专利名称：利用毕赤氏酵母表达系统生产抗生血管蛋白质∶制管张素,内抑制素或静息蛋白的方法
相关申请本申请6要求保护1997年11月8日递交的申请60/067，888，1998年4月22日递交的60/082，663，1998年12月16日递交的60/108，536的优先权，这些申请的全部内容引入本文作为参考。
背景技术：
预测癌症转移仍然是相当困难的。虽然在放射性治疗和化学治疗上有了很大进步，但过去几十年表明在治疗的病人的长期生存方面只有很小的进步。转移癌症缺乏可得的显著的治疗方法越发体现了需要集中开发新的治疗方案。在这点上，最近在几个动物模型系统中显示，靶击固体肿瘤的肿瘤微管结构的结果很有前途(Baillie等人(1995)，英国癌症杂志，72257-67；Bicknell，R.(1994)癌症学年评(增刊)445-50；Fan等人(1995)药学科学进展1657-66；Thorpe，P.E和Burrows，F.J.(1995)胸癌治疗研究36237-51；Burrows，F.J.和Thorpe，P.E.(1994)药学理论64155-74)。在裸鼠模型中，例如在786-0细胞，RCC肿瘤细胞系，中导入野生型VHL基因，抑制肿瘤生长(Iliopoulos等人(1995)Nat.Med.1822-26)和血管发生。
小于几立方毫米的固体肿瘤的生长取决于新血管的形成(Folkman，J.(1971)N.Engl.J.Med.2851182-86)。许多研究表明初级肿瘤和转移生长都是依赖于血管发生的(Folkman，J.(1971)N.Engl.J.Med.2851182-86；Folkman，J.(1972)外科学年评175409-16；Folkman，J.和Shing，Y.(1992)生物化学杂志26710931-34；Folkman，J.(1996)Sci.Am.275150-54)。许多血管发生抑制剂已经得到鉴定。有一些如血小板因子-4(Maione等人(1990)科学24777-79；Gupta等人(1995)美国科学院院刊927799-7803)，干扰素，干扰素可诱导蛋白质-10，和PEX(Angiolillo等人(1995)实验医学杂志182155-62；Strieter等人(1995)生物化学生物活体研究通信21051-57；Brooks等人(1998)细胞92391-400)不是“相关肿瘤”，而其它两个，制管张素和内抑制素是“肿瘤相关的”(O’Reilly等人(1994)细胞79315-28；O’Reilly等人(1997)细胞88277-85)。制管张素，上调基质金属弹性蛋白酶的渗滤肿瘤的巨噬细胞产生的制管张素的潜在的内源抑制剂(Dong等人(1997)细胞88801-10)，抑制许多种类的初级和转移肿瘤的生长(Lannutti等人(1997)癌症研究，575277-80；O’Reilly 等人(1994)Cold SpringHarb.Symp.Quant.Biol.591329-34；Wu等人(1997)生物化学生物活体研究通信236651-54)。最近，O’Reilly，等人((1997)细胞88277-85)已经分离内抑制素，来自小鼠血管内皮瘤细胞系(EOMA)的制管张素抑制剂。在患有慢性肾衰竭而没有可检测的肿瘤的病人中已经检测到循环水平的人内抑制素的片断(Wu等人(1997)生物化学生物活体研究通信236651-54)。
内抑制素的氨基末端序列对应的是胶原ⅩⅧ的羧基末端部分。内抑制素是内皮增殖和制管张素的特定的抑制剂。系统给药在大肠杆菌中表达的非再折叠沉淀蛋白质在异种移植模型中导致Lewis肺癌，T241纤维瘤，B16黑素瘤和EOMA细胞的生长退化(O’Reilly等人(1997)细胞88277-85)。另外，注意到在研究的三个肿瘤类型中没有药物抗性。已经有报道将内抑制素重复循环给药可导致肿瘤休眠(Boehm等人(1997)自然390404-407)。
研究这些制管张素和内抑制素的结果是打开了治疗癌症的新途径，和提供了大有希望克服化学治疗中经常遇到的药物抗性的新途径。但是，在所有这些研究中，非再折叠沉淀形式的抑制剂蛋白质是以悬浮液的形式对患肿瘤的动物给药的。另外，导致肿瘤退化和导致肿瘤休眠需要大量的蛋白质。正如 Kerbel在(1997)自然390335-36)中指出，导致肿瘤退化和肿瘤休眠需要这些蛋白质的口服药物等当物。如果获得了这些蛋白质的重组形式的可溶形式，可以进行机制的研究。另外，在体内研究蛋白质的效能之前可以首先在体外进行可溶蛋白质的测试。
另外，已经有报道，虽然这些蛋白质很有前途，由于难于生产足够的蛋白质用于测试和与它们的抗血管生成特性如抗血管生成活性相矛盾的测试结果，评估它们的临床潜力处于困境(King，R.T.，Wall Street J.，第1页，1998年12月12日；Leffe，D.N.今日生物世界，9∶1，1998年10月20日)。目前显然存在的巨大需求是生产临床有效的具有足够的生物活性的可溶形式的抗血管生成蛋白质和可靠而不会失去关键活性的高产量生产这些蛋白质的生产方法。
发明概要本发明涉及生产具有足以有效临床的生物活性的抗血管生成的蛋白质的生产方法的发现。正如本文所述，本方法中抗血管生成的蛋白质可以可再生地高产量生产(例如10到20毫克/升培养基)。重要的是，本文叙述的方法生产的抗血管生成的蛋白质保留了高的生物活性。
抗血管生成蛋白质是本领域技术人员已知的。例如制管张素，内抑制素，16千道尔顿催乳素片断，RNAisn，TNP470，2-甲氧基雌二醇，和肝素命名的几个。正如本文所用，术语“抗血管生成蛋白质”不仅指完整的蛋白质，而且指突变体(例如，具有附加，删除或更改的氨基酸)，片断(例如，特定的具有删除的氨基酸)，衍生物(例如，为了降低蛋白酶降解修饰的蛋白质或肽)和融合蛋白质，其中融合蛋白质包括结合的两个或单个已知的抗血管生成的蛋白质(例如，制管张素和内抑制素，或制管张素和内抑制素的生物活性片断)或与靶试剂结合的抗血管生成的蛋白质[例如，具有表皮生长因子(EGF)或RGD肽的内抑制素]，或与免疫球蛋白分子结合的抗血管生成蛋白质(例如，特定地具有除去的Fc部分的内抑制素和IgG)。本文所用的术语“融合蛋白质”也可以包括例如用于递送化学治疗试剂的其它成分，其中编码化学治疗试剂的聚核苷酸与编码抗血管生成的蛋白质的聚核苷酸连接在一起。融合蛋白质也可以包括抗血管生成蛋白质例如，内抑制素的二聚体或三聚体的多聚体。
人们同样认识到，本文叙述的抗血管生成蛋白质是可以翻译后修饰而包括靶成分的，例如，血管内皮生长因子(VEGF)，或化学治疗试剂如蓖麻毒或放射性同位素。翻译后的其它修饰包括多聚体化，例如通过本领域技术人员已知的技术化学交联多聚体化。但是，为了简明，本文所用的术语“抗血管生成蛋白质”没有特定地指突变体，衍生物，片断和融合蛋白质。
本发明涉及了利用原核或真核表达系统生产生物活性抗血管生成蛋白质，或其生物活性突变体，片断，衍生物或融合蛋白质。本发明还特定地涉及酵母表达系统，更具体地说是巴斯德毕赤氏酵母表达系统的用途。
本方法的步骤包括在适当的表达载体如原核生物的或真核生物的表达载体中插入编码抗血管生成蛋白质，或其突变体或衍生物或片断或融合蛋白质的聚核苷酸序列。本发明特定地涉及酵母表达载体。适当的酵母表达载体是本领域技术人员已知的。用于本文叙述的方法的特定的适当表达载体是可市购获得的含有pPICzαA质粒的毕赤氏酵母载体，其中该质粒含有多个克隆位点。抗血管生成的蛋白质的聚核苷酸序列是本领域已知的，本文中和Vikas P.Sukhatme1998年11月8日递交的专利申请U.S.S.N.XX/XXX，XXX“静息蛋白和其利用的方法”和1998年11月8日Vikas P.Sukhatime递交专利申请的“抗血管生成肽和其利用的方法”中也叙述了新的抗血管生成蛋白质序列已经已知的抗血管生成蛋白质的突变序列。这两个专利申请的内容引入本文作为参考。在载体中插入选择的聚核苷酸序列是技术人员的常用技术，也在本文叙述了。
在载体中插入选择的聚核苷酸后，将该载体转化进入适当的酵母菌株，和在生产生物活性抗血管生成蛋白质的适当培养条件下培养(例如，维持)酵母菌株，从而生产生物活性的抗血管生成蛋白质，或其突变体，衍生物，片断或融合蛋白。通常，生成的抗血管生成蛋白质的量约为每升培养液10-20微克，或更多。
在一个实施方案中，编码抗血管生成蛋白质的分离的聚核苷酸另外还包括了编码肽的聚核苷酸接头。这样的接头是本领域已知的，例如，接头至少可以含有至少编码另外一个氨基酸的另外一个密码子。通常接头含有1到20或30个氨基酸。通常，接头附着于编码抗血管生成蛋白质的聚核苷酸的5’末端，但也可以附着于3’末端。正如编码抗血管生成的蛋白质的聚核苷酸，聚核苷酸接头也是翻译的，导致表达出在抗血管生成蛋白质的氨基或羧基末端至少具有另外一个氨基酸残基的抗血管生成蛋白质。例如，本文所述，利用本文所述的方法表达的内抑制素在内抑制素的5’末端具有另外两个氨基酸残基。(参见图5)这另外两个氨基酸残基是谷氨酸(E)和苯基丙氨酸(F)。另外，其它氨基酸残基可以含有抗血管生成蛋白质(参见图5和25)。重要的是，其它的氨基酸或其它的多个氨基酸没有危及抗血管生成蛋白质的活性。事实上，本文叙述的方法生产的抗血管生成蛋白质显示了比其它表达方法生产的抗血管生成蛋白质更良好的生物活性。通常，在这一实施方案中生产的抗血管生成的蛋白质的浓度约为每升培养基10-20毫克。
在本发明的另一个实施方案中，真核载体包括具有组氨酸标记基序的酵母载体。正如本文所述的一个方法其中利用了pPICzαA，其中质粒含有具有His.Tag基序的多个克隆位点(在本文中，该质粒也称为pPICZαA/HIS)。另外也可以加入NdeⅠ位点或其它适当的限制位点修饰该载体。这样的位点是本领域已知的。这一实施方案生产的抗血管生成蛋白质包括具有一个或多个组氨酸通常约5-20个组氨酸的组氨酸标记基序(His.tag)。令人吃惊的是，这一His.tag没有危及抗血管生成活性。事实上，本文叙述的方法生产的抗血管生成蛋白质具有比其它表达方法生产的抗血管生成蛋白质更优越的生物活性。再次，生产的生物活性蛋白质的浓度通常约为每升培养基(液体)10-20毫克。
本发明也包括了结合起来的上面的实施方案。例如，选择的聚核苷酸可以包括接头，并且可以插入含有his.Tag基序的载体(参见图5和25)。
