本发明涉及一种利用利用水产蛋白固态发酵制备绿色促生长饲料添加剂的方法，属于水产品加工与利用的技术领域。
背景技术：
自20世纪50年代以来，在动物饲养和饲料中广泛使用抗生素、化学合成药物、激素、β-兴奋剂、重金属、镇静剂等促生长保健剂。抗生素等促生长保健剂在饲料中的应用历史由来已久,它创造了养殖业和饲料工业的革命,使得规模养殖在全世界范围内得到了迅速发展,动物的生产数量和饲料转化率得到大幅度提高。但是,正如所有工业文明的成果都有它的负面影响一样,长期以来使用化学促生长保健剂,导致了如下的问题：肉制品中药物残留严重，直接危害人体健康；肉制品品质下降，缺乏市场竞争力和信任感；细菌耐药性增强、耐药菌株增多，威胁人类安全；破坏生态环境等。随着饲料工业和畜牧水产业的迅猛发展，目前我国的畜产品和水产品已从短缺转变为阶段性过剩，人们更关心食品是否安全、卫生，因而绿色消费已成为今后的发展趋势，加之我国已加入ＷＴＯ，发达国家对我国出口的农产品要求越来越严格，目前药物残留问题成为我国畜产品和水产品走出国门的主要障碍之一。因此加速开发、推广和应用新型绿色饲料添加剂势在必行。
绿色饲料添加剂，最基本要求是无毒副作用、无残留，并且还要能促进动物生长。目前国际公认的促生长绿色饲料添加剂主要有以下几种：小肽、酶制剂、植物源产品及其提取物、微生态制剂、寡糖（化学益生素）和酵母类产品（天然益生元）等。
酶制剂作为一种饲料添加剂具有无残留、无污染，提高饲料的利用价值，改善动物生产性能和产品品质等作用。饲用酶制剂大致可以分为消化酶和非消化酶两类，通常在营养层面发挥作用。比如提高畜禽消化道内源酶活性，补充内源酶的不足；破坏植物细胞壁，提高饲料的利用效率；消除饲料中的抗营养因子，促进营养物质的消化吸收。目前，酶制剂已经广泛应用于饲料工业，主要有蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等酶制剂。然而，市场上现有的饲用酶制剂多不耐高温，在饲料高温造粒过程中活性损失非常大。
国内外的研究结果表明，在日粮中添加一定的小肽可以改善机体对日粮中蛋白质和氨基酸的利用率，提高动物的生长性能。近年来，小肽作为一种绿色促生长饲料添加剂在饲料工业备受关注。目前小肽的制备方法有酶解法和微生物发酵法。酶解法生产活性肽是以蛋白原料为底物,运用蛋白酶的酶解作用，生产小分子肽。酶解法易于控制，作用条件温和适合活性肽的生产。但酶解法需要大量的蛋白酶，生产成本高。因此，酶解法制备活性肽多用于食品与医药行业，低端的饲用活性肽产品很少采用酶解的方法。微生物发酵法是以大分子蛋白质为原料，接入产蛋白酶的微生物，利用微生物发酵过程产生的蛋白酶的酶解作用，生成小分子肽。发酵法把蛋白酶的发酵生产和酶解过程有机结合在一起，降低了活性肽的生成成本，更适合活性肽的生产。专利CNZL200410029787.0“一种活性肽饲料添加剂及制备方法和用途”公开了一种发酵发制备小肽饲料添加剂的方法，它是以植物蛋白和动物蛋白的一种或几种的混合物，经芽孢杆菌等发酵降解，使其水解度控制在20～35％，然后经过后处理可得到小肽饲料添加剂。
小肽作为一种新型绿色促生长饲料添加剂在饲料工业有着很好的应用前景，然而目前小肽并没有在饲料工业得到广泛的应用。无论是酶解法生产的小肽，还是发酵法生产的小肽，高昂的生产成本制约了小肽在饲料工业的广泛应用。另外，现有技术制备的小肽产品其促生长成分只有小肽一种成分，过于单一，促生长性能不够突出。因此，亟需大幅度降低小肽的生产成本，以促进小肽在饲料工业的广泛应用。
技术实现要素：
针对现有技术制备的小肽由于成本高，很难在饲料工业广泛的应用这一问题，本发明的目的是提供一种方法能够低成本地生产小肽。另外，本发明的另一目的是通过采用耐高温枯草芽孢杆菌发酵制备小肽，使得制备得到的小肽产品还富含耐高温蛋白酶等酶制剂。这不但可以进一步提高小肽产品的促生长效果，而且还能通过生产出耐高温饲用酶制剂而进一步降低其生产成本。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种利用利用水产蛋白固态发酵制备绿色促生长饲料添加剂的方法，包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用；
（2）将新鲜的水产蛋白绞碎后备用，将植物饲料蛋白粉碎后过60目筛备用；
（3）将步骤（2）制得的绞碎的水产蛋白和粉碎后过60目筛的植物饲料蛋白按质量比为0.5~1.5：1的比例混合，并加营养物和水混匀，获得最终水分含量控制在40%～80%范围内的发酵培养基；
（4）往步骤然（3）制得的发酵培养基上接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液，并混匀；
（5）原料的发酵：将步骤（4）获得的加入菌的发酵培养基按照下列方法进行发酵：发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm～8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在50℃~55℃，发酵时间为42h～48h；
（6）成品处理：发酵结束，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了一种绿色促生长饲料添加剂成品。
所述步骤（1）中所用的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2已于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60001，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
所述步骤（2）中的水产蛋白为罗非鱼下脚料、南极磷虾、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种。所述步骤（2）中的植物饲料蛋白为豆粕、花生粕、棉籽粕和菜粕中的一种或其中两种以上的混合物。
