一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂的生产技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu干粉活菌制剂的制备方法，适用于功能性益生乳酸菌发酵剂、食用或饲用微生态制剂的生产。本发明利用筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu CGMCC No.7029，经活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩、加入冻干保护剂、预冻和冷冻干燥等工序制备活菌制剂。本发明使用油菜籽蛋白胨全部替代了改良MRS培养基中的氮源，降低了生产成本，并通过优化生产发酵条件和冻干保护剂配方，使KL1-Liu菌株的活菌数量可达1010CFU/g以上，存活率达到85％以上。本发明制备的活菌制剂，价格低廉，活菌含量高，为优质的具有降血清胆固醇作用的益生活菌制剂/发酵剂。CGMCC No.70292012.12.25
【专利说明】-种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂的生产技术
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌化I-Liu干粉活菌制剂的生产技术， 适用于功能性益生乳酸菌发酵剂、食用或饲用微生态制剂、功能性食品、功能性发酵食品的 生产。
【背景技术】
[0002] 本发明涉及的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl-Liu是从藏灵茹中 分离筛选得到的一种产胆盐水解酶并具有降低血清胆固醇作用的乳酸菌。
[0003] "藏灵茹"（Tibetan Ke化，TK)又称开菲尔粒，19世纪被人类发现。开菲尔粒起源 于俄罗斯北高加索地区，当地牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳酒， 其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵，经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状物 体，即为开菲尔粒。此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中，使之发酵成具有爽快酸味和 起泡性的保健饮料，即为开菲尔。开菲尔具有多种保健功效。开菲尔中的活菌对志贺氏菌、 沙口氏菌等病原菌的生长有强烈抑制作用；其中的酵母菌对结核杆菌、大肠杆菌有较强抗 菌活性。故开菲尔对肠道疾病、肺结核有很好疗效。此外，开菲尔中的乳酸菌产生的代谢产 物，如胆盐水解酶、胞外多糖等能有效预防高血脂症和肿瘤的发生。
[0004] 在藏灵茹的黏多糖基质中微生物菌相主要W乳酸菌、酵母菌及少量醋酸菌为基础 的小生态系。本发明所用副干酪乳杆菌化I-Liu是从藏灵茹中分离筛选得到的一种益生乳 酸菌，可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实 验证明具有降低机体血清总胆固醇含量的功效。其降低胆固醇机理是缘于副干酪乳杆菌 KLl-Liu代谢产生的胆盐水解酶炬ile Salt Hy化olase，BSH)。B甜是肠道中的双歧杆菌 属、乳杆菌属、乳球菌属中的多种乳酸细菌在生长过程中产生的代谢产物。大量实验证明， 胆盐水解酶能在肝肠循环中将结合胆盐分解，产生氨基酸与溶解度较低的游离胆盐。后者 能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。
[0005] 早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血 清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理的研究尚存在不 同观点，主要集中于W下H点；（1)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；（2)乳酸菌的胆 盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作 用；（3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。
[0006] 目前，国内申请各种活菌制剂制备方法的专利较多，如江苏省微生物研究所有限 责任公司唐宝英和朱晓慧申请的"酪酸菌活菌制剂及其制备方法"(CN101032527)是由酪酸 菌制备的人兽两用活菌制剂；上海信谊药业有限公司陈彬华和姚义强申请的"双歧H联活 菌制剂及制备方法"(CN98110623. 4)是由两歧双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌冷冻干 燥活菌粉；上海环伟生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的"一种复合微生物活菌制剂及 其制备方法和应用"狂L200810034746)是球菌、酵母菌和芽抱杆菌分别液体扩大培养，然后 按所需比例混合，经固态发酵、干燥、粉碎制得的一种复合微生物活菌制剂。但关于利用分 离筛选自藏灵茹中的产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌KLl-LiU制备活菌制剂，利用自动发酵 罐高密度发酵，W及利用油菜巧蛋白腺完全替代改良MRS培养基中氮源的方法尚未见国内 外相关文献报道和专利报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌化I-Liu干粉活菌制剂的 生产技术。
[0008] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0009] 所述方法中，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl-Liu分离筛选自 吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵茹（又称开菲尔粒），并已于2012年12月25日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中也，其保藏号为；CGMCC No. 7029(菌株 KLl-Liu),保藏地址；北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。在含有碳酸巧和纳 他霉素的MRS选择性培养基上，畐Ij干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl-Liu菌株 的菌落大小2?3mm，菌落有较高黏性，表面粗趟如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白 色，半透明；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，G+无芽抱杆菌。