本发明也涉及本文叙述的方法生产的抗血管生成蛋白质，令人吃惊的是，本文叙述的方法生产的蛋白质是高产量生产的，并且具有足以测试这些蛋白质(完全地)抑制(或基本减少)不需要的血管生成活性的临床效力的生物活性。
本发明另外涉及的是本文叙述的方法生成的抗血管生成蛋白质的利用方法。例如，本文叙述的抗血管生成蛋白质可以用于测试治疗人恶性肿瘤的效力，其中这样的治疗将导致部分或整个肿瘤的退化。这些蛋白质也可以用于治疗如本文所述的不能令人满意的生成血管的其它疾病。
本发明另外涉及的是含有有效量的本文叙述的方法生产的抗血管生成蛋白质和可药用载体的组合物。本文叙述了有效量的抗血管生成蛋白质，通常是足以抑制内皮活性如内皮细胞迁移，抑制肿瘤生长，在细胞周期的G1期抑制内皮细胞和在内皮细胞中诱导细胞程序死亡的量。本文叙述了确定这些活性的测试方法。“ED50”是降低缺乏抗血管生成蛋白质时观察到的生物影响一半时抗血管生成蛋白质的量。比较例如在内皮细胞增殖测试方法中降低生物影响一半需要的抗血管生成的浓度是有用的生物活性测试方法，并且允许比较各个组合物。
本发明同时涉及的是利用本文叙述的抗血管生成蛋白质抑制不需要的血管生成活性的方法。本发明涉及的该方法可以抑制内皮细胞迁移，抑制哺乳动物中肿瘤生长，抑制细胞周期的G1期中的内皮细胞，和诱导内皮细胞中的细胞程序死亡。本发明的抗血管生成蛋白质特定地和可逆地抑制内皮细胞增殖。本发明的抑制剂蛋白质分子也可用于生育控制药物，和用于治疗其它有关血管生成的疾病，特别是依赖血管生成的癌症和肿瘤。
作为本文叙述的发明的结果，目前可以获得具有足够的生物活性的抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物和片断以及抗血管生成融合蛋白，用于研究和治疗血管生成疾病。这些抗血管生成化合物的出乎意料和惊人的治疗和减轻依赖血管生成癌症和肿瘤的能力给医学领域长期未满足的需要一个答案，并且给人类提供了重要的益处。
附图的简要说明
图1是巴斯德毕赤氏酵母表达载体的图解说明。
图2是修饰的巴斯德毕赤氏酵母表达载体的图解说明。
图3是利用本发明的巴斯德毕赤氏酵母表达载体系统克隆内抑制素的方案的图解说明。
图4描述了小鼠内抑制素序列和内抑制素突变EM1和EM2的序列。
图5是表示酵母构建体名称，引物序列，克隆位点，生产内抑制素的载体的图。同时表示了生产的蛋白质的蛋白质序列。HTH→endo表明了小鼠内抑制素氨基酸序列。AHSH→endo表明了人内抑制素氨基酸序列。
图6A表示利用Ni-NTA柱纯化重组小鼠内抑制素。在变性条件下纯化了蛋白质。在Ni-NTA柱上加载了含有8M脲的可溶蛋白质。并且通过降低洗脱缓冲液的pH洗脱结合的蛋白质。(i)洗脱缓冲液的pH。(o)在280纳米的吸光值。
图6B表示了利用10％SDS-PAGE分析纯化的小鼠内抑制素蛋白质。千道尔顿标记低分子量蛋白质标准。分析了来自每个洗脱点的101个选择的组分。除了观察到预期的22-24千道尔顿的蛋白质，也观察到了对应于46和69千道尔顿的相当量的高分子量复合物。当利用DTT还原蛋白质时，所有高分子量复合物转化成对应于22-44千道尔顿的单体亚单位。
图7A表示了利用肝素琼脂糖柱纯化酵母中表达的可溶小鼠内抑制素。分批加载来自一升培养物的浓缩的上清液。利用从0.3，0.6，1和2M的NaCl的逐步的梯度从柱中洗脱结合的内抑制素。以每管2毫升收集洗脱的组分。(i)NaCl的浓度。(o)280纳米处的吸光值。
图7B表示了利用12％的SDS-PAGE，千道尔顿标记低分子量标准电泳分析从肝素-琼脂糖柱纯化的重组可溶小鼠内抑制素。纯化的蛋白质成对应于20千道尔顿的单一带迁移。利用10微升选择的组分的等分试样分析洗脱的蛋白质的纯度。
图8A表示了利用Ni-NTA柱纯化在酵母中表达的可溶His.内抑制素，来自Ni-NTA柱的洗脱方案。利用逐步的咪唑梯度(10，25，50和100毫摩尔/升)从柱中洗脱结合的蛋白质。(i)咪唑的浓度。(o)在280纳米处的吸光值。
图8B表示了选择的组分的12％的非还原SDS-PAGE。千道尔顿标记-低分子量标准。纯化的重组His.内抑制素成对应于22-24千道尔顿的单一带在50毫摩尔/升的咪唑中迁移，而100毫摩尔/升的咪唑的洗脱显示出具有对应于44-46千道尔顿的痕量的高分子量复合物。
图9表示了内皮细胞增殖测试的结果。测试了酵母中表达的纯化的小鼠内抑制素的抑制在C-PAE细胞中掺入(甲基-3H)胸腺嘧啶的能力。利用3纳克/毫升的bFGF作为刺激物。每个值是来自代表实验的三份培养物的平均值，误差条表示标准偏差。在对照培养物中的DNA合成认作100％。在相同的条件下重复实验4-5次。
图10表示了利用不同浓度的内抑制素抑制内皮细胞的迁移。每个实验进行两次。在每个孔中，在三个不同的面积中计算迁移的细胞的数目，获得平均值。每个值是来自代表实验的平均值，误差条代表标准偏差。
图11A和11B表示了内抑制素抑制了VEGF(11A)和BFGF(11B)介导的血管生成应答。在尼龙网上加不同浓度的内抑制素，如本文所述确定微管的生长。对照阴性对照将所有计数标准化。
图12表示了在内皮增殖测试中利用多克隆抗血清中和小鼠内抑制素的抑制效果。将C-PAE细胞以24，500个细胞/孔播种到24孔纤连蛋白包衣的平板中。将重组内抑制素(10微克/毫升和5微克/毫升)与过量的内抑制素的多克隆抗血清或免疫前或对照的IgG在RT时混合1小时。然后，在存在3克/毫升bFGF时在C-PAE细胞中加入混合物。加入1居里/孔3H-胸腺嘧啶测量DNA合成。每个值是来自三份培养物的平均值。误差条代表标准偏差。
图13A表示利用重组内抑制素系统治疗抑制786-0肿瘤生长。当肿瘤体积大约350-400立方毫米时，利用重组内抑制素治疗携带786-0肿瘤的无胸腺裸鼠。每天以10毫克/公斤给予腹膜内注射内抑制素。在另外的日子对尾铗测量肿瘤大小，利用标准公式宽度平方×长度×0.52计算肿瘤体积。在每组中每个时间点代表来自5个不同小鼠的平均值，误差代表平均标准偏差(S.E.M.)。(o)对照PBS； 来自细菌的His.内抑制素；(-)来自细菌的His.EMI；(●)来自细菌的His.内抑制素。
图13B显示了带有780-0肿瘤细胞的无胸腺裸鼠，在肿瘤体积大约150-200立方毫米时，利用重组内抑制素治疗的结果。每天以20毫克/公斤给予腹膜内注射内抑制素。在另外的日子对尾铗测量肿瘤大小，利用标准公式宽度平方×长度×0.52计算肿瘤体积。在每组中每个时间点代表来自5个不同小鼠的平均值，误差代表平均标准偏差(S.E.M.)。(o)对照PBS； 来自细菌的His.内抑制素； 来自细菌的His.EM I；(●)来自细菌的His.EM2。
图14A表示了利用肝素琼脂糖柱纯化在巴斯德毕赤氏酵母中表达的可溶人内抑制素。X轴是组分的号，Y轴是280纳米处的吸光值。利用0.2M到1.0M的NaCl的梯度逐步从柱中洗脱结合的endistatin。箭头表示用于洗脱的NaCl的浓度(在组分1开始为0.2MNaCl，在约组分15-16开始为1M)。有2毫升每个组分收集洗脱的蛋白质。观察到两个明显的峰，一个约在组分4，另一个约在组分20-23。
图14B表示了利用12％SDS-PAGE凝胶电泳分析从肝素琼脂糖柱洗脱的纯化重组人内抑制素。千道尔顿大小标记在左边。表示了6道。道1含有标记；道2，粗蛋白质；道3，洗液；道4，利用0.2M NaCl洗脱的组分3；道5和6，分别是从组分19和20的洗脱物，它们是利用1MNaCl洗脱的。
图15A和15B是表示在HUVE细胞(图15A)和HMEV-L细胞(图15B)中内抑制素介导的内皮细胞生长的抑制的条块图。每个图的X轴表示纳克/毫升的重组蛋白质的浓度，Y轴表示与对照比较的3H胸腺嘧啶的掺入百分数。亮的和阴影条块分别表示人和小鼠内抑制素。
图16A表示人内抑制素处理HUVE细胞特定地影响S期的细胞。利用范围0.5毫克/毫升到20毫克/毫升的不同浓度的人内抑制素处理生长停滞的HUVE细胞。在1％FCS中生长细胞，并且利用3纳克/毫升bFGF刺激细胞。
图16B和16C表示利用10微克/毫升人内抑制素处理非内皮IMR-90(b)和Wi-38(c)细胞，并且如本文的方法进行。
图16D表示利用10微克/毫升人内抑制素处理HUVE细胞，并且在处理后15，18，24和32小时收集处理的细胞。
图17是表示接触不同浓度的内抑制素对内皮细胞迁移的抑制的条块图。X轴是不同的处理(对照，对照+bFGF，10，5，2.5，1，0.5和0.1微克/毫升的内抑制素)，Y轴表示关于表示的各个实验的细胞数。每个值是来自表示的各个实验的平均值，误差条表示标准偏差。
图18A-B表示在赖氨酸琼脂糖4B柱上纯化小时制管张素的结果。
图19表示利用小鼠制管张素测试内皮增殖的结果。
图20是重组小鼠制管张素对肾癌细胞系786-0的生长的影响。在X轴表示了时间(在处理后的天数)，Y轴表示肿瘤的体积。相对重组小鼠制管张素处理的肿瘤(实心线)，对照肿瘤的生长(点线Ⅰ)表示出生长增强。
图21A-B表示了在赖氨酸琼脂糖柱上人制管张素的纯化。
图22描述了静息蛋白和静息蛋白M2的核苷酸序列。
图23描述了静息蛋白氨基酸序列。
图24是在毕赤氏酵母表达系统中克隆静息蛋白的图解说明。
图25是表示构建体名称，引物序列，克隆位点，和生产静息蛋白和静息蛋白突变体的图，静息蛋白的氨基酸和突变的静息蛋白(Apomigre，本文也称为静息蛋白-M2)序列也表示了。“…静息蛋白”表示静息蛋白氨基酸序列。
图26表示了在迁移测试中静息蛋白的影响结果。
图27表示在肿瘤生长中静息蛋白的影响的结果。利用的静息蛋白和内抑制素的浓度是10毫克/公斤。
本发明的详细描述根据本发明，提供了有效地调节血管生成，和抑制不需要的血管生成，特定地有关肿瘤生长的血管生成的组合物和方法。
本发明特定地包括生产抗血管生成蛋白质，特定地包括制管张素，内抑制素和静息蛋白，其突变体，衍生物，片断和融合蛋白质的方法。当在大肠杆菌中生产时，制管张素，内抑制素，和静息蛋白可能污染内毒素或可能变性(即，蛋白质可能不恰当地折叠)。从血清分离或在哺乳动物细胞中生产这些蛋白质的天然形式导致蛋白质可变，并且抗血管生成活性水平经常非常低，同时导致这些蛋白质的产量较低。但是，正如本文所述，在本发明的酵母表达系统中生产这些蛋白质导致每升培养物中的蛋白质产量为10-20毫克。
