本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳清的制备方法。此外，本发明还涉及一种乳清，以及一种乳清粉基料。
背景技术：
乳清蛋白是牛奶乳清中的主要成分，其功能性蛋白含量高、必需氨基酸种类齐全且生物利用效价高。乳清蛋白是一些小的、紧密的球状蛋白，其独特的氨基酸序列和三维结构赋予它广泛的功能特性，必需氨基酸组成完全符合或超出FAO/WHO的要求，胆固醇、脂肪和乳糖含量低，易消化，易吸收。乳清蛋白具有一定的功能特性和生物学活性，在食品行业，特别是乳制品行业中应用越来越广泛。
乳清是指在制造干酪或干酪素时，分离出絮凝物后剩下的液体，乳清中含有乳清蛋白、乳糖等营养物质，以及多种矿物质和水溶性维生素。乳清可以用于制备一系列乳清产品，如乳清粉、乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白等。对于乳清的分离有大量的研究，应用较多的是酸法制备提取乳清，该方法生产的乳清产品多会出现酸味、苦味，在食品行业中的应用存在局限性。另外也有使用酶法制备乳清，常用的凝乳酶有小牛皱胃酶等，但小牛皱胃酶的产量远远不能满足当前生产的需求，从而使得酶法制得的乳清产量也远不能满足市场需求，这是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种新的乳清制备方法，用于制备无酸味、无苦味的乳清，为乳清制备开拓了新的思路。
具体地，一方面，提供了一种乳清制备方法，包括以下步骤：(1)配制CaCl2含量为0.001-0.1mol/L脱脂乳，并调节pH至5.5-6.5，得到料液；(2)将类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶与步骤(1)所得的料液混匀，恒温水浴35℃加热至出现雪花状颗粒后，55-80℃热烫5-60min；(3)切割并搅拌步骤(2)所得料液中的沉淀块状物，离心收集上清液；(4)对步骤(3)所得的上清液进行透析，得到乳清。
进一步地，步骤(2)中，上述凝乳酶的添加量为1-4SU/mL料液。
进一步地，步骤(4)中，上述透析的截留分子量为0.5KD。
进一步地，步骤(4)中，上述透析的时间为10-48h。
进一步地，步骤(3)中，沉淀块状物的切割大小为0.5-2cm3。
进一步地，步骤(3)中，离心转速为10000-15000r/min；离心时间为5-15min。
进一步地，步骤(2)中，上述凝乳酶的制备步骤包括：类芽孢杆菌CGMCC No.8333在小麦麸皮培养基中进行发酵，发酵产物再经过纯化，得到凝乳酶。
另一方面，还提供了一种乳清，由上述任一种乳清制备方法所制得。
第三方面，还提供了一种乳清粉基料，将上述的乳清进行冷冻干燥，制得乳清粉基料。
上述技术方案提供了一种新的制备乳清的方法，创新地利用类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶，通过该酶的凝乳作用以及水解作用，特异性对κ-酪蛋白Met106–Ala107位点进行水解，并与工艺条件协同作用，从而制得无酸味、无苦味的乳清，有效避免酸法制备中苦味肽的出现。此外，通过上述制备方法所制得的乳清以及乳清粉基料，其风味和得率均与现有的方法所制得的乳清产品相当，安全性高。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：
在一个具体的实施方式中，提供了一种乳清制备方法，包括以下步骤：(1)配制CaCl2含量为0.001-0.1mol/L脱脂乳，并调节pH至5.5-6.5，得到料液；(2)将类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶与步骤(1)所得的料液混匀，恒温水浴加热至出现雪花状颗粒后，55-80℃热烫5-60min；(3)切割并搅拌步骤(2)所得料液中的沉淀块状物，离心收集上清液；(4)对步骤(3)所得的上清液进行透析，得到乳清。
上述技术方案是一种新的制备乳清的方法，创新地利用类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶，通过该酶的凝乳作用以及水解作用，特异性对κ-酪蛋白Met106–Ala107位点进行水解，并与工艺条件协同作用，制得无酸味、无苦味的乳清，有效避免酸法制备中苦味肽的出现。此外，通过上述制备方法所制得的乳清以及乳清粉基料，其风味和得率均与现有的方法所制得的乳清产品相当。
本发明中的类芽孢杆菌CGMCC No.8333，除了在中国进行保藏，还在德、美微生物菌种保藏中心进行了保藏，其编号分别为DSM No.28815和ATCC No.00318。
进一步地，上述步骤(1)中，脱脂乳可以是脱脂鲜牛乳，也可以是复原脱脂乳；优选的采用复原脱脂乳。
进一步地，上述步骤(1)中，CaCl2的添加量为0.001-0.1mol/L脱脂乳；较佳添加量为0.01mol/L。添加适量Ca2+可以促进凝乳的形成，以排出乳清。
