一种利用复合酶水解瓜尔豆胶制备可溶性膳食纤维及甘露寡糖的方法与流程

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种利用复合酶水解瓜尔豆胶制备可溶性膳食纤维及甘露寡糖的方法。
背景技术：
：半乳甘露聚糖一般由β-1,4-糖苷键链接形成的甘露聚糖主链和由α-1,6-糖苷键形成的半乳糖残基侧链，广泛存在于多种植物细胞壁及胚乳中(Thombareetal.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2016,88:361-372)。瓜尔豆胶是一种来源于瓜尔豆(Cyamopsistetragonolobus)的天然植物胶，具有高粘度、水溶性好、耐酸碱、耐高温等多种优良特性，被广泛应用于多种行业中，其主要成分是半乳甘露聚糖(Thombareetal.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2016,88:361-372)。不同来源的半乳甘露聚糖中，甘露糖残基和半乳糖残基的比例通常不同，瓜尔豆胶来源的半乳甘露聚糖半乳糖侧链含量丰富，明显高于槐豆胶来源的半乳甘露聚糖，而且这些侧链往往排列集中且有序(Malgasetal.EnzymeandMicrobialTechnology,2015,70:1-8；McCleary.CarbohydrateRresearch,1985,139:237–260)。正是由于这种复杂的多分枝结构，完全降解瓜尔豆胶中半乳甘露聚糖需要多种糖苷水解酶的共同作用，如β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)和α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)等(Moreiraetal.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2008,79:165-178)。其中最重要的是β-甘露聚糖酶，其能够特异性随机水解半乳甘露聚糖主链中的β-1,4-糖苷键，生成低分子量寡糖；此外，α-半乳糖苷酶可以切割由α-1,6-糖苷键连接的半乳糖侧链，也在瓜尔豆胶的降解中起重要作用。在CAZy数据库中，β-甘露聚糖酶分别属于糖苷水解酶5、26、113和134家族，α-半乳糖苷酶则分属糖苷水解酶4、27、31、36、57、97和110家族。其中，来源于27家族的α-半乳糖苷酶则可以直接从半乳甘露聚糖上水解下半乳糖侧链，从而更多的暴露半乳甘露聚糖上甘露聚糖酶作用位点，便于β-甘露聚糖酶进一步降解半乳甘露聚糖(Malgasetal.EnzymeandMicrobialTechnology,2015,70:1-8)。因此，用β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶协同水解瓜尔豆胶的方法，更适合水解瓜尔豆胶制备甘露寡糖及可溶性膳食纤维。膳食纤维是一种多糖，它既不能被胃肠道消化吸收，也不能产生能量。可溶性膳食纤维则是指聚合度在10以上的可溶且不被人体消化吸收的低分子量多糖。这类物质能刺激肠道蠕动，有利于粪便排出，可预防便秘、直肠癌、痔疮及下肢静脉曲张；可预防动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病的发生；预防胆结石的形成；产生饱腹感，对肥胖病人进食有利，可作为减肥食品；改善耐糖量，可调节糖尿病人的血糖水平，可作为糖尿病人的食品；改善肠道菌群，预防肠癌、阑尾炎等。通常，醇沉是分离纯化多糖的有效手段(Jianetal.FoodHydrocolloids,2014,40:115-121)。可溶性膳食纤维可以被高浓度乙醇沉淀下来，而甘露寡糖则会溶于高浓度乙醇，通过这一方法即可将膳食纤维与寡糖进行分离。