本发明的酵母表达系统利用的是毕赤氏表达系统(In Vitrogen，圣迭戈，CA)。巴斯德毕赤氏酵母是能够利用甲醇作为碳源的甲烷营养酵母菌株。该表达系统具有真核表达系统的优点，包括蛋白质加工，蛋白质折叠，翻译后修饰，并且适用于大规模发酵过程。这一系统能够高水平表达异源蛋白质。在一个实施方案中，该系统利用了含有组氨酸标记基序的载体。但是，也可以利用其它适当的酵母表达系统，并且可以利用标准技术修饰载体使含有组氨酸标记基序。或者，利用本文所述的接头修饰待表达的选定蛋白质。在编码蛋白质的聚核苷酸序列中加入接头是本领域已知的。在实施例中详细描述了本发明的方法的特定步骤。
本文所用的术语“载体”指可能含有或结合特定核苷酸序列(聚核苷酸)的载体，它的功能是将特定的核酸序列转移进入细胞。载体的例子包括质粒和感染性微生物，如病毒，非病毒载体如配体-DNA共轭物，脂质体，脂DNA复合物。令人满意的是含有抗血管生成的蛋白质抑制剂DNA序列的重组DNA分子可操作地连接表达控制序列形成了能够表达蛋白质的表达载体。
“载体”在本文也指复制子，其中连接了另一个聚核苷酸区段，以致引起连接的区段的复制和/或表达。正如本文所用，“复制子”指行为如细胞内的聚核苷酸复制的自动单位的任何遗传元素如质粒，染色体或病毒。
术语“控制序列”指达到控制序列连接的编码序列的表达必须的聚核苷酸序列。这样的控制序列的特性根据寄主生物体的不同而不同。在真核生物中，这样的控制序列通常包括启动子，终止子和在一些情况中的增强子。所以，术语“控制序列”打算包括表达必须存在的最少的所有成分，并且也可以包括其存在是有利的其它成分如引导序列。
“可操作地连接”指其中所述的成分处于允许它们以打算利用的方式起作用的关系中的情况。所以，例如，“可操作地连接”编码序列的控制序列是以在与控制序列相容的条件下达到编码序列的表达的方式连接。
术语“开放读码框架”或“ORF”指编码多肽的聚核苷酸序列的区域。这一区域可以代表部分编码序列或整个编码序列。“编码序列”是当放置于适当的调节序列的控制下，转录成mRNA并且翻译成多肽的聚核苷酸序列。通过在5’末端的翻译起始密码和3’末端的翻译终止密码确定编码序列的边界。编码序列可以包括，但不限于mRNA，cDNA和重组聚核苷酸序列。
术语“转化”指无论插入利用的方法如何，在寄主细胞中插入外源聚核苷酸。例如，包括直接吸入，转导或f匹配。作为非整合载体例如质粒可以维持外源聚核苷酸，或者可以整合进入寄主基因组。
“重组寄主细胞”，“寄主细胞”，“细胞”，“细胞系”，“细胞培养物”和其它这样的关于作为单细胞整体培养的微生物或高等真核细胞系的术语指，可以或已经用作重组整体或其它转移DNA的受体，并且包括已经转染的原始细胞的原始子代。
正如本文所用的术语“分离”指从原始环境(例如，如果它是天然存在的天然环境)中移取的物质。例如，在活动物中存在的天然存在的聚核苷酸或多肽不是分离的，但从天然系统中的一些或所有共存物质中分离的同样的聚核苷酸或DNA或多肽是分离的。这样的聚核苷酸可以是部分载体，和/或这样的聚核苷酸或多肽可以是部分组合物，并且仍然是分离的，因为载体或组合物不是天然环境的部分。
“纯化”或“分离”的聚核苷酸指基本游离的，即含有少于约505，优选地少于约705，更优选地少于约90％的聚核苷酸天然结合的蛋白质的需要的聚核苷酸或其片断。纯化需要的聚核苷酸的技术是本领域已知的，包括例如利用离液剂裂解含有聚核苷酸的细胞，和通过离子交换层析，亲和层析，或密度沉降分离聚核苷酸和蛋白质。
术语“引物”指与靶核苷酸序列互补并且用于与靶核苷酸序列杂交，和作为DNA聚合酶，RNA聚合酶或逆转录酶催化的核苷酸多聚化的起始点的特定的低聚核苷酸序列。
如本文所用的“重组多肽”至少指没有通过它本身或操作结合天然中结合的多肽的全部或部分和/或连接不是它在天然时连接的多肽的多肽的多肽。重组或派生的多肽不必定从指定的核酸序列翻译而成。它也可以以任何方式包括化学合成或重组表达系统的表达生产。
本文所用的“多肽”指氨基酸的分子链，而没有指产物的特定长度。所以，在多肽的定义中包括了肽，低聚肽和蛋白质。这一术语也打算指多肽的表达后修饰，例如，糖基化，乙酰化，磷酸化等。“纯化的多肽”指基本游离，即含有少于约50％，优选地少于约70％，和更优选地少于90％需要的多肽天然结合的细胞成分的需要的多肽或其片断。纯化的方法是本领域已知的。
本发明特定地包括生产已经命名为“制管张素”的蛋白质的方法，其中该蛋白质是通过它体外克服内源生长因子如bFGF的血管生成活性，和它与约在纤溶酶原氨基酸98开始的纤溶酶原的内部部分的氨基酸序列同源性和结构相似性定义的(参见，例如，美国专利5，801，012，美国专利5，837，682，美国专利5，733，876，美国专利5，776，704，美国专利5，639，725，美国专利5，792，845，WO96/035774，WO95/29242，WO96/41194和WO97/23500)。制管张素含有具有如还原聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的约38千道尔顿和45千道尔顿之间的分子量并且具有基本相似于完整小鼠纤溶酶原分子的氨基酸98开始的小鼠纤溶酶原的片断的氨基酸序列的蛋白质(O’Reilly，M.S.，等人，细胞79315-328(1994)，全部内容引入本文作为参考)。
制管张素的氨基酸序列在种类之间轻微变化。例如，在人制管张素中，其氨基酸序列基本相似于上面叙述的小鼠纤溶酶原片断的序列，虽然有活性的人制管张素序列可以在完整的人纤溶酶原氨基酸序列的氨基酸97或99开始。另外，如在小鼠肿瘤模型中所示，人纤溶酶原的片断具有相似的抗血管生成活性。有待理解的是活性制管张素分子的氨基酸的数目可以有变化，并且涉及了具有内皮抑制活性的所有氨基酸序列，这些序列包括在本发明中(参见，例如，美国专利5，801，012，美国专利5，837，682，美国专利5，733，876，美国专利5，776，704，美国专利5，639，725，美国专利5，792，845，W096/035774，WO95/29242，WO96/41194和WO97/23500)。
制管张素也定义为具有约38到45千道尔顿的分子量，能够体外克服内源生长因子的血管生成活性的蛋白质。制管张素是具有如还原聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的约38千道尔顿和45千道尔顿之间的分子量并且具有基本相似于完整小鼠纤溶酶原分子的氨基酸98开始的小鼠纤溶酶原片断的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白质。
术语“基本相似于”当参照制管张素氨基酸序列使用时，指具有抗血管生成活性和具有约38到45千道尔顿分子量的氨基酸序列，该氨基酸序列与小鼠纤溶酶原的氨基酸98开始的小鼠纤溶酶原的肽片断具有高度的序列相似性或同一性，分子量约为38到45千道尔顿。
如本文所用，“序列同一性”指两个多聚体分子例如两个聚核苷酸或两个多肽之间的亚单位序列相似性。当在两个分子的亚单位位置是由相同的单体亚单位占据，例如，如果在两个肽的中的相同位置占据的都是丝氨酸，那么它们在那个位置相同。两个序列的同一性是匹配的或相同位置的数的直接函数，例如，在两个肽或化合物序列中的一半(例如，在多聚体的10个亚单位的长度中的5个位置)位置是相同的，那么两个序列是50％相同；如果90％的位置例如10个的9个匹配，两个序列拥有90％的序列同一性。例如，氨基酸序列VRGLQP和HAFLQP的6个位置中3个相同，所以具有50％的序列同一性，而序列VRGLQP和AFLQP的5个位置具有3个相同，所以具有60％的序列同一性。两个序列之间的同一性是匹配或相同位置的数的直接函数。所以，如果在特定的肽中缺失了参照序列的一部分，为了计算序列同一性，缺失的部分不计算在内，例如，VRGLQP和VRGLP的6个位置中5个相同，所以具有83.3％的序列同一性。
经常利用序列分析软件例如，BLASTN或BLASTP(在网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/可得到)测定同一性。通过BIASTN(核苷酸序列)比较两个序列(例如，“Blast”两个序列，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html)获得的缺席参数是匹配=1，错配的罚分=0，开放的裂口=5和延长的裂口=2。当将BLASTP用于蛋白质序列时，缺席参数是，匹配=0，错配的罚分=11，开放的裂口=11，和延长的裂口=1。
当两个序列拥有“序列同源性”时，指两个序列只有通过保守取代相互区别。对于多肽序列，这样的保守取代包括利用该序列中给定位置的一个氨基酸取代相同类别的序列的另一个氨基酸(例如，拥有疏水性，电荷，pK或其它构型或化学特性的氨基酸，例如，缬氨酸取代亮氨酸，精氨酸取代赖氨酸)，或利用定位于不改变多肽的构型或折叠到破坏多肽的生物活性的程度的序列的位置上利用一个或多个非保守氨基酸取代，缺失非保守氨基酸或插入一个或多个非保守氨基酸。假如多肽具有需要的生物活性，“保守取代”的例子包括一个非极性(疏水)残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个；一个极性(亲水)残基取代另一个如在精氨酸和赖氨酸之间取代，在谷氨酰胺和天冬酰胺之间取代，在甘氨酸和丝氨酸之间取代；或利用一个酸性残基，如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个；或利用化学衍生残基取代非衍生残基。拥有序列同源性的两个序列可以称为“序列同系物”。含有化学派生残基的多肽是参照多肽的“化学衍生物”。
通常利用序列分析软件(例如，基因计算机集团，威斯康星大学生物技术中心，大学大道1710，麦迪生，WI53705的序列分析软件包)测定多肽的同源性。蛋白质分析软件通过测定相似序列的各种取代，缺失和其它修饰指定同源性的测定匹配相似序列。保守取代通常包括在下面基团内的取代；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