进一步地，上述步骤(1)中，调节脱脂乳的pH至5.5-6.5，较佳调节pH为6.0，以保证凝乳酶在最适pH条件下反应。
进一步地，上述步骤(2)中，凝乳酶的添加量为1-4SU/mL料液，较佳的为2SU/mL料液。优选地，上述凝乳酶的制备步骤包括：类芽孢杆菌CGMCC No.8333在小麦麸皮培养基中进行发酵，发酵产物再经过纯化，得到凝乳酶，该酶对κ-酪蛋白的特异水解位点为Met106–Ala107。通过控制凝乳酶活力控制凝乳时间，避免剧烈凝乳及水解作用，更好地防止苦味肽的产生。
进一步地，上述步骤(2)中，上述恒温水浴加热，温度较佳的为35℃。热烫的温度为55-80℃，较佳为60℃；热烫时间为5-60min，较佳为30min。经过恒温水浴加热和热烫以后，所得料液中会产生沉淀块状物。通过对上述水浴温度、热烫温度以及时间的控制，保证具有较高的乳清和乳清粉基料的得率。
进一步地，上述步骤(3)中，沉淀块状物的切割大小为0.5-2cm3，较佳的体积为1cm3。将沉淀块状物切割成上述大小，以便较好的排出乳清。
进一步地，上述步骤(3)中，离心转速为10000-15000r/min，较佳为12000r/min；离心时间为5-15min，较佳为10min。更进一步地，离心温度为2-10℃，较佳为4℃。通过对离心条件的控制，保证产品能较佳的与酪蛋白及其他沉淀物质分离，并排出较多的上清液，并提高最终制得的乳清以及乳清粉基料的得率。
进一步地，上述步骤(4)中，透析的截留分子量为0.5KD。透析的时间为10-48h；更佳地，透析在4℃下进行，透析时间为24h。通过透析，对透析的截留分子量的选择，以排除步骤(3)所制得的上清液中混合的乳糖等小分子杂质。
上述的乳清制备方法中，反应体系中，CaCl2浓度、pH值、凝乳酶活力的控制、水浴及热烫过程中的温度和时间控制以及透析条件的控制等生产环节，均能不同程度地影响所制得的乳清以及乳清粉基料中的乳清蛋白的功能性以及乳清粉基料的口感。因此，通过对上述条件的控制，并与类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶进行协同作用，可以进一步提高所制得的乳清以及乳清粉基料的得率以及风味，保持其中乳清蛋白的功能性，这对后续的添加该乳清粉基料的发酵乳及配方粉的功能、风味特性、质构和凝胶性都存在重要影响。
在另一个具体的实施方式中，还提供一种乳清，由上述任一种乳清制备方法制得。进一步的，还提供一种乳清粉基料，将上述的乳清进行冷冻干燥，制得乳清粉基料。乳清经过冷冻干燥后，呈均匀的、松散的絮状物。
由于上述乳清制备方法具有上述有益效果，由该制备方法制得的乳清，以及由上述乳清通过冷冻干燥制得的乳清粉基料，也相应地具备上述有益效果，此处不再赘述。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。
实施例1纯化后CGMCCNo.8333发酵产凝乳酶活力的检测
取纯化后的凝乳酶1mL，溶解于4mL蒸馏水中，混匀后测定其凝乳酶活力。
凝乳酶活力(milk clotting activity,MCA)测定方法包括以下步骤：将脱脂奶粉(脱脂奶粉购买自fonterra公司)以10％(w/v)的比例配置成pH 6.0含有0.01mol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10min后，将500μL的凝乳酶加入至35℃的10mL脱脂乳溶液中，每15s将样品取出并倾斜45℃观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1个凝乳酶单位(Soxhlet unite，SU)定义为35℃，使1mL脱脂乳在40min发生凝乳所需的酶量。
T——凝乳时间，秒
VS——底物体积，mL
VE——酶液体积，mL
D——稀释倍率
表1纯化后CGMCCNo.8333发酵产凝乳酶活力测定结果
由表1可知，纯化后凝乳酶活力为4210.53SU/mL。为控制凝乳时间，将凝乳酶用蒸馏水稀释，较佳地使其在脱脂乳体系中活力在1-4SU/mL范围内。
实施例2乳清及乳清粉基料的制备方法
将20g脱脂奶粉溶解于200mL蒸馏水，配制成pH 6.0含有0.01mol/L CaCl2的溶液，取适量纯化后的类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶加至脱脂乳中，使其在脱脂乳体系中活力为2SU/mL；
在35℃水浴中孵育脱脂乳至其出现雪花状颗粒，立即将其置于60℃热水中并维持30min；切割沉淀块状物至1cm3并进行搅拌以排出乳清，于4℃，12000r/min离心10min收集上清液；将上清液置于截留分子量为500的透析袋，于4℃温度下，连续透析24h，得到乳清。
后将乳清进行冷冻干燥；收集冻干后絮状物，即为乳清粉基料。
