一种小规模木霉菌固态发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固态发酵方法。
【背景技术】
[0002]木霉(Trichoderma)属于半知菌亚门，丝孢目，木霉属真菌。兼具“木霉生物菌肥”，“木霉生物农药”，“木霉植物生长调节剂”三大特性。世界各国纷纷将木霉菌应用在农业生产中。木霉菌生长迅速，产孢需要大量的氧气和营养。小规模发酵，条件控制不好，常常导致发酵失败。一是产孢量达不到需要，二是发酵后期自溶现象经常发生，这些严重影响了后期田间试验菌肥效果的发挥。
【发明内容】
[0003]本发明目的是为了解决现有小规模发酵木霉菌存在产孢量少，发酵后期出现自溶现象的问题，而提供了一种小规模木霉菌固态发酵方法。
[0004]一种小规模木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行:
[0005]—、制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养4?6天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的木霉分生孢子，制备成浓度为10s?10 个孢子/mL的菌液；
[0006]二、按重量百分比称取80%的稻壳、18%的麦麸、1 %的玉米面和1%的黄显粉，加入自来水至湿度为180%，搅匀后装入聚丙烯灭菌袋，然后于121°C灭菌2.5h，获得灭菌后的发酵料；
[0007]三、无菌托盘中装入150?160g灭菌后的发酵料，加入lmL步骤一中的菌液并拌匀，然后用保鲜膜封口，室温，自然光下培养至木霉菌菌丝体布满发酵料，然后用镊子在保鲜膜表面扎孔，托盘的4个角，每个角扎两个孔，待发酵料上布满木霉分生孢子后，将孔扩大2倍，继续发酵至孢子全部散出，即完成小规模木霉菌固态发酵。
[0008]本发明中小规模木霉菌固态发酵方法，无需严格控制生产条件，操作简单，且无需大型设备，无需设立单独的生产空间，适合于在实验室进行小规模生产；同时木霉菌产孢量少，发酵周期短，仅用10天左右即可完成，并且发酵后期不会出现自溶现象。
[0009]本发明中小规模木霉菌固态发酵方法，采用的发酵料配比合理，营养均衡，能够满足多数木霉菌的大量生长繁殖，且成本低。采用托盘装料后发酵，累叠摆放高至屋顶，充分利用室内空间，占地面积小，通风良好，托盘可反复使用，且不用购买培养架，节约成本。
【附图说明】
[0010]图1为实施例中托盘采用长、宽的朝向互换上下累叠摆放的图；
[0011]图2为实施例中发酵10天后孢子全部散出的图。
【具体实施方式】
[0012]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0013]【具体实施方式】一:本实施方式小规模木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行:
[0014]一、制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养4?6天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的木霉分生孢子，制备成浓度为10s?10 个孢子/mL的菌液；
[0015]二、按重量百分比称取80%的稻壳、18%的麦麸、1%的玉米面和1%的黄豆粉，加入自来水至湿度为180%，搅匀后装入聚丙烯灭菌袋，然后于121°C灭菌2.5h，获得灭菌后的发酵料；
[0016]三、无菌托盘中装入150?160g灭菌后的发酵料，加入lmL步骤一中的菌液并拌匀，然后用保鲜膜封口，室温，自然光下培养至木霉菌菌丝体布满发酵料，然后用镊子在保鲜膜表面扎孔，托盘的4个角，每个角扎两个孔，待发酵料上布满木霉分生孢子后，将孔扩大2倍，继续发酵至孢子全部散出，即完成小规模木霉菌固态发酵。
[0017]本实施方式步骤二中发酵料装入聚丙烯灭菌袋，装料要紧实，保证放入高压锅时，能直立，灭菌袋与灭菌袋之间形成缝隙，保证在高压锅中的高压热空气能够均匀分布，灭菌均匀彻底。
[0018]本实施方式步骤二中配制好的发酵料必须马上灭菌，避免杂菌生长，使发酵料的营养改变；灭菌后的发酵料在1?2天之内务必接菌，放置时间长，易污染。
[0019]本实施方式步骤二中灭菌后的发酵料若散发臭味或酸味，则是受到细菌或酵母菌污染，灭菌失败。
[0020]本实施方式步骤三中无菌托盘:托盘用洗洁精刷洗一遍，流水彻底冲洗，托盘倒扣摞在一起，避免室内杂菌落入，污染托盘，同时，托盘壁上的水珠容易流出，很快晾干。
[0021]本实施方式步骤三中的操作环境要求清洁，彻底擦净操作台，并将室内地面拖擦干净；戴上无菌一次性PE手套，将菌液与发酵料拌匀。
[0022]本实施方式步骤三中无菌托盘中装入150?160g灭菌后的发酵料，原因是发酵料太薄容易失水变干，太厚菌丝体长满之后透气性差，不容易产孢。
[0023]本实施方式步骤三中保鲜膜封口后，可以标记接菌时间及菌种的编号，便于后期观察。
[0024]本实施方式步骤三中接菌后的托盘采用长、宽的朝向互换上下累叠摆放。
[0025]本实施方式步骤三中扎孔目的是保证快速产孢需要的氧气，促使分生孢子迅速萌发，扎孔后即保证木霉生长环境的透气性，又不会产生杂菌污染；孔扩大目的是使发酵产物尽快干燥，避免自溶现象发生。
[0026]本实施方式步骤三中完成小规模木霉菌固态发酵的发酵周期:春夏8?10天，秋冬为11?13天；发酵完成后利用血球计数板测定孢子产量约16亿个活孢子/克发酵产物；无杂菌污染。
[0027]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，步骤一中PDA斜面培养基的配制:200g马铃薯、20g葡萄糖、15g琼脂和1000mL水，装入聚丙烯大试管中，每管20mL，115°C灭菌30min后摆斜面。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0028]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是，步骤一中木霉菌为棘抱木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536、加纳木霉(Trichoderma ghanense)ACCC30153、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC30588、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30371、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC31959、绿木霉(Trichoderma virens)ACCC32490 或棘抱木霉(Trichoderma asperellum)CFCC88162。其它步骤及参数与【具体实施方式】一或二相同。
[0029]本实施方式中棘抱木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536,购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；加纳木霉(Trichoderma ghanense)ACCC30153，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC30588，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；哈茨木霉(Trichoderma harzianum) ACCC30371，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC31959，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；绿木霉(Trichoderma virens) ACCC32490，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；棘抱木霉(Trichoderma asperellum)CFCC88162，购买自中国林业微生物菌种保藏管理中心。
[0030]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是，步骤一中聚丙烯大试管的规格:3cm 口径X24cm长。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至三之一相同。
[0031]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是，步骤一中制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养5天。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0032]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一不同的是，步骤一中制备成浓度为109个孢子/mL的菌液。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至五之一相同。
[0033]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是，步骤二中聚丙烯灭菌袋的规格:15CmX40Cm。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至六之一相同。
[0034]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一至七之一不同的是，步骤三中无菌托盘中装入155g灭菌后的发酵料。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至七之一相同。
[0035]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】一至八之一不同的是，步骤三中托盘的规格:口部外径:长X宽X高=42cmX29.5cmX6.5cm，底部内径:长*宽=36cmX23.5cm ;托盘的材质:厚度为1.5mm的透明亚克力。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至八之一相同。
[0036]采用以下实施例验证本发明的有益效果:
[0037]实施例:
[0038]小规模木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行:
[0039]—、制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养5天，然后用灭菌水