同样，本发明包括制造内抑制素的方法。术语“内抑制素”指如非还原和还原凝胶电泳分别测定的大小优选地是18千道尔顿到20千道尔顿的蛋白质(O’Reilly，M.S.，等人，细胞，88277-285(1997)，全部内容引入本文作为参考)。术语内抑制素也包括18千道尔顿到20千道尔顿蛋白质的前体形式。内抑制素也包括18到20千道尔顿蛋白质的和修饰蛋白质和具有基本相似的氨基酸序列的肽的片断，并且它能够抑制内皮细胞的增殖。例如，其中利用结构或化学相似的氨基酸取代氨基酸没有明显改变蛋白质的结构，构型或活性的沉默氨基酸取代是本领域已知的。这样的沉默取代是在本发明的范围内的。
内抑制素的N末端氨基酸序列对应于小鼠胶原α1型ⅩⅧ中发现的在氨基酸1105开始和在氨基酸1124结束的20个内部氨基酸的肽片断(参见，例如，美国专利5，801，012，美国专利5，837，682，美国专利5，733，876，美国专利5，776，704，美国专利5，639，725，美国专利5，792，845，WO96/035774，WO95/29242，WO96/41194和WO97/23500)。抑制剂的N末端氨基酸序列也对应于人胶原α1型ⅩⅧ中发现的氨基酸1132开始和氨基酸1151结束的20个内部氨基酸肽片断。同样包括在本发明是如美国专利申请U.S.S.N.XX/XXX，XXX和1998年11月8日Vikas P.Sukhatme递交的专利“抗血管生成肽和其利用的方法”中所述的内抑制素突变体，这些专利的全部引入本文作为参考。如本文所述可以测定这些突变体的生物活性，并且将这些突变体的生物活性与“野生型”内抑制素，或其它方法产生的内抑制素的生物活性比较。
从小鼠血管内皮瘤EOMA可以分离内抑制素。从重组来源，从移植入动物的遗传上改变的细胞，从肿瘤，从细胞培养物以及其它来源可以生产内抑制素。从体液包括，但不限于血清，鸟和腹水可以分离或通过化学或生物的方法(例如，细胞培养，重组基因表达，肽合成，和体外前体分子的酶催化生产活性内抑制素)可以合成内抑制素。重组技术包括来源聚合酶链式反应(PCR)从DNA来源基因扩增和来源逆转录酶从RNA来源基因扩增。
同样包括在本发明中的是生产静息蛋白的方法。本申请人已经发现U.S.S.N.XX/XXX，XXX和Vikas P.Sukhatme1998年11月8日递交的美国专利申请“静息蛋白和其利用方法”中所述的新的蛋白质分子类型，这些专利全部引入本文作为参考，静息蛋白当体外加入增殖的内皮细胞时具有抑制内皮增殖的能力。因此，这些蛋白质分子和静息蛋白突变体已经在功能上定义为静息蛋白，但是，应当理解的是这一功能性定义没有限制静息蛋白在体外或体内都抑制内皮细胞生长的生物活性。静息蛋白的许多其它的功能是可能的。静息蛋白是蛋白质水解片断，和胶原XV家族的部分。(参见图22-23)。静息蛋白蛋白质约为20千道尔顿胶原XV的C末端片断，并且没有肝素亲和力。同样，本发明特定的包括了这些片断或静息蛋白突变体。
如标准测试中确定的，我们发现命名为“Apomigren”的一个这样的片断具有等同于或超过人或小鼠内抑制素的抗血管生成活性。apomigren含有SEQ ID NO20的从约氨基酸97到约氨基酸181的静息蛋白本身的最后约85个氨基酸残基，序列20如下IYS GDG RKI MTD PSW PQK VIW HGS SPH GVR LVDNYC EAW RTA DTA VTG LAS PLS TGK ILD QKA YSC ANRLIV LCI ENS FMT DAR K所以，编码Apomigren的聚核苷酸序列对应于SEQ ID NO的约核苷酸289到约核苷酸543，并且利用正向引物5’-AAGAAT GCG GCC GCT TAC TTC CTA GCG TCT GTC ATG AAACTG TTT TCG AT-3’(SEQ ID NO)和与静息蛋白(SEQ IDNO)利用的相同的反向引物可以扩增出SEQ ID NO。如静息蛋白本身进行的，进行Apomigren的克隆和表达，其说明在下面的实施例中。Apomigren在治疗血管生成疾病中提供的优点因为根据重量原理，较小的肽日义具有潜力，并且可以更好地渗透组织。
令人满意的是术语“制管张素，内抑制素和静息蛋白”包括更短的蛋白质或肽，本文称为突变体或片断，其中从内抑制素的两个末端或从蛋白质的内部区除去一个或多个氨基酸，得到的分子仍然保留了内皮增殖抑制活性。术语“制管张素，内抑制素和静息蛋白”也包括其中在内抑制素的两个末端，或在蛋白质的内部位置加入一个或多个氨基酸，得到的分子仍然保留内皮增殖抑制活性的加长的蛋白质或肽。对于用于测试的如125I的放射性碘化的标记，例如在第一个位置具有加入的酪氨酸的这样的分子是有用的。利用其它放射性同位素的标记可以用于提供破坏含有内抑制素受体的靶细胞的分子工具。利用如蓖麻蛋白的分子的其它标记可以提供破坏具有抗血管生成蛋白质受体的细胞。
同样包括在术语“制管张素，内抑制素和静息蛋白”的定义中的有蛋白质，它的亚单位和肽片断的修饰。这样的修饰包括利用其它分子包括但不限于天然或非天然存在的氨基酸在特定的位点取代天然存在的氨基酸。这样的取代可以修饰抗血管生成蛋白质的生物活性，并且生产生物或药物拮抗剂或拮抗物。修饰也可以包括在蛋白质序列内的修饰的氨基酸，或抑制蛋白酶活性，或修饰成增强蛋白质的稳定性和降低蛋白质降解的完整蛋白质序列。这样的修饰是本领域技术人员已知的。参见例如，U.S.S.N.08/988，842，全部引入本文作为参考。
本文中修饰的蛋白质也指派生蛋白质或类似物。术语“衍生物”或“类似物”包括具有与本文特定地表示的序列基本相同的氨基酸残基的序列的蛋白质/多肽，在该蛋白质/多肽中，已经利用功能相似的残基保守地取代一个或多个残基，并且该蛋白质/多肽具有本文描述的活性。保守的取代的例子包括一个非极性(疏水)残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个，一个极性(亲水)残基取代另一个，如在精氨酸和赖氨酸之间，在谷氨酰胺和天冬酰胺之间，在甘氨酸和丝氨酸之间，一个碱性残基如赖氨酸，精氨酸或组氨酸取代另一个，或一个酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个。
假如这样的多肽具有需要的抑制活性，术语“保守取代”也包括利用化学派生的残基取代非派生残基。
“化学衍生物”指具有一个或多个功能性侧基团的反应化学派生的残基的主体多肽。这样派生的分子包括例如其中游离氨基酸已经派生形成盐酸胺，对甲笨磺酰基团，苄氧羰基基团，正丁氧羰基基团，氯乙酰基团或甲酰基团的那些分子。游离羧基可以派生形成盐，甲基和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离的羧基基团可以派生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以派生形成N-im苯基组氨酸。同时作为化学衍生物包括其中的是含有20个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；和鸟氨酸可以取代赖氨酸。本发明的多肽也包括相对于本文表示了序列的多肽的序列具有一个或多个残基的加入和/或缺失的多肽，只要保持了需要的活性。
本发明也涉及与本文所示的蛋白质的序列类似的氨基酸残基序列，和编码这些蛋白质的核酸序列。本领域已知，没有基本改变蛋白质的生物学功能修饰和变化是允许的。在进行这样的变化时，可以在侧链的取代基的例如，它们的大小，电荷，疏水性，亲水性等等相对相似的基础上进行氨基酸残基的取代。可以改变所述的类型增强肽的酶解或药物动力学的潜力或稳定性。所以，本发明的范围确认的序列包括其中变化没有改变前面提到的抗血管生成蛋白质，衍生物，突变片断和/或融合蛋白质的功能特性和生物活性的氨基酸残基序列或类型中的变化为特征的那些类似序列。
本发明的抗血管生成融合蛋白质包括含有本文所述的一个或多个蛋白质，突变体，衍生物或片断以及其它本领域已知的抗血管生成的分子。例如，编码与静息蛋白连接的内抑制素的聚核苷酸可以编码本发明包括的融合蛋白质，其中表达的融合蛋白质具有内抑制素和静息蛋白的活性，导致融合蛋白质的生物活性比单体野生型内抑制素或静息蛋白都增强许多。本发明包括的另一类型的融合蛋白质可以是编码串联，通过接头非强制性地连接的两个静息蛋白分子编码的聚核苷酸编码的融合蛋白质。再次，可以合理地推测融合蛋白质比单体静息蛋白具有更高的活性。
本发明的抗血管生成融合蛋白质的其它例子包括蛋白质的共轭物。这样的融合蛋白质能够或不能够裂解成它们由此派生的独立的蛋白质。正如本文所用，术语“抗血管生成蛋白质的共轭物”指与另一个蛋白质化学地偶联的抗血管生成蛋白质，形成共轭物。共轭物的例子包括与白蛋白或与例子另一个抗血管生成蛋白质的肽片断偶联的蛋白质片断。
正如本文所用，术语“抗血管生成活性”指分子抑制血管生长的能力。正如本文所用，术语“内皮抑制活性”指分子一般性地抑制血管生成，和例如在存在成纤维细胞生长因子或其它已知的生长因子时，抑制培养中的小牛毛细血管内皮细胞的生长或迁移的能力。当测试它的“内皮抑制活性”时，在测定潜力的基础上可以鉴定本发明的抗血管生成蛋白质，突变体，衍生物，片断或融合蛋白质。其它内皮抑制活性的测定方法也在本文描述了。
在治疗血管生成介导或包括血管生成的疾病或过程中本发明的抗血管生成蛋白质是有效的。本发明包括另一本文叙述的方法生产的抗血管生成的蛋白质，生物活性突变体，衍生物，片断或其融合蛋白质或总的来说具有抗血管生成活性或抗血管生成拮抗剂和拮抗物的活性的蛋白质的联合的有效量治疗血管生成介导的疾病的方法。
正如本文所用，术语“血管生成”指在组织或器官中生成新所血管，并且包括内皮细胞增殖。在正常的生理条件下，哺乳动物(人或动物)只在非常特定的限制情况中发生血管生成。例如，通常在伤口愈合，胎的和胚的发育，和黄体，子宫内膜和胎盘的形成时观察到血管生成。术语“内皮”指位于浆液腔，淋巴管，血管的扁平上皮细胞的薄层。
正如本文所用，术语“血管生成相关因子”指抑制或促进血管生成的因子。血管生成相关因子的一个例子是血管生成生长因子，如基本成纤维细胞生长因子(bGFG)，它是血管生成促进剂。血管生成相关因子的另一个例子是血管生成抑制因子如制管张素。正如本文所用，术语“生长因子”指刺激细胞的生长，再生，或合成活性的分子。