计算乳清粉基料得率并进行气味及色泽的感官评价，结果如表2所示。
乳清粉基料得率(％)W＝m1/m2x 100％
m1——干燥后絮状物质量，g
m2——脱脂乳粉质量，g
表2乳清粉基料1的测定结果
实施例3乳清及乳清粉基料的制备方法
将20g脱脂奶粉溶解于200mL蒸馏水，配制成pH 6.5含有0.001mol/L CaCl2的溶液，取适量纯化后的类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶加至脱脂乳中，使其在脱脂乳体系中活力为4SU/mL；
在35℃水浴中孵育脱脂乳至其出现雪花状颗粒，立即将其置于80℃热水中并维持5min；切割沉淀块状物至2cm3并进行搅拌以排出乳清，于2℃，10000r/min离心15min收集上清液；将上清液置于截留分子量为500透析袋，于4℃温度下，连续透析10h，得到乳清。
后将乳清进行冷冻干燥；收集冻干后絮状物，即为乳清粉基料。
计算乳清粉基料得率并进行气味及色泽的感官评价，结果如表3所示。
表3乳清粉基料2的测定结果
实施例4乳清及乳清粉基料的制备方法
将20g脱脂奶粉溶解于200mL蒸馏水，配置成pH 5.5含有0.1mol/L CaCl2的溶液，取适量纯化后的类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶加至脱脂乳中，使其在脱脂乳体系中活力为1SU/mL；
在35℃水浴中孵育脱脂乳至其出现雪花状颗粒，立即将其置于55℃热水中并维持60min；切割沉淀块状物至0.5cm3并进行搅拌以排出乳清，于10℃，15000r/min离心5min收集上清液；将上清置于截留分子量为500透析袋，于4℃温度下，连续透析48h，得到乳清。
后将乳清进行冷冻干燥；收集冻干后絮状物，即为乳清粉基料。
计算乳清粉基料得率并进行气味及色泽的感官评价，结果如表4所示。
表4乳清粉基料3的测定结果
实施例5乳清及乳清粉基料的制备方法
将20g脱脂奶粉溶解于200mL蒸馏水，配制成pH 6.0含有0.01mol/L CaCl2的溶液，取适量纯化后的类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶加至脱脂乳中，使其在脱脂乳体系中活力为0.5SU/mL；
在35℃水浴中孵育脱脂乳至其出现雪花状颗粒，立即将其置于60℃热水中并维持60min；切割沉淀块状物至1cm3并进行搅拌以排出乳清，于4℃，12000r/min离心10min收集上清液；将上清液置于截留分子量为500的透析袋，于4℃温度下，连续透析24h，得到乳清。
后将乳清进行冷冻干燥；收集冻干后絮状物，即为乳清粉基料。
计算乳清粉基料得率并进行气味及色泽的感官评价，结果如表5所示。
表5乳清粉基料4的测定结果
比较例1商业化酶制备乳清粉基料的方法比较
分别将20g脱脂奶粉溶解于200mL蒸馏水，配置成pH 6.0含有0.01mol/L CaCl2的溶液，分别取适量小牛皱胃酶、重组凝乳酶、米黑毛霉凝乳酶加至脱脂乳中，使其在脱脂乳体系中活力为2SU/mL；
在35℃水浴中孵育相应的脱脂乳至其出现雪花状颗粒，立即将其置于60℃热水中并维持30min；切割沉淀块状物至1cm3并进行搅拌以排出乳清，于4℃，12000r/min离心10min收集上清液；将上清置于截留分子量为500透析袋，于4℃温度下，连续透析24h。后将其冷冻干燥；收集冻干后絮状物，即为水解乳清蛋白粉基料。分别比较其得率并进行气味及色泽的感官评价，结果如表6所示。
表6不同凝乳酶制备水解乳清粉基料的结果比较
CGMCC No.8333产凝乳酶与商业化凝乳酶比较，作用效果较为接近，可用于商业化生产。
比较例2酸凝与酶凝制备乳清粉基料方法比较
酶凝制备乳清粉基料制备方法同实施例2。
酸凝制备乳清粉基料制备方法：将20g脱脂奶粉溶解于200mL蒸馏水，使用调节pH至4.6，使干酪素微胶粒失去电荷而凝固沉淀。将其置于60℃热水中并维持30min；切割沉淀块状物至1cm3并进行搅拌以排出乳清，于4℃，12000r/min离心10min收集上清液；将上清置于截留分子量为500透析袋，于4℃温度下，连续透析24h。后将其冷冻干燥；收集冻干后絮状物，即为乳清粉基料。
分别比较两种制备方式的得率，并进行气味及色泽的感官评价，结果如表7所示。
表7不同制备方式的结果比较
通过酸凝的方法在得率上较酶凝方法低，且色泽为淡黄色或浅褐色，可能在热烫过程中，出现美拉德反应，从而影响产品色泽。酸凝制备的产品有酸味。利用CGMCC No.8333发酵产生的凝乳酶的制备乳清方法，可以有效避免制备乳清以及乳清粉基料过程中出现苦味现象，相对酸法生产有较高的开发价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以帮助理解本发明的技术方案及核心思想，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换也落入本发明权利要求的保护范围内。