所述步骤（3）中的营养物为玉米粉、氯化钙、氯化亚铁和磷酸氢二钾所组成的混合物。所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：玉米粉0.01%～5%，氯化钙0.01%～5%，氯化亚铁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。
所述步骤（4）中枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为1%～9%。
本发明跟现有的发酵法制备小肽的技术相比，有如下优点。
（1）发酵产品可以在饲养动物体内发挥蛋白酶的功效。现有小肽的发酵制备采用的都是常温的菌种，其在发酵过程中产生的蛋白酶的活性在产品制备的干燥过程和用于饲料的高温造粒过程中会损失殆尽。因而，现有发酵技术制备的小肽产品用于饲料在动物体内并不能发挥蛋白酶的功效。而本技术采用耐高温的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）进行发酵，发酵过程产生耐高温的蛋白酶，这些耐高温蛋白酶的活性在产品制备的干燥和用于饲料的高温造粒过程中基本没有损失，因而本技术制备的饲料添加剂可在动物体内发挥蛋白酶的功效。
（2）成本低。与现有的发酵法制备小肽相比，本发明提供的技术方案中，原料不用灭菌，可降低能耗和成本。另外，本发明将小肽的发酵生产和饲用蛋白酶的发酵生产合二为一，饲用蛋白酶的生产会分摊部分生产成本，从而进一步降低小肽的生产成本。
（2）发酵效果好，小肽含量高。与现有的发酵法制备小肽相比，本发明提供的技术方案中，原料不用灭菌，从而使得水产蛋白丰富的内源酶得以保留；另外，内源酶的最适酶解温度和微生物发酵温度一致。因此，在内源酶和发酵所产酶的协同作用下，制备得到的小肽含量会更高；在加上高温会提高酶的活性，会进一步提高小肽含量。
（4）可有效保护水产蛋白中热敏性的功能因子。本发明的技术方案中，由于原料可以不经灭菌，因而，水产蛋白中热敏性的功能因子的活性得以有效保留。例如，虾头和南极磷虾中的虾青素。
本发明提供了一种利用利用水产蛋白固态发酵制备绿色促生长饲料添加剂的方法。本发明得到的绿色促生长饲料添加剂富含小肽、耐高温蛋白酶和益生菌。本发明制备的绿色促生长饲料添加剂在华南地区的猪、鸡、对虾的养殖试验表明，其有良好的促生长性能，有良好的应用前景和社会意义。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面就水产蛋白与植物饲料蛋白的种类、发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用。将新鲜的南极磷虾绞碎后备用；将豆粕粉碎后过60目筛备用。将100公斤绞碎的南极磷虾和100公斤粉碎并过60目筛的豆粕混合，并加入5公斤玉米粉、590克氯化钙、600克氯化亚铁、700克磷酸氢二钾和10公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；往混匀的发酵培中养加入8公斤枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液，搅拌并混合均匀；接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为8厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为50℃，发酵时间为48h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种绿色促生长饲料添加成品。
实施例2：将斜面保藏的产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用。将新鲜的虾头绞碎后备用；将豆粕粉碎后过60目筛备用。将100公斤绞碎的虾头和100公斤粉碎并过60目筛的豆粕混合，并加入5公斤玉米粉、750克氯化钙、780克氯化亚铁、700克磷酸氢二钾和8公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养加入9公斤枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液，搅拌并混合均匀；接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为4厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为55℃，发酵时间为45h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种绿色促生长饲料添加成品。
实施例3：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液备用。将新鲜的罗非鱼下脚料绞碎后备用；将花生粕粉碎后过60目筛备用。将130公斤绞碎的罗非鱼下脚料和100公斤粉碎并过60目筛的花生粕混合，并加入7公斤玉米粉、520克氯化钙、550克氯化亚铁、600克磷酸氢二钾和2公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养加入8公斤枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-2种子液，搅拌并混合均匀；接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为5厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为53℃，发酵时间为43h；发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种绿色促生长饲料添加成品。