血管生成介导的疾病包括但不限于，固体肿瘤；血液产生的肿瘤如白血病；肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤，听觉神经瘤，神经纤维瘤，粒性结膜炎，脓性肉芽瘤；类风湿关节炎；牛皮癣；眼的血管生成疾病，例如，糖尿病性视网膜病，早熟的视网膜病，斑点退化，角膜移植排斥，新血管性青光眼，晶状体后的纤维组织形成，发红；Osler-Webber综合症；心肌的血管生成；斑新血管化；毛细血管扩张；血友病患者的关节；血管纤维瘤；和伤口发生肉芽。过量或正常刺激内皮细胞，制管张素可以用于治疗疾病。这些疾病也包括，但不限于，肠粘连，局限性回肠炎病，动脉粥样硬化，硬皮病和肥大性伤疤，即疤痕疙瘩。通过预防胚移植需要的血管化，本文叙述的抗血管生成的蛋白质也可以用作生育控制剂。这些蛋白质也可以用于治疗血管生成为病理结果的疾病如猫抓伤病(Rochele minaliaquintosa)和溃疡(幽门螺旋杆菌)。
正如本文所用，术语“癌症”指依赖血管生成的癌症和肿瘤，即生长(体积和/或重量的扩增)需要供应它们血液的血管的数目和密度的增加的肿瘤。更具体地说，如本文所用，术语“癌症”指不正常细胞发育的肿瘤性生长，增生性或增殖性生长或病理状态，并且包括固体肿瘤，非固体肿瘤，和任何不正常细胞增殖如白血病中可见的。“退化”指如利用标准技术测定的肿瘤重量和大小的减少。给药和剂量本发明的方法生产的抗血管生成蛋白质可以组合物使用，其中蛋白质结合药学可接受载体。这样的组合物也可以含有(除了蛋白质和载体)稀释剂，填充剂，盐，缓冲液，稳定剂，增溶剂和其它本领域已知的其它物质。术语“药学可接受”指不干扰活性成分的生物活性的效力的非毒性物质。载体的特征将取决于给药的途径。
本发明的组合物也可以含有其它抗血管生成蛋白质或化学组合物如内抑制素，制管张素，静息蛋白，突变体，衍生物，片断或其类似物。该组合物可以进一步含有增强蛋白质的活性或维护它的活性或用于治疗的其它试剂，如化学治疗或放射性试剂。这样的附加因子和/或试剂可以包括在组合物中，产生协同本发明的蛋白质的影响，或减少副作用。另外，本发明的组合物的给药可以与其它治疗共同施用，例如与化学治疗或放射性治疗方中结合给药。
本发明的蛋白质在多聚体(例如杂合二聚体或同型二聚体)或与她本身或其它蛋白质的复合物中可以是活化的。结果，本发明的组合物可以含有多聚体或复合物形式中的本发明的蛋白质。这样的多聚体或复合物在延长循环中抗血管生成蛋白质的半衰期中特别有用。两者必具其一地，因为副作用，系统地给药抗血管生成蛋白质可能不能令人满意也可能令人满意。在这种情况下，将抗血管生成蛋白质与靶试剂结合对于将抗血管生成蛋白质递送(靶击)到特定的组织或器官是有用的。例如，抗血管生成蛋白质可以含有靶击特定细胞表面受体的肽(例如，靶击微管结构的VEGF)。这样的靶击分子是本领域技术人员已知的。
本发明的组合物可以是脂质体的形式，其中除了结合其它药学可接受载体，本发明的蛋白质结合了两亲性试剂如以共聚形式如水溶液中的微团，不溶的单层，液晶或多层存在的脂。脂质体配方中的适当的脂包括但不限于甘油单酯，甘油二酯，硫酯，溶血卵磷脂，磷脂，皂苷，胆酸等等。这样的脂质体配方的制备如美国专利4，235，871；美国专利4，501，728；美国专利4，837，028；和美国专利4，737，323公开的是本领域的水平内的，这些专利引入本文作为参考。
如本文所用，术语“治疗有效量”指足以显示出对病人的明显益处即治疗，治愈，预防或改善有关的医学症状或增强治疗，治愈，预防或改善这样的病症的药物组合物的每种活性成分或方法的总量。当用于单独给药的单个活性成分时，该术语指那个单独的成分。当用于联合的成分时，不管结合起来，顺序或同时给药，该术语指这些活性成分的总共的量。
在本发明的治疗或使用方法的实践操作中，本发明的蛋白质是以治疗有效量对具有待治疗的病症的哺乳动物给药的。根据本发明的方法，单独或结合其它治疗可以给药本发明的抗血管生成蛋白质。这样的给药可以是同时的或按顺序的。如果按顺序给药，参加治疗的医护人员将决定给药本发明的蛋白质和其它因子的适当顺序。
正如本文所用，术语“原药物”指通过血液中的酶解，在体内快速转化产生亲本化合物的化合物。在T.Higuchi和V.Stella，作为新递送系统的原药物，ACS座谈会系列讨论的14卷，和在Edward B.Roche，在药物设计中的生物可逆载体，美国药学协会和Pemagon出版社，1987中提供了完全的讨论，这两篇文章引入本文作为参考。同样如本文所用，原药物可以包括为了变成活化的，需要在哺乳动物中加工的抗血管生成蛋白质，例如需要蛋白酶裂解产生具有抗血管生成活性的蛋白质的抗血管生成蛋白质。
在药物组合物中利用的本发明的蛋白质的给药或本发明的方法的实施可以各种常规方法，如口服摄食，吸入，局部应用或皮肤的，皮下的，腹膜内的，肠胃外的或静脉内注射进行。对病人静脉内给药是优选的。
当治疗有效量的本发明的蛋白质口服给药时，本发明的蛋白质的形式将是片剂，胶囊，粉末，溶液或配剂。当以片剂形式给药时，本发明的药物组合物可以另外含有固体载体如明胶或佐药。这些片剂，胶囊或粉末含有约5到95％的本发明的蛋白质，优选地含有约25到90％的本发明的蛋白质。当以液体形式给药时，可以加入液体载体如水，石油，动物或植物来源的油如花生油，矿质油，大豆油，或芝麻油或合成油。药物组合物的液体形式可以进一步含有生理盐溶液，葡聚糖或其它多糖溶液，或乙二醇如乙二醇，丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时，药物组合物含有0.5到90％重量的本发明的蛋白质，优选地含有约1到50％的本发明的蛋白质。
当通过静脉内，皮肤或皮下注射给药治疗有效量的本发明的蛋白质时，本发明的蛋白质将是无致热源，肠胃外可接受的水溶液形式。具有适当pH，等渗性，稳定性等等的肠胃外可接受的蛋白质溶液的制备是本领域的技术范围内的。优选的静脉内，皮肤，或皮下注射的药物组合物除了含有本发明的蛋白质，应该含有等渗载体如氯化钠注射液，林格注射液，葡聚糖注射液，葡聚糖和氯化钠注射液，乳化林格注射液或本领域已知的其它载体。本发明的药物组合物也可以含有稳定剂，防腐剂，缓冲液，抗氧化剂或其它本领域已知的添加剂。
在本发明的药物组合物中的本发明的蛋白质的量将取决于治疗的病症的特点或严重性，和取决于病人已经进行的过去的治疗的性质。最终，将由参加治疗的医护人员决定治疗每个病人的本发明的蛋白质的量。开始，参加治疗的医护人员将对病人给药低剂量的本发明的蛋白质并且观察病人的反应。可以增加本发明的蛋白质的给药剂量直到病人获得了最适的治疗效果，并且到那点，剂量不再进一步增加。应当提到的是，用于本发明的方法的实践中的各种药物组合物的给药剂量应该是每公斤体重0.01微克到100毫克(优选地约0.1毫克到约10毫克，更优选地约0.1毫克到约1毫克)的本发明的蛋白质。
根据正在治疗的疾病的严重性和每个病人的条件和潜在的特异的体质反应，来源本发明的药物组合物静脉内治疗的时间是不同的。我们注意到连续静脉内给药本发明的蛋白质的应用的时间的范围是12到24小时。最终将由参加治疗的医护人员决定来源本发明的药物组合物静脉内治疗的适当时间。
如本文所用，术语“肠胃外”指给药的方式，包括静脉内，肌肉内，腹膜内，胸内，皮下和关节内的注射和侵入。肠胃外注射的药物组合物包括用于在使用之前再构成无菌可注射溶液或分散体的药学可接受无菌水溶液或非水溶液，分散体，悬浮液或乳化剂。适当的水状和非水状载体，稀释剂，溶剂或载体包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等等)，羧甲基纤维素和其适当的混合物，植物油(如橄榄油)，和可注射有机酯如乙油酸。例如利用包被物质如卵磷脂，在分散体的情况中维持需要的颗粒大小和利用表面活性剂可以维持适当的液体性。这些组合物也可以含有佐药如防腐剂，加湿剂，乳化剂，分散剂。通过包入各种抗细菌和抗真菌剂，如对甲苯，氯丁醇，苯基抗坏血酸等等可以保证防止微生物作用。包含等渗试剂如蔗糖，氯化钠等等也是令人满意的。通过包入如延迟吸收的单硬脂酸铝和明胶的可以产生吸收延长的可注射药学形式。通过在可生物降解的多聚体如聚交酯-polyglycolide，聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成药物的微胶囊基质可以制造可注射的储存形式。根据药物与多聚体的比例和利用的特定的多聚体的特性，可以控制药物释放的速度。通过在与人体组织相容的脂质体乳化剂中埋入药物也可以制备可储存的可注射配方。通过在滞留细菌的过滤器上过滤或通过掺入在使用之前可以在无菌水或其它无菌可注射介质中溶解或分散的无菌固体组合物形式的无菌试剂可以灭菌可注射的配方。
本发明的化合物可以从无机或有机酸派生的药物可接受盐的形式使用。“药物可接受盐”指在医学判断的范围内，适用于与人和低等动物接触而没有毒性，刺激，变应性反应等等并且与合理的益处/危险比例相称的那些盐。药物可接受盐是本领域已知的。例如，S.M.Berge，等人在药学科学杂志(1977)661et seq中详细叙述了药物可接受盐该文献引入本文作为参考。在本发明的化合物的最后分离和纯化的过程中原位地或独立地通过将游离碱基官能团与适当的有机酸反应可以制备盐。代表性的酸加成盐包括但不限于，乙酸盐，己二酸盐，海藻盐，柠檬酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，酸式硫酸盐，丁酸盐，樟脑氨酸盐，樟脑磺酸盐，二葡糖酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，富马酸盐，盐酸盐，溴酸盐，碘酸盐，2-羟基甲基磺酸盐(羟乙磺酸盐)，乳酸盐，苹果酸盐，甲基磺酸盐，烟酸盐，2-萘基磺酸盐，草酸盐，扑酸盐，果胶酯酸盐，果胶酸盐，3-苯丙炔酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙炔酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，磷酸盐，谷氨酸盐，二碳酸盐，对苯磺酸盐和十一酸盐。同样，碱性含氮基团可以利用下面的试剂四位一体化低级烷基卤化物，如甲基，乙基，丙基和丁基氯化物，溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐如二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物如葵基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂基氯化物，溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物如苯基和苯乙基溴化物和其它。从而获得了水或油溶性的或可分散的产物。可以用于形成药物可接受酸加成盐的酸的例子包括如盐酸，氢溴酸，硫酸和磷酸这样的无机酸和如草酸，马来酸，琥珀酸和乙酸这样的有机酸。