关于瓜尔豆胶的水解报道较少，其中申请号为201510174562.2的中国发明专利申请公开了一种利用β-甘露聚糖酶、木聚糖酶和内切葡聚糖酶三种酶复合降解瓜尔豆胶制备低聚半乳甘露糖的方法；申请号为201510175963.X的中国发明专利申请公开了一种利用β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶三种酶复合降解瓜尔豆胶制备低聚半乳甘露糖的方法；申请号为201510175978.6的中国发明专利申请则公开了一种利用β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶和纤维二糖酶复合降解瓜尔豆胶制备低聚半乳甘露糖的方法，以上发明专利公开的均为制备低聚半乳甘露糖，均不涉及制备可溶性膳食纤维，目前，尚未见到有关利用瓜尔豆胶制备可溶性膳食纤维的报道。技术实现要素：本发明提供了一种利用复合酶水解瓜尔豆胶制备可溶性膳食纤维及甘露寡糖的方法，该方法的水解率及半乳甘露聚糖转化率高、产物易于分离、最终糖浆的重均分子量约为13700Da，可溶性膳食纤维的重均分子量约为14600Da，甘露寡糖的聚合度在2～5之间。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用复合酶水解瓜尔豆胶制备可溶性膳食纤维及甘露寡糖的方法，包括如下步骤：S1：将瓜尔豆胶溶液、甘露聚糖酶和半乳糖苷酶混合，水解后沸水浴灭活后冷却至室温，得到酶解液；S2：将步骤S1得到的酶解液进行过滤、脱色、离子交换和浓缩得到糖浆；S3：向步骤S2中的浓缩液中加入无水乙醇，静置后离心，分别收集沉淀和上清液；S4：用80％(V/V)的乙醇洗涤步骤S3中的沉淀后，干燥即得可溶性膳食纤维；S5：步骤S3中的上清液经浓缩干燥即得甘露寡糖糖粉。优选地，瓜尔豆胶与甘露聚糖酶的比例为：每克瓜尔豆胶加入甘露聚糖酶100～2000U。优选地，瓜尔豆胶与半乳糖苷酶的比例为：每克瓜尔豆胶加入半乳糖苷酶0～400U。优选地，所述瓜尔豆胶溶液的浓度为1％～10％。优选地，所述瓜尔豆胶的溶剂为蒸馏水或柠檬酸缓冲液。优选地，在所述步骤S1中，所述水解的温度为30℃～70℃。优选地，在所述步骤S1中，所述水解时间为1～24h。优选地，在所述步骤S2中，所述糖浆的重均分子量为13700Da。优选地，在所述步骤S4中，可溶性膳食纤维的重均分子量为14600Da。优选地，在所述步骤S5中，所述甘露寡糖的聚合度为2～5。与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：1、本发明利用复合酶水解瓜尔豆胶制备可溶性膳食纤维，为可溶性膳食纤维提供了一种来源；2、本发明提供的方法可以同时制备可溶性膳食纤维和甘露寡糖，可为“一举两得”；3、利用本发明提供的制备方法，可以制得中间产物—含半乳甘露寡糖的可溶性膳食纤维糖浆，该糖浆的重均分子量约为13700Da；4、本发明提供的利用复合酶水解瓜尔豆胶制备可溶性膳食纤维及甘露聚糖的方法，其水解率及半乳甘露聚糖转化率高、产物易于分离，制备的可溶性膳食纤维的重均分子量约为14600Da，甘露寡糖的聚合度在2-5之间。附图说明图1为不同水解时间复合酶水解瓜尔豆胶所得粗糖液粘度及还原糖得率；图2为甘露寡糖糖粉和可溶性膳食纤维的生产的工艺流程图；图3为水解产物凝胶排阻色谱分析图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面将参照附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所用的甘露聚糖酶来源于米黑根毛霉(Katroliaetal.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2013,61:394-401)，半乳糖苷酶来源于米黑根毛霉(Katroliaetal.BioresourceTechnology,2012,110:578-586)。