性位点在制备诊断阿尔茨海默病的试剂中的用途。 6. AR基因rsl39374285T>C多态性位点在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
【文档编号】C12N15/11GK104313144SQ201410549742
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】朱小泉, 王娜娜, 惠娟, 赵承孝, 刘铭, 王建业, 史晓红, 魏东, 杨帆, 张耀光, 梁思颖, 唐雷, 孙亮, 杨泽 申请人:卫生部北京医院