局部给药可以适用于伤口愈合和组织修复。除了本发明的蛋白质，也可以非强制性地包括在如上所述的组合物中的治疗有用的试剂可以与本发明的方法中的组合物同时地或顺序地轮流或另外给药。
编码本发明的抗血管生成蛋白质，突变体，衍生物，片断和融合蛋白质的聚核苷酸也可以用于基因治疗。固定供应令人满意的抗血管生成的蛋白质(令人，慢性供应)支持了基因治疗的应用。为了在哺乳动物受试者中表达，这样的聚核苷酸可以在体内或来自体内地导入细胞。例如，含有编码抗血管生成蛋白质的适当载体可以导入骨髓，肌肉，肝或关节(在类风湿关节炎的情况中，蛋白质将在滑液中表达)。基因治疗的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利5，398，346，内容全部引入本文作为参考)。
为了在细胞或生物体中导入核酸(包括，但不限于病毒载体或裸DNA)，本发明的聚核苷酸也可以通过其它已知的方法给药。或者，为了增殖或在这样的细胞中的活性产生需要的影响，来自体内的细胞也可以在存在本发明的蛋白质时培养。然后，在哺乳动物中导入处理的细胞，在哺乳动物中表达了看血管生成蛋白质用于治疗。
本发明的蛋白质也可以用于免疫动物获得特异地与蛋白质反应的多克隆和单克隆抗体。这样的抗体可以利用整个蛋白质或其片断作为免疫原获得。肽免疫原另外可以在羧基末端含有半胱氨酸残基，并且与半抗原如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)接合。合成这样的肽的方法是本领域已知的，例如R.P.Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154(1963)；J.L.Krstenansky等人，FEBS Lett.211，10(1987)中所述。结合本发明的蛋白质的单克隆抗体可能是用于免疫检测本发明的蛋白质的有用的诊断试剂。结合本发明蛋白质的中和单克隆抗体对于与本发明的蛋白质相关的病症和在治疗包括本发明的蛋白质的不正常表达的一些形式的癌症也是有用的治疗剂。在癌细胞或白血病的情况中，中和抗本发明的蛋白质的单克隆抗体可能在检测和预防本发明的蛋白质介导的癌细胞的转移扩散中是有用的。
上面的使用方法是本领域已知的。公开这样的方法的参考文献包括但不限于“分子克隆实验室手册”第二版，冷泉港实验室出版，Sambrook，J.E.F.Fritsch和T.Maniatis编辑，1989，和“酶学方法分子克隆技术的指导”，学术出版社，Berger，S.L.和A.R.Kimmel编辑，1987。
本发明由下面的实施例说明，这些实施例不以任何方式限制本发明。实施例实施例1细胞系C-PAE，小牛肺动脉内皮细胞系，和ECV304，人内皮细胞系是从ATCC获得的(美国典型培养物保藏中心，10801大学大道，Manassas，VA，20110-2209，美国)获得的。在利用10％胎牛血清(FCS)，100单位/毫升青霉素，100克/毫升链霉素，和2毫摩尔/升的L-谷氨酰胺的M199中的DMEM和ECV34中维持C-PAE细胞系。HUVE(人脐静脉内皮细胞系)和HMVE-L(人微管内皮细胞(肺)细胞系)是从Clonetics公式(圣迭戈，加里弗尼亚，美国)购买的。在含有小牛脑提取物(3毫克/毫升)，hEGF(1O克/毫升)，羟基可的松(1克/毫升)，2％FCS，庆大霉素(50毫克/毫升，0.5毫升)，和两性霉素(50克/毫升)的EGM培养基中维持HUVE细胞。根据标准方法，在含有制造商建议的生长因子的EGM-2培养基中培养HMVE-L细胞(Clonetics，Inc.，CA制造商的指导)。酵母表达系统，巴斯德毕赤氏酵母(pPICZoA)是从InVitrogen(圣迭戈，加里弗尼亚，美国)购买的。限制酶和Vent DNA聚合酶是从新英格兰生物实验室(Beverly，Massachusetts，美国)购买的。IMR-90(ATCCCCL-186)和WI-38(ATCCCCL-75)，人成纤维细胞也是从ATCC购买的。
实施例2在原核系统中克隆和表达小鼠内抑制素内抑制素的序列表示在图4和5。利用Vent DNA聚合酶，通过PCR扩增编码小鼠胶原ⅩⅧ的羧基末端部分的序列。将内抑制素pBACPak8载体用作PCR扩增的模板。利用的引物如下5’-GGC-ATA-TGC-ATA-CTC-ATC-AGG-ACT-TT-3(SEQ ID NO)
5’-AAC-TCG-AGA-TTT-GGA-GAA-AGA-GGT-3’(SEQ IDNO)PCR进行了30个循环，每个循环的参数如下94℃变性，60％退火和70℃延长，前面每个1分钟。利用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA片断(555bp)，然后利用NdeI和XhoI消化。将消化片断连接入预消化的表达载体pET17bhis(Dhanabal，M.，Fryxell，D.K.和Ramakrishnan，S.(1995)免疫方法杂志182165-175)。最初的转化是利用HMS174寄主菌株进行的。对阳性克隆的两条链测序。最后，将需要的克隆转化进入BL21(DE3)表达。如制造商所述在pET系统中进行重组蛋白质的表达。
将Ni-NTA琼脂糖柱用于纯化重组蛋白质(图6A)。如O’Reilly等人所述，在8M脲中溶解内含体中存在的蛋白质并且在变性条件下纯化(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Shing，Y.，Fukai，N.，Vasios，G.，Lane，W.S.，Flynn，E.，Birkhead，J.R.，Olsen，B.R.和Folkman，J.(1997)细胞88277-285)。在非还原条件下，SDS-PAGE分析显示在22-24千道尔顿有分离的带。合并在不同pH洗脱的峰蛋白质，对浓度下降的脲透析，在PBS缓冲液pH7.4进行最后的透析，这时大多数蛋白质从溶液中沉淀了。因为从相同系统表达的非再折叠沉淀蛋白质已经在体内显示生物活性，我们已经根据利用的准确方法“再折叠蛋白质”(如O’Reilly等人所述(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Shing，Y.，Fukai，N.，Vasios，G.，Lane，W.S.，Flynn，E.，Birkhead，J.R.，Olsen，B.R.和Folkman，J.(1997)细胞88277-285)。体内实验中利用的沉淀蛋白质的形式只为悬浮液，通过BCA方法测定蛋白质的浓度(在脲中溶解，以及适当的空白测定)，以小的等分试样储存在-70℃。在O’Reilly等人(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Shing，Y.，Fukai，N.，Vasios，G.，Lane，W.S.，Flynn，E.，Birkhead，J.R.，Olsen.B.R.和Folkman，J.(1997)细胞88277-285)中引证的未公开观察结果表明内抑制素C末端的His.Tag破坏了内抑制素的生物活性。所以，产生了C末端缺失了11个氨基酸的内抑制素突变体，EM1，19千道尔顿的蛋白质，留下所有4个半胱氨酸残基是完整的。内抑制素突变体EM2是进一步删除大多数C末端半胱氨酸的8个氨基酸缺失的内抑制素。
设计引物使EM1和EM2的内抑制素的C末端分别缺失9和17个氨基酸。纯化扩增的DNA片断(EM1的525 bp，EM2d 501bp)，利用NdeⅠ和NotⅠ消化，连接进入预消化的pET28(a)表达载体。如上所述进行方案的其余部分。诱导条件和细菌小丸的加工如其它所述进行(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Shing，Y.，Fukai，N.，Vasios，G.，Lane，W.S.，Flynn，E.，Birhead，J.R.，Olsen，B.R.和Folkman，J.(1997)细胞88277-285)。重组蛋白质的纯化是利用Ni-NTA柱，在存在8M脲，如QIAexpressionist手册中所述进行的。简要地说，将细菌小丸在“平衡缓冲液”(8M脲，10毫摩尔/升Tris和100毫摩尔/升磷酸钠缓冲液，pH8.0)中，在室温下溶解1小时。超声波处理悬浮液3-4次，在10，000×g离心，并且在Ni-NTA上加载可溶的部分，用于体内研究。EM1和EM2是利用Ni-NTA柱纯化的。结合于柱上的非特异蛋白质是利用平衡缓冲液洗涤，接着10毫摩尔/升咪唑洗涤液除去的。在含有10％甘油和0.2摩尔/升的乙酸的平衡缓冲液洗脱结合的蛋白质。根据上述方法再折叠纯化的蛋白质。
实施例3在PICHIA PASTORIS中表达小鼠内抑制素pPICZαA表示在图1和2。利用Vent DNA聚合酶的PCR进一步修饰了编码小鼠内抑制素的序列。在预消化的酵母表达载体中亚克隆含有EcoRI和NotI限制位点的扩增片断。(图3)。pPICZoαA载体携带含有用于抗生素选择的Zeocin标记的α因子分泌信号序列。初步的转化是在Top10寄主菌株中进行的。筛选含有插入片断的阳性克隆，并将阳性克隆测序。然后利用SacI将质粒线性化，并且用于在酵母寄主寄主GS115中的同源重组。转化是利用如Pchia表达手册所述的氯化锂方法进行的。在含有100克/毫升Zeocin的YPD平板上涂布选择重组体。检测在YPD/Zeocin平板上生长的克隆的表达。