一种利用复合酶水解瓜尔豆胶制备可溶性膳食纤维及甘露寡糖的方法，包括如下步骤：S1：瓜尔豆胶溶液、甘露聚糖酶和半乳糖苷酶混合，水解，酶解后沸水浴灭活后冷却至室温，得到酶解液；S2：将步骤S1得到的酶解液进行过滤、脱色、离子交换和浓缩得到糖浆；S3：向步骤S2中的浓缩液中加入无水乙醇，静置后离心，分别收集沉淀和上清液；S4：用80％(V/V)的乙醇洗涤步骤S3中的沉淀后，干燥即得可溶性膳食纤维；S5：步骤S3中的上清液经浓缩干燥即得甘露寡糖糖粉。作为本实施例优选的实施方式，瓜尔豆胶与甘露聚糖酶的混合比例为：每克瓜尔豆胶加入甘露聚糖酶100～2000U。作为本实施例优选的实施方式，瓜尔豆胶与半乳糖苷酶的混合比例为：每克瓜尔豆胶加入半乳糖苷酶0～400U。作为本实施例优选的实施方式，瓜尔豆胶溶液的浓度为1％～10％。作为本实施例优选的实施方式，瓜尔豆胶的溶剂为蒸馏水或柠檬酸缓冲液。作为本实施例优选的实施方式，在所述步骤S1中，所述水解的温度为30℃～70℃。作为本实施例优选的实施方式，在所述步骤S1中，所述水解时间为1～24h。作为本实施例优选的实施方式，在所述步骤S2中，所述糖浆的重均分子量为13700Da。作为本实施例优选的实施方式，在所述步骤S4中，可溶性膳食纤维的重均分子量为14600Da。作为本实施例优选的实施方式，在所述步骤S5中，所述甘露寡糖的聚合度为2～5。实施例2不同添加量的甘露聚糖酶复合水解瓜尔豆胶称取5g瓜尔豆胶完全溶解于100mL蒸馏水(蒸馏水亦可换为pH为7.0的磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液等)中，按照与瓜尔豆胶的比例为100、200、400、800、1000和2000U/g分别加入甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活10min，得到酶解液。所得酶解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即粗糖液，用DV-1旋转粘度计于25℃条件下测量其粘度，并用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖含量并计算还原糖得率。其实验结果见表1。表1不同甘露聚糖酶添加量水解瓜尔豆胶所得粗糖液粘度及还原糖得率加酶量(U/g)10020040080010002000粗糖液粘度(mPa·s)83.169.255.846.437.135.9还原糖得率(％)7.311.515.618.119.420.0从表1中可以看出，不同甘露聚糖酶添加量水解瓜尔豆胶，随着甘露聚糖酶添加量的增加，复合水解瓜尔豆胶所得的粗糖液粘度逐渐降低，还原糖的得率越来越高。当甘露聚糖酶添加量达到1000U/g时，粗糖液粘度降低不明显，还原糖的得率增加也不明显，因此，选择甘露聚糖酶添加量为1000U/g水解瓜尔豆胶。实施例3不同添加量的α-半乳糖苷酶与甘露聚糖酶复合水解瓜尔豆胶称取5g瓜尔豆胶溶于100mL蒸馏水(蒸馏水亦可换为pH为7.0的磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液等)中，按照与瓜尔豆胶1000U/g的比例加入甘露聚糖酶，并按照与瓜尔豆胶的比例为0、100、200、400U/g分别加入半乳糖苷酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活10min，得到酶解液。所得酶解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即粗糖液，用DV-1旋转粘度计于25℃条件下测量其粘度，并用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖含量并计算还原糖得率。不同添加量的α-半乳糖苷酶与1000U/g的甘露聚糖酶复合水解瓜尔豆胶后，所得粗糖液粘度及还原糖得率如表2所示。