[0010] 所述方法中，将脱脂乳试管保种的副干酪乳杆菌化I-Liu菌株W改良MRS培养基 于37C培养16h，如此活化2?3代后，冷藏备用。
[0011] 所述方法中，改良MRS培养配方组成：将MRS培养基中的IOg蛋白腺W 5g乳酪蛋 白水解物和5g膜蛋白腺替代，其他成分不变，调节抑为6. 5。
[0012] 所述方法中，采用单因素试验优化改良MRS培养基，优化的501油菜巧蛋白腺改良 MRS培养基配方组成；葡萄糖20g、501油菜巧蛋白腺25g、巧樣酸二馈2g、磯酸氨二钟2g、己 酸轴5g、走水合硫酸镇0. 58g、四水合硫酸猛0. 25g、吐温-80 1血、蒸觸水1 000血，调节抑 为7. 0 (灭菌后抑降至6. 5)。
[0013] 所述方法中，在上述试验的基础上，将活化好的菌液W 3% (V/V，体积分数）的接 种量移种至501油菜巧蛋白腺改良MRS培养基中，于37C培养16h，得到扩大培养液。
[0014] 所述方法中，在上述试验结果基础上，采用四因素H水平正交试验优化小试发酵 条件。将化501油菜巧蛋白腺改良MRS培养基加入到化全自动发酵罐中，利用发酵罐灭 菌系统于115°C灭菌20min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将副干酪乳 杆菌化I-Liu菌株的扩大培养液按4% (V/V，体积分数）的接种量移种至发酵罐中，利用发 酵罐自动控温系统维持发酵温度为34C，发酵过程中W流加10 % (W/V，质量体积比浓度） 的灭菌化2〇)3溶液控制发酵液抑6. 5,揽拌转速为90r/min，发酵16h，得到发酵液。
[0015] 上述方法中，化发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为 BI0F6005GBN。
[0016] 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用立式高速冷冻离也机将化发酵液于 4°C条件下,400化/min离也20min，弃上清液，收集得到菌泥。
[0017] 所述方法中，立式高速冷冻离也机由湘仪离也机仪器有限公司提供，型号为 化-21M。
[0018] 所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥平均加入2只盛有100血的冻 干保护剂（14.5%麦芽糊精巧.5%脱脂奶粉）的冻干瓶中，混合均匀后，得到浓缩活菌制 剂。
[0019] 上述方法中，采用单因素多水平试验，确定副干酪乳杆菌化I-Liu的冻干保护剂 较优组合配方为（W/V，质量体积比浓度）：14.5%麦芽糊精巧.5%脱脂奶粉（伊利牌高蛋 白局巧脱脂奶粉）。
[0020] 所述方法中，将浓缩活菌制剂于-3(TC低温冰箱中预冻1化至完全冻结状态，得到 预冻活菌制剂。
[0021] 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用化LABC0NC0真空冷冻干燥机（美国） 将预冻活菌制剂于冻干温度-55C、真空度0. 13mBar的条件下，冻干4她至完全干燥状态， 得到冻干活菌制剂。
[0022] 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用5化发酵罐进行中试发酵试验，将 25L 501油菜巧蛋白腺改良MRS培养基加入到5化全自动发酵罐中，采用发酵罐灭菌系统 于115C灭菌20min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将副干酪乳杆菌 KLl-Liu菌株的扩大培养液按4% (V/V，体积分数）的接种量移种至发酵罐中，利用发酵罐 自动控温系统维持发酵温度为34C，发酵过程中W流加20 % (W/V，质量体积比浓度）的灭 菌化2〇)3溶液控制发酵液抑6. 5,揽拌转速为14化/min,发酵16h，得到发酵液。
[0023] 上述方法中，5化发酵罐由上海国强生化工程装备有限公司提供，型号为 BIOTECH。
[0024] 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用高速管式离也机将2化发酵液于3? 6°C条件下，16000r/min离也10?20min,收集得到菌泥。
[00巧]上述方法中，管式离也机由上海市离也机械研究所有限公司提供，型号为GQ105G。
[0026] 所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥加入2500mL的冻干保护剂 (14. 5%麦芽糊精巧.5%脱脂奶粉）的冻干机中，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂。
[0027] 所述方法中，利用四环真空冷冻干燥机将浓缩活菌制剂于-55C预冻1化至完全 冻结状态，得到预冻活菌制剂。
[0028] 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用四环真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂 于冻干温度-66C、真空度0. OSmBar的条件下，冻干7化至完全干燥状态，得到冻干活菌制 剂。
[0029] 上述方法中，四环真空冷冻干燥机由四环科学仪器厂有限公司提供，型号为 LGJ-25C。
[0030] 所述方法中，采用小试和中试发酵生产技术和冻干工艺所得到的产胆盐水解酶副 干酪乳杆菌化I-Liu活菌制剂的活菌数量均可达到1(TC即/g W上，菌种存活率可达85% W上。此种活菌制剂由于培养基采用油菜巧蛋白腺完全替代了改良MRS培养基中的氮源， 使产品生产成本降低，活菌含量较高。
[0031] 上述方法得到的501油菜巧蛋白腺改良MRS培养基配方和产胆盐水解酶副干酪乳 杆菌化I-Liu活菌制剂的小试与中试发酵生产技术及冻干工艺，W及专用生产菌株属于本 发明保护范围。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。
