一种牛蒡提取物及其用于制备单增李斯特菌抑菌剂的用途的制作方法

本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种牛蒡提取物，并进一步公开其用于抑制猪肉中单增李斯特菌的用途。

背景技术：

牛蒡(Arctium lappa L.)，又名恶实、大力子、东洋参、东洋牛鞭菜等，属桔梗目，菊科二年生草本植物，基生叶宽卵形，长达30厘米，宽达21厘米，头状花序多数或少数在成伞房花序或圆锥状伞房花序，瘦果倒长卵形或偏斜倒长卵形，两侧压扁，浅褐色，花果期为6-9月。牛蒡主要分布于中国、西欧、克什米尔地区、欧洲等地，中国牛蒡的种植主要产地分布于江苏省和山东省，江苏省的徐州丰县、沛县，山东省的苍山种植历史悠久，面积规模较大。一千多年前日本从中国引进并改良成食物，并在日本占据台湾时曾在台南要求当地农民大量种植。台南曾文溪畔松沙土质、北回归线气候加上有名阿里山延脉造就其当地牛蒡得天独厚的珍贵性，牛蒡在台湾已作为蔬菜食用多年，素有牛蒡发祥地之称。

研究证明，牛蒡含菊糖、纤维素、蛋白质、钙、磷、铁等人体所需的多种维生素及矿物质，其中胡萝卜素含量比胡萝卜高150倍，蛋白质和钙的含量为根茎类之首；牛蒡根含有菊糖及挥发油、牛蒡酸、多种多酚物质及醛类，并富含纤维素和氨基酸；牛蒡根含有人体必需的各种氨基酸，且含量较高，尤其是具有特殊药理作用的氨基酸含量高，如具有健脑作用的天门冬氨酸占总氨基酸的25％-28％，精氨酸占18％-20％，且含有Ca、Mg、Fe、Mn、Zn等人体必需的宏量元素和微量元素。

牛蒡具有治疗糖尿病、高血压、高血脂、抗癌等作用，具有降血糖、降血压、血脂、治疗失眠，提高人体免疫力等功效。同时牛旁根中含有过氧化物酶，它能增强细胞免疫机制的活力，清除体内氧自由基，阻止脂褐质色素在体内的生成和堆积，抗衰防老，为机体提供了对抗和清除氧自由基的内护环境。同时已有研究表明，牛蒡醇提物还是一种较好的广谱抑菌剂，不过对于一些低温下依然具有活性的菌体如单增李斯特菌而言，其抑菌效果并不明显。

单增李斯特菌是李斯特菌(Listeria monocytogenes)的一种，是一种常见的土壤细菌，属兼性厌氧细菌。李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中，单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的，在土壤中它是一种腐生菌，以死亡的和正在腐烂的有机物为食；它也是某些食物(主要是鲜奶产品)中的一种污染物，能引起严重食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

单增李斯特菌广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，已知的牛蒡提取物抑菌剂对其低温下的抑菌性能较差。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种牛蒡提取物，以解决现有技术中牛蒡提取物对单增李斯特菌的低温抑菌性能较差的问题。

为解决上述技术问题，本发明所述的提取牛蒡中有效成分的方法，包括如下步骤：

(1)取牛蒡粉碎，加入乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂进行浸渍提取；

(2)将提取液过滤，取滤液减压浓缩后，加入无水乙醇进行醇沉处理，抽滤后得到牛蒡提取液，冷冻干燥，即得所述牛蒡提取物。

所述步骤(1)中，所述溶剂中，乙醇和乙酸乙酯的体积比为1-3：1-2。

所述步骤(1)中，所述乙醇的质量浓度为30-50wt％。

所述步骤(1)中，所述牛蒡与所述混合溶剂的料液比为1：20-50，所述料液比的比例关系为g/mL。

所述步骤(1)中，所述提取温度为40-50℃。

所述步骤(1)中，所述牛蒡为牛蒡植物的叶和/或茎。

本发明还公开了由所述提取方法提取得到的牛蒡提取物。

本发明还公开了所述牛蒡提取物用于制备抑菌剂的用途。

所述抑菌剂为抑制单增李斯特菌的抑菌剂。

所述抑菌剂为抑制猪肉中单增李斯特菌的抑菌剂。

本发明所述牛蒡提取物，是以乙醇溶液和乙酸乙酯的混合溶剂为提取剂进行浸渍提取所得，不仅对单增李斯特均的常温抑菌性能较好，同时在4℃低温下依然能抑制单增李斯特均的繁殖。相比于现有醇提获得的牛蒡提取物，其低温抑菌性能更加具有优势，取得了预料不到的技术效果。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为25℃恒温箱中微生物数量测定结果，

图2为本发明所述4℃恒温箱中微生物数量测定结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例所述牛蒡提取物，按照如下步骤提取：

(1)取牛蒡植物的叶或茎粉碎，并取10g加入乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂200mL(所述乙醇溶液的质量浓度为30wt，所述乙醇溶液与乙酸乙酯的体积比为1：1)混匀，于40℃进行浸渍提取2-3h；