表2不同半乳糖苷酶添加量与甘露聚糖酶复合水解瓜尔豆胶所得粗糖液粘度及还原糖得率加酶量(U/g)0100200400粗糖液粘度(mPa·s)35.232.430.129.8还原糖得率(％)19.929.934.535.9从表2中可以看出，不同添加量的α-半乳糖苷酶与1000U/g的甘露聚糖酶复合水解瓜尔豆胶，随着α-半乳糖苷酶添加量的不断增大，所得粗糖液粘度有所下降但不明显，但还原糖得率逐渐上升。当半乳糖苷酶添加量在0～2000U之间时，还原糖得率从19.9％增加到35.9％，粗糖液粘度从35.2mPa·s降低至29.8mPa·s。考虑到成本问题，α-半乳糖苷酶的最佳加入量为200U/g。实施例4不同水解时间复合酶水解瓜尔豆胶的实验结果称取5g瓜尔豆胶溶于100mL蒸馏水中，按照与瓜尔豆胶的比例加入甘露聚糖酶1000U/g和半乳糖苷酶200U/g，分别置于50℃下水解1、2、4、8、12、24h，酶解后沸水浴灭活10min，得到酶解液，所得酶解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即得粗糖液。用DV-1旋转粘度计于25℃条件下测量粗糖液的粘度，并用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖含量并计算还原糖得率。不同水解时间复合酶水解瓜尔豆胶所得粗糖液粘度及还原糖得率如图1所示。图中黑色方形表示还原糖的得率，空心方形表示粗糖液的粘度。结果显示随着酶解时间逐渐延长，粗糖液的粘度迅速下降，同时还原糖得率逐渐上升。5g瓜尔豆胶经过复合酶解1-24h后，粗糖液还原糖得率达到了36.1％，粗糖液粘度则降低至31.4。实施例5含甘露寡糖的可溶性膳食纤维糖浆的生产如图2所示，在20L酶解罐中注入18L蒸馏水，加入900g瓜尔豆胶，按照与瓜尔豆胶的比例为1000U/g加入甘露聚糖酶，按照与瓜尔豆胶的比例为200U/g加入半乳糖苷酶，将酶解罐升温至50℃水解8h，经过100℃灭酶后冷却至室温。将酶解液放出后进行板框过滤(可以选择其他过滤方法)，加入硅藻土助滤，硅藻土的添加量为3kg/m2；收集滤液活性炭脱色，活性炭添加量为0.5％(m/v)，80℃保温30min；脱色后过滤除去活性炭进行离子交换处理，按照阳离子、阴离子、阴离子、阳离子树脂顺序处理，阳离子树脂为001×7，阴离子树脂为D301；离子交换处理后通过薄膜浓缩或旋转蒸发浓缩。浓缩后得到含甘露寡糖的可溶性膳食纤维糖浆。利用复合酶水解瓜尔豆胶生产含甘露寡糖的可溶性膳食纤维糖浆，经过计算酶解、过滤、脱色、离子交换和浓缩各步骤的得率分别为87.9％、83.5％、81.7％、77.9％和76.2％。称取10mg含甘露寡糖的可溶性膳食纤维糖浆经过真空冷冻干燥后，得到粉末状产品。取冷冻干燥后的粉末样品6mg，溶于3mL蒸馏水后，用0.22μm滤膜过滤后，进行凝胶排阻色谱分析。色谱柱为PLaquagel-OHMIXED(7.5mmI.D×30cm)，柱温40℃，流动相0.1MNaNO3。以不同分子量的葡聚糖为标准品。水解产物凝胶排阻色谱结果如图3所示。从图3中可以看出，水解产物的重均分子量为13700Da，分散指数为10.33。实施例6甘露寡糖糖粉和可溶性膳食纤维的生产如图2所示，按照实施例5中的方法制备含甘露寡糖的可溶性膳食纤维糖浆。向含甘露寡糖的可溶性膳食纤维糖浆中加入无水乙醇，直至乙醇浓度达到80％(V/V)，静置30min后，于10000rpm下离心5min，分别收集沉淀和上清液。沉淀用80％(V/V)乙醇清洗3次后真空冷冻干燥即得可溶性膳食纤维，上清液经过旋转蒸发浓缩后冷冻干燥即得甘露寡糖糖粉。膳食纤维和甘露寡糖糖粉的得率分别为55.4％和26.9％，膳食纤维的重均分子量为14600Da，甘露寡糖的聚合度在2-5之间。以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。当前第1页1 2 3