大规模表达小鼠内抑制素是在2升的带挡板的摇瓶中进行的。利用过夜生长培养物(A600，2-6)接种2升的烧瓶。在每个2升的烧瓶中加入500毫升缓冲甘油培养基。在30℃，250rpm生长细胞直到A600，16-20(2天)。在2天后，在5000rpm离心细胞10分钟。将酵母再悬浮于300-400毫升缓冲甲醇诱导培养基中。在诱导后的第二，第3，第4天收集含有分泌的重组蛋白质的上清液。在收集结束后，立即加工无细胞上清液。
甲醇营养酵母菌株，巴斯德毕赤氏酵母具有许多高等真核表达系统的优点(a)α因子信号序列的存在简化的表达蛋白质分泌到培养基的过程，(b)酵母菌株(GS115)只分泌非常低水平的内源寄主蛋白质，进一步简化了纯化过程，和(c)没有内毒素的污染。选择载体pPICZα用于小鼠内抑制素的表达。初步筛选可以鉴定具有高水平表达的酵母克隆。内抑制素表达为可溶蛋白质(20千道尔顿)，在诱导的第二天可以观察到峰表达水平。
实施例4小鼠内抑制素的纯化肝素琼脂糖层析如O’Reilly等人报道，小鼠内抑制素结合于肝素柱的肝素结合区(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Shing，Y.，Fukai，N.，Vasios，G.，Lane，W.S.，Flynn.，E.，Birkhead，J.R.，Olsen，B.R.和Folkman，J.(1997)细胞88277-285)，所以，肝素琼脂糖柱可用于纯化。利用硫酸铵沉淀(70％)浓缩含有重组蛋白质的粗上清液。在含有150毫摩尔/升NaCl的10毫摩尔/升Tris缓冲液pH7.4溶解沉淀的蛋白质，并且在4℃，在6-8小时的间隔中利用三个变化透析蛋白质。利用Amicon浓缩器(YM10)超滤进一步浓缩透析的样品。在用后可处置的聚戊烯柱(Bio-Rad)中填充肝素琼脂糖树脂，并且利用10毫摩尔/升Tris，150毫摩尔/升NaCl(pH7.4)平衡。利用蠕动泵以20毫升/小时的流速在柱上加载浓缩的样品。利用平衡缓冲液洗涤柱直到A280＜0.001。利用逐步NaCl梯度(0.3，0.6，1.0和2.0摩尔/升NaCl)洗脱结合的蛋白质。合并来自0.6到1.0摩尔/升洗脱时的峰蛋白质，并且对PBSpH7.4透析。通过BCA测试(Pierce)测定蛋白质的浓度。在4℃的冷室中进行纯化过程。
图7A和7B表示了纯化蛋白质的洗脱方案和SDS-PAGE分析。利用浓度增加的NaCl洗脱获得了两个明显的峰(图7A)。比较在0.6摩尔/升NaCl洗脱的主要峰，利用0.3摩尔/升NaCl的第一个洗脱峰是小的。利用1摩尔/升NaCl洗脱时没有明显的峰。大多数内抑制素蛋白质结合于柱的表现是流动通过的组分中没有蛋白质(图7B)。重组蛋白质紧密结合柱，利用低盐Tris缓冲液洗涤除去了其它酵母衍生蛋白质。在0.3摩尔/升NaCl时，从柱中洗脱了小量内抑制素(图7B)。在0.6摩尔/升NaCl时，洗脱了所有结合的蛋白质(图7B)。来自0.3摩尔/升NaCl组分洗脱的蛋白质具有痕量的内抑制素，但污染了其它寄主衍生的高分子量蛋白质。纯化的蛋白质蛋白质迁移到20千道尔顿，并且在还原基础上迁移到22千道尔顿。合并在0.6摩尔/升NaCl单独洗脱蛋白质组分，浓缩，对PBSpH7.4透析。利用Superose12大小分离柱，通过FPLC进一步分离纯化的蛋白质。从这一柱的洗脱方案显示获得单一峰。SDS-PAGE分析表明存在对应于内抑制素的单一分离带。估计表达的水平在15-20毫克/升培养基的范围。重组蛋白质结合于肝素琼脂糖柱，并且在0.6-1M NaCl浓度范围内洗脱。这些数据表明酵母表达的蛋白质适当地折叠了，因为它的特性与杆状病毒表达的内抑制素可比较。
实施例5在PICHIA表达系统克隆和表达his．内抑制素在pET表达载体中的小鼠内抑制素构建体的编码区的前面是His.tag(10个组氨酸残基)。通过DNA-PCR，含有His.Tag序列的编码区穿梭进入pPICZαA载体中。如上所述进行线性化和在酵母寄主菌株GS115中的重组。利用硫酸铵(70％饱和)测定无细胞培养基。将测定的蛋白质溶解于含有300纳摩尔/升NaCl的50毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液pH8.0，并且在同样的缓冲液中，在4℃，在6-8小时的间隔变化3次透析。利用镍琼脂糖柱(Ni-NTA)纯化His.内抑制素重组蛋白质。如QIA表达工作人员的手册中所述进行纯化。利用逐步咪唑梯度(10毫摩尔/升，25毫摩尔/升，50毫摩尔/升，和100毫摩尔/升)洗脱结合的蛋白质。
从Ni-NTA柱洗脱His.内抑制素的方案表明重组蛋白质紧密地结合与柱(图8A和8B)。在培养物上清液中酵母派生的寄主蛋白质没有结合在柱上，并且在洗涤过程中除去。通过逐步的咪唑梯度洗脱了结合的蛋白质(图8A)。加入10毫摩尔/升咪唑洗脱非特异结合的寄主派生蛋白质。在25毫摩尔/升咪唑时，小部分重组蛋白质与高分子量蛋白质一起洗脱了。利用100毫摩尔/升咪唑最后洗脱显示出了一个明显的峰。洗脱的蛋白质的SDS-PAGE分析(图8B)表明流过的部分没有含有任何内抑制素，表明大多数蛋白质结合于柱上。浓度增加到10毫摩尔/升和25毫摩尔/升的咪唑的洗脱导致了非特异蛋白质的洗脱。在100毫摩尔/升时观察到22千道尔顿分子量的蛋白质，以及对应于44-46千道尔顿的小量蛋白质。利用BCA方法测定了纯化的蛋白质的浓度。表达的水平估计为15毫克/升培养物。
实施例6重组内抑制素的鉴定为了进一步鉴定重组蛋白质，在Harvard微测序设备中进行几个循环的N末端微测序。另外，利用10微克起源于毕赤氏酵母表达系统的纯化蛋白质免疫兔产生了小鼠重组内抑制素的多克隆抗血清。在12％SDS-PAGE上分离从细菌和酵母系统表达的重组内抑制素。通过半干转移(Trans-blot，Bio-Rad)，将蛋白质转移到PVDF膜上。将初级抗血清在含有5％无脂肪干牛奶的1×TBS缓冲液中稀释到1∶4000。将山羊抗兔IgG/HRP共轭物用作次级抗体(1∶5000)。通过化学荧光(Pierce)检测免疫反应活性。
序列分析显示酵母α因子信号肽是加工的并且在丙氨酸处裂解。在信号肽裂解后的纯化蛋白质的开始7个残基(EFHTHQD)准确地与内抑制素蛋白质的已知序列匹配(Rehn，M.，Hintikka，E.，和Pihlajaniemi，T.(1994)生物化学杂志，26913929-13935)。
实施例7内抑制素多克隆抗体和Western影印分析本发明产生了抗起源于酵母表达系统的纯化的小鼠内抑制素的多克隆抗体。在还原和非还原条件下电泳从细菌和酵母表达系统的表达的纯化的内抑制素。从Western影印估计的蛋白质的大小范围是22-24千道尔顿。另外，利用Penta His.单克隆抗体(QIAGEN，CA)检测来自酵母和细菌的重组His.内抑制素。该单克隆抗体只对His.内抑制素显示有阳性应答，而活化的内抑制素没有显示任何免疫反应性。检测证明了在重组蛋白质中存在His.Tag。抗血清与人或小鼠制管张素没有任何交叉反应性，证明抗血清具有一定程度的特异于内抑制素的免疫反应性。EM1和EM2蛋白质也观察到了与多克隆抗体的免疫反应性。
实施例8内皮增殖测试体外确定重组内抑制素的生物活性。利用小牛肺动脉内皮细胞(C-PAE)，通过掺入3H-胸腺嘧啶测定酵母系统中产生的内抑制素的抗增殖效果。
在24孔纤连蛋白包衣的平板(10微克/毫升)以0.5毫升含有2％FBS的DMEM中每孔12，500个细胞涂布细胞。在37℃温育24小时后，利用新鲜的DMEM和含有3纳克/毫升bFGF(R和D系统)，有或没有重组小鼠内抑制素的2％的FBS替代培养基。利用1居里3H-胸腺嘧啶脉冲细胞24小时。抽出培养基，并且利用PBS洗涤细胞3次。然后加入1.5当量浓度NaOH(100微升/孔)溶解细胞，并且在37℃温育30分钟。利用液体闪烁计数器确定细胞结合的放射活性。
利用纯化的内抑制素观察到了依赖剂量地抑制bFGF诱导的增殖(图9)。随着内抑制素的浓度的增加(0.1微克/毫升到10.0微克/毫升)观察到了抑制范围(30-94％对照)，ED50值的范围是600-700纳克/毫升。当如本文所述测试来自酵母的His.内抑制素时，观察到它对C-PAE细胞具有相同的抑制效果。
从ED50的值可知，从酵母系统表达的重组内抑制素的生物活性与从杆状病毒系统表达的蛋白质的生物活性是相当的。杆状病毒起源的内抑制素的最大抑制在600纳克/毫升或更大。酵母起源的内抑制素的ED50的值是600-700纳克/毫升。同时，高剂量(＞100微克/毫升)的内抑制素没有抑制786-0细胞系的生长。
实施例9内皮迁移测试为了确定重组内抑制素阻止ECV304细胞朝bFGF迁移的能力，利用不同浓度的内抑制素以及bFGF作为刺激物进行迁移测试。利用了12孔Boyden趋化性室(Neuro Probe公司)以及聚碳酸酯膜(25×80毫米无PVD，8孔，Poretics公司，Livermore，CA)。利用含有0.5％明胶，1毫摩尔/升CaCl2和150毫摩尔/升NaCl的溶液在37℃过夜包衣，预防生长因子与室的非特异结合。在含有5纳克/毫升Dil(1，1，’-双十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐DiIC18，分子探测，Eugene，OR)的10％FBS过夜生长ECV304细胞，并且利用含有0.5％BSA的PBS洗涤。在胰蛋白酶消化后，利用Coulter-CounterZl(Luton，U.K.)计数细胞，并且在含有0.5％FBS的培养基199中稀释细胞到300，000个细胞/毫升。下面的室利用含有25纳克/毫升bFGF的培养基199填充。上面的室利用15，000细胞/孔以及不同浓度的重组内抑制素涂布。允许细胞在37℃迁移4小时。然后，用细胞刮刀除去膜的上表面的细胞，在3％的福尔马林中固定下表面上的迁移细胞，并用PBS洗涤。利用550纳米处的荧光显微镜以及数码相机获得固定的膜的成象，并且利用OPTIMAS(6.0版本)软件确定每个膜上的细胞数。
加入内抑制素导致依赖剂量的增殖抑制，最大剂量是20微克/毫升(图10)。在小于1微克/毫升的浓度时，观察到了迁移的临界抑制。在10微克/毫升浓度时，内皮细胞迁移的抑制是60％。