[0033] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。
[00巧]实施例1、产胆盐水解酶副干酪乳杆菌化I-Liu活菌制剂的小试生产技术
[0036] 1、菌种的活化和扩大培养
[0037] 将MRS试管保种的副干酪乳杆菌化I-Liu菌株W改良MRS培养基于37C培养16h， 如此活化2?3代，冷藏备用；将活化好的菌液W 3%的接种量移种至501油菜巧蛋白腺改 良MRS培养基中，于37C培养16h，得到扩大培养液。
[0038] 2、发酵培养基的确定
[0039] (1)不同质量品质的油菜巧蛋白腺替代改良MRS部分氮源试验
[0040] 分别用501油菜巧蛋白腺、502油菜巧蛋白腺和503油菜巧蛋白腺代替改良MRS培 养基中的膜蛋白腺，将活化好的菌种按4%的接种量分别移种至上述培养基中，于34C发 酵1化后，采用MRS培养基W倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量，每个稀释度设3次 重复，确定较优油菜巧蛋白腺氮源替代品，结果见表1。
[0041] (2)油菜巧蛋白腺替代改良MRS不同氮源试验
[0042] 在上述试验较优的油菜巧蛋白腺替代改良MRS培养基中膜蛋白腺的基础上，再分 别替代牛肉膏、酵母浸粉、牛肉膏+酵母浸粉，W上述同样条件发酵、计数，分析比较用较优 油菜巧蛋白腺分别替代改良MRS中不同氮源时的发酵液的活菌数量，结果见表2。
[0043] (3)不同用量的油菜巧蛋白腺替代改良MRS全部氮源试验
[0044] 在上述试验结果基础上，W 1.5 %、2 %、2. 5 %、3 %、3. 5 %的较优油菜巧蛋白腺分 别替代改良MRS全部氮源，W上述同样条件发酵、计数，通过比较不同用量较优油菜巧蛋白 腺替代改良MRS中全部氮源时发酵液的活菌数量，确定较优油菜巧蛋白腺的用量，结果见 表3。
[0045] 表1不同油菜巧蛋白腺替代改良MRS部分氮源发酵培养基对副干酪乳杆菌 KLl-Liu活菌数量的影响
[0046]
【权利要求】
1. 副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu CGMCC No. 7029。
2. -种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu CGMCC No. 7029菌株小试生产干粉活菌制剂的方法，其特征在于：将副干酪乳杆菌KLl-Liu 以改良MRS培养基于37°C培养16h，如此活化2?3代；将活化好的菌液以3%的接种量 移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37°C培养16h，得到扩大培养液；501油菜 籽蛋白胨改良MRS培养基配方组成：葡萄糖20g、501油菜籽蛋白胨25g、柠檬酸二铵2g、磷 酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0. 58g、四水合硫酸锰0. 25g、吐温-80 lmL、蒸馏水 1000mL，调节pH为7. 0 ;将上述扩大培养液按4%的接种量移种至2L 501油菜籽蛋白胨改 良MRS发酵培养基中，利用5L自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度34°C，发酵 液pH6. 5,搅拌转速90r/min，发酵时间16h，得到发酵液；将发酵液于4°C、4000r/min离心 20min，收集得到菌泥；在600mL灭菌冻干瓶中，按离心前发酵液1/10体积的量（200mL)，加 入14. 5%麦芽糊精+5. 5%脱脂奶粉的冻干保护剂与收集的菌泥，混合均匀后，得到浓缩发 酵剂；将每个冻干瓶装量为l〇〇mL的浓缩发酵剂于-30°C预冻13h至完全冻结状态，得到预 冻发酵剂；利用美国6L LABC0NC0真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于-55°C、真空度0. 13mBar 的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂。
3. -种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu CGMCC No. 7029菌株中试生产干粉活菌制剂的方法，其特征在于：将副干酪乳杆菌KLl-Liu 以改良MRS培养基于37°C培养16h，如此活化2?3代；将活化好的菌液以3%的接种量 移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37°C培养16h，得到扩大培养液；501油菜 籽蛋白胨改良MRS培养基配方组成：葡萄糖20g、501油菜籽蛋白胨25g、柠檬酸二铵2g、磷 酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0. 58g、四水合硫酸锰0. 25g、吐温-801mL、蒸馏水 1000mL，调节pH为7. 0 ;将上述扩大培养液按4%的接种量移种至25L 501油菜籽蛋白胨改 良MRS发酵培养基中，利用50L自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度34°C，发 酵液PH6. 5,搅拌转速140r/min，发酵时间16h，得到发酵液；将发酵液于3?6°C条件下， 16000r/min离心10?20min，收集得到菌泥；在冻干托盘中按离心前发酵液1/10体积的 量（2500mL)，加入14. 5%麦芽糊精+5. 5%脱脂奶粉的冻干保护剂与收集的菌泥，混合均匀 后，得到浓缩发酵剂；将浓缩发酵剂于_55°C预冻17h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂； 利用北京四环真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于-66°C、真空度0. 08mBar的条件下，冻干 72h至完全干燥状态，得到产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂。
【文档编号】C12R1/225GK104357359SQ201410642107
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】刘慧 , 张红星, 熊利霞, 谢远红, 高秀芝, 金君华 申请人:北京北农汇邦生物科技有限公司