(2)将提取液过滤，取滤液减压浓缩后，加入无水乙醇进行醇沉处理2h，抽滤后得到牛蒡提取液，冷冻干燥成粉，即得所述牛蒡提取物。

实施例2

本实施例所述牛蒡提取物，按照如下步骤提取：

(1)取牛蒡植物的叶或茎粉碎，并取10g加入乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂500mL(所述乙醇溶液的质量浓度为50wt，所述乙醇溶液与乙酸乙酯的体积比为3：2)混匀，于50℃进行浸渍提取3h；

(2)将提取液过滤，取滤液减压浓缩后，加入无水乙醇进行醇沉处理2h，抽滤后得到牛蒡提取液，冷冻干燥成粉，即得所述牛蒡提取物。

实施例3

本实施例所述牛蒡提取物，按照如下步骤提取：

(1)取牛蒡植物的叶或茎粉碎，并取10g加入乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂300mL(所述乙醇溶液的质量浓度为40wt，所述乙醇溶液与乙酸乙酯的体积比为1：2)混匀，于45℃进行浸渍提取3h；

(2)将提取液过滤，取滤液减压浓缩后，加入无水乙醇进行醇沉处理2h，抽滤后得到牛蒡提取液，冷冻干燥成粉，即得所述牛蒡提取物。

实施例4

本实施例所述牛蒡提取物，按照如下步骤提取：

(1)取牛蒡植物的叶或茎粉碎，并取10g加入乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂400mL(所述乙醇溶液的质量浓度为40wt，所述乙醇溶液与乙酸乙酯的体积比为3：1)混匀，于45℃进行浸渍提取3h；

(2)将提取液过滤，取滤液减压浓缩后，加入无水乙醇进行醇沉处理2h，抽滤后得到牛蒡提取液，冷冻干燥成粉，即得所述牛蒡提取物。

对比例1

本对比例所述提取物的提取方法与实施例3相同，其区别仅在于，所述提取溶剂仅为乙醇溶液而不含有乙酸乙酯。

实验例

将熟猪肉进行无菌去离子水浸泡清洗15min、75％乙醇浸泡清洗15min以及100℃蒸煮30min处理，获得无菌原料。

将处理后的无菌猪肉均匀分割后放入无菌均质袋，将10⁸CFU/ml单增李斯特菌TSB培养液用0.85％无菌生理盐水梯度稀释至10⁶CFU/ml，分别于各份猪肉中接种单增李斯特稀释液1mL，使每份猪肉中携带最初致病菌浓度约为10⁵CFU/ml，无菌条件下用手反复翻捏猪肉30min，以使微生物在猪肉中均匀分散，之后放置1h，使微生物细胞充分在猪肉内部分散。

将实施例3制得提取物加水配制0μl/ml、250μl/ml、500μl/ml、750μl/ml、1000μl/ml浓度的牛蒡提取物，分别与各份上述已接种致病菌猪肉充分混匀，分别置于25℃恒温箱中分别于0、12h、24h、48h测定其中微生物数量，另置于4℃恒温箱中分别于0、1d、3d、5d、7d测定其中微生物数量。测定时间点将各样品于恒温箱中取出，在每个均质袋中加入80mL1mg/ml无菌蛋白胨水，置均质拍打机上拍打2min，取1mL拍打液进行系列梯度稀释，取100μL适宜浓度稀释液涂布于TSA平板，37℃恒温培养16-24h后进行菌落计数。每个样品做三个平行，实验重复三次。25℃恒温箱中微生物数量结果见附图1所示，4℃恒温箱中微生物数量结果见附图2所示。上述附图显示的结果中，各柱状线条从左至右依次代表0μl/ml、250μl/ml、500μl/ml、750μl/ml、1000μl/ml浓度的牛蒡提取物的效果，每一个时间段内条形柱中不同字母表示不同浓度牛蒡提取物抑菌效果具有显著性差异(P<0.05)。

由图1中结果可知，25℃条件下，与对照组相比较，经各浓度组牛蒡提取液处理12h后猪肉中单增李斯特菌浓度均显著降低，随着处理时间的延长，猪肉中单增李斯特菌浓度继续降低，48h后，对照组微生物浓度达到9.5log，而经1000μL/mL牛蒡提取液处理后微生物浓度降为2.7log。牛蒡提取液在25℃条件下对猪肉中副溶血性弧菌的抑制效果与其浓度及处理时间呈正相关。

由图2中结果可知，4℃条件下处理前2d，猪肉中单增李斯特菌浓度无明显变化，牛蒡提取液也未起到杀菌作用。在此温度下处理第7天时，对照组猪肉中单增李斯特菌浓度开始升高，微生物生长，250μL/mL牛蒡提取液处理组微生物生长受到抑制，但是数量并未发生明显降低，500μL/mL、750μL/mL和1000μL/mL牛蒡提取液处理组微生物浓度降低，各组微生物浓度与对照组相比较均有显著性差异。

而按照上述方法将对比例1中制得牛蒡提取物进行抑菌性实验，25℃条件下，相比于实施例3中提取物的抑菌效果略低，但是，4℃条件下的抑菌效果则十分低，相比于实施例3中提取物在同等时间下的抑菌效果降低超过60％。

可见，本发明所述牛蒡提取物不仅具有常规抑菌性，同时能在低温下抑制单增李斯特菌的繁殖。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。