实施例10CAM测试利用尿囊绒膜(CAM)测试方法测定小鼠内抑制素阻止bFGF体内诱导血管生成的能力。将已孵化的白色Leghorn鸡蛋(SPAFAS公司，NorwichCT)在100平方毫米的石盘上打开，允许在38℃的潮湿温育器中生长到11天。含有0.73毫克/毫升浓度的vitrogen(Collagen生物材料，Palo Alto，CA)和补充了a)单独载体；b)VEGF(250纳克/小丸)；c)VEGF和内抑制素(分别是20和0.5微克/小丸)；d)bFGF(50纳克/小丸)；和e)bFGF和内抑制素(分别20和0.5微克/小丸)的小丸在37℃多聚体化2小时。将小丸放置于尼龙膜上，位于CAM的周边。将胚胎回到温育器24小时。在鸡胚胎的循环系统中注入FITC葡聚糖测定新的毛细血管侵入胶原网。在实验结束时，分解网，利用程序NIHImage 1.59测定血管的密度。进行三次测试，和四次独立的实验。
内抑制素能够抑制bFGF和VEGF介导的血管生成反应(图11A和11B)。在5微克/网的平台上，抑制是依赖剂量的。有时，VEGF应答的阻止(47％)比bFGF应答的抑制(39％)更有效。在CAM测试中，在20微克/盘浓度的内抑制素抑制了bFGF诱导的血管生成。在摩尔基础上，在相同的测试中，内抑制素对CAM测试的影响显示比抑制剂血小板反应蛋白-I(35)，烟曲霉素(AGM1470)或抗整联蛋白v3的抗体更具有更强的潜力。在提供内抑制素作用的其它机制和新的体外效力测试方面，我们对内皮细胞迁移的研究是新的。
实施例11内抑制素抑制效果的中和利用内皮增殖和CAM测试的中和研究证明了内抑制素抑制效果具有特异性。简要地说，在内皮增殖测试中，利用多克隆抗血清预温育内抑制素，然后加入C-PAE细胞。利用预免疫血清作为阴性对照。另外，也利用纯化的IgG作为对照。然后，利用3H-胸腺嘧啶脉冲细胞24小时，如上所述测定细胞结合的放射活性。在CAM测试中，在制备小丸之前，在4℃，尾对尾地过夜预温育内抑制素(10微克)和抗血清(50微克)。这些实验的对照包括IgG单独和预免疫血清单独。如上确定血管生成应答的评估。
图12证明了与特异的抗血清一起温育能够抑制内抑制素的抑制影响。抗内抑制素阻止95％的抑制影响。预免疫血清单独和正常兔IgG都没有刺激影响。
实施例12在裸小鼠模型中初级786-0肿瘤的抑制在右侧空白皮下，利用100微升体积的2百万个786-0细胞注射6到8星期大的雄性米色裸鼠。在细胞植入后约2星期出现肿瘤。利用卡钳测量肿瘤大小，利用标准公式计算肿瘤体积。肿瘤体积范围350立方毫米到400立方毫米。任取动物，每组5个小鼠，在组内和组之间肿瘤的大小是相当的。利用重组内抑制素(细菌或酵母版本)开始处理，每个小鼠每天接受10毫克/公斤体重的重组蛋白质，通过腹膜内注射给药10天。对照动物每天接受PBS。在另外的日期测量所有组的肿瘤大小，并计算肿瘤体积。在这一时期检测动物的活性和行为。在10天的时候终止处理，杀死动物，移取每个小鼠的肿瘤，在10％的缓冲福尔马林中固定。
对于突变体研究，每个小鼠在2星期中每天腹膜内接受20毫克本发明的蛋白质/公斤体重。肿瘤体积范围是150-200立方毫米。在实验中，给予每公斤体重20毫克pET28(a)载体生产的野生型内抑制素作为阳性对照，并且将给予PBS的小鼠作为阴性对照。
在处理后15天，在对照(963立方毫米)和处理(酵母内抑制素，405立方毫米；细菌内抑制素，442立方毫米，和His.内抑制素，462立方毫米)之间存在差异。在处理后15天时，在对照和处理之间观察到肿瘤体积下降2.5倍(图13A)。在所有处理组中，肿瘤的生长受抑制比较对照组观察到了更慢的生长速度。剂量10毫克/公斤的细菌(His.Tag)或酵母衍生(有或没有His.Tag)内抑制素作用同样好。在处理后第10天，肿瘤体积在对照动物中是1490立方毫米，而在处理组中发现是480-570立方毫米(p＜0.005)。给药内抑制素没有完全抑制肿瘤的生长，但肿瘤的生长慢了，在该时期，肿瘤体积保持了勉强的生长。
在RCC模型中进行利用20毫克/公斤体重的内抑制素和突变体EM1和EM2的第二套实验。在图13B中表示了在处理11天后的肿瘤体积。在处理后9天，在组之间出现了差异。在处理后11天，在对照组中的肿瘤体积(397立方毫米)大约2倍于两个内抑制素(182立方毫米)或EM1(259立方毫米)的处理组。但是，在同样的天数，EM2处理组的肿瘤体积(389立方毫米)相同于对照组(397立方毫米)。意义在于EM2和内抑制素组之间的90％的置信水平和在内抑制素和对照组之间95％的置信水平。在11天时，在每组中最大和最小肿瘤的值下降增加了EM2和EM1之间和EM2和内抑制素之间的置信水平到95％。所以，EM1蛋白质保留了内抑制素的天然生物活性，而EM2没有。在两个突变的内抑制素蛋白质之间效力的明显差异也表明内抑制素而不是可能的污染是给出抗血管生成影响的活性分子。另外，突变蛋白质的数据指出了作为内抑制素活性的关键的围绕和包括最后的半胱氨酸的8个残基(SYIVLCEE)的重要性。
关于抑制初级肿瘤生长的能力方面，不管蛋白质的来源，非再折叠或天然蛋白质都具有可比较的抑制方案。另外，在酵母起源的蛋白质中存在His.Tag序列没有影响生物活性。虽然在对照和处理小鼠之间，肿瘤体积有明显的差异，在处理时期，处理组中的肿瘤也连续地慢慢生长。在处理后10天，当终止给药内抑制素时，肿瘤快速生长，在1个星期内，肿瘤的平均大小即相当于对照。在相当大肿瘤体积的第一个研究中，我们不能诱导肿瘤休眠。随后，在肿瘤范围150-200立方毫米并且增加剂量到20毫克/公斤体重测试内抑制素(和它的突变体)的影响。在这些条件下，肿瘤生长抑制了，虽然没有观察到肿瘤休眠。
实施例13在巴斯德毕赤氏酵母中的人内抑制素的克隆，表达和纯化利用Vent DNA聚合酶从人胎肾(HFK)cDNA文库扩增编码人胶原ⅩⅧ的羧基末端部分的序列。利用的引物是基于人胶原ⅩⅧ序列的5’-TTT GAA TTC GCC CAC AGC CAC CGCGAC TTC CAG CCG GTG CTC CAC-3’(SEQ ID NO)和5’-AAA AGC GGC CGC CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAAGCT GTT CTC AAT -3’(SEQ ID NO)(Oh等人(1994)基因组19494-499)。根据下面的参数进行30个循环的扩增94℃变性，60℃退火，和72℃延长，每个1分钟。利用QIAquick纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化扩增的549bp的片断，利用EcoRI和NotI消化(在上面的引物中这些限制位点下面划线了)。将得到的片断连接进入预消化的酵母表达穿梭质粒(pPICZoαA，图1)，并且转化进入巴斯德毕赤氏酵母。对阳性克隆的两条链测序。如Dhanabal等人(1999)(癌症研究，在出版中)，和在VikasP.Sukhatme，1998年11月8日递交的美国专利申请，U.S.S.N.XX/XXX，XXX，“抗血管生成肽和其应用方法”中所述对小鼠内抑制素进行转化，重组和选择，上面的文献全部引入本文作为参考。
如上对小鼠内抑制素所述在2升带挡板的摇瓶中进行大规模的人内抑制素的表达，如Dhanabal等人(1999)(癌症研究，出版中)，和Vikas P.Sukhatme1998年11月8日递交的美国专利申请，U.S.S.N.XX/XXX，XXX，“抗血管生成肽和其应用方法”中所述加工含有分泌的重组蛋白质的上清液，上面文献全部引入本文作为参考。利用70％硫酸铵沉淀浓缩蛋白质。在含有50毫摩尔/升NaCl的50毫摩尔/升磷酸钠缓冲液，pH7.4中透析沉淀的蛋白质。利用肝素琼脂糖柱进行人内抑制素的纯化。在柱上利用蠕动泵加载蛋白质样品。利用含有50毫摩尔/升NaCl的50毫摩尔/升的磷酸缓冲液，接着利用含有100毫摩尔/升NaCl的同样的缓冲液洗涤柱。利用0.2摩尔/升和1摩尔/升NaCl的逐步洗脱液洗脱结合的蛋白质。合并1MNaCl洗脱的峰组分，在PBS缓冲液(pH7.4)中透析。通过BCA测试测定蛋白质的浓度(Pierce化学公司，Rockford，Illinois，美国)。
在诱导后2天，起初的小规模表达显示了最大的表达水平。内抑制素表达成可溶的20千道尔顿蛋白质。利用肝素琼脂糖柱纯化内抑制素。图14A和14B表示了纯化蛋白质的洗脱方案和SDS-PAGE分析。在这一研究中，与小鼠内抑制素相比，人内抑制素与肝素琼脂糖柱的结合效果更小。所以，在50毫摩尔/升NaCl中进行结合，接着利用0.1摩尔/升NaCl洗涤，最后利用0.2摩尔/升NaCl和1摩尔/升NaCl进行洗脱。观察到了两个明显的洗脱峰。利用10毫升来自选择的组分的等分试样进行洗脱蛋白质的纯度分析。该粗蛋白质相对纯净，含有一些寄主起源的蛋白质污染。在0.1摩尔/升NaCl，从柱中洗脱了痕量的蛋白质。不考虑A280的读数，在0.2摩尔/升的NaCl洗脱的组分中的蛋白质也含有痕量内抑制素。1MNaCl洗脱的蛋白质是相对纯净的，并且在12％SDS-PAGE凝胶上迁移到20千道尔顿，它在还原SDS-PAGE上迁移更慢。合并1摩尔/升NaCl单独洗脱的蛋白质组分，浓缩，和在PBS，pH7.4透析。利用Superose12柱(FPLC)进一步分离这一合并液，从中获得了单一的洗脱峰。通过BCA测试测定表达的水平约为10毫克/升培养物。
实施例14人内抑制素的鉴定通过微测序N末端8个循环进行人内抑制素的初步鉴定，显示了酵母α因子信号肽的适当加工。开始的8个残基(EFAHSHRD)准确地匹配了公开的内抑制素蛋白质的序列，开始的两个残基(EF)起源于接头肽。两条链的序列完全匹配公开的人胶原ⅩⅧ的序列。在氨基酸水平，人和小鼠内抑制素蛋白质表现出85％同一性和93％的相似性，证明了两者之间具有高度的同源性和内抑制素的结构保守性(Sasaki等人(1998)EmboJ.174249-56)。并且所有的半胱氨酸残基完全保守。
实施例15Western影印分析通过Western影印分析人内抑制素与纯化的兔多克隆抗体的免疫反应性。利用产生的小鼠内抑制素的纯化的多克隆抗体(IgG)测定它与人内抑制素的反应性。通过利用10微克起源于毕赤氏表达系统的纯化的蛋白质免疫小鼠产生了小鼠重组内抑制素的多克隆抗血清。在12％SDS-PAGE凝胶上分离从酵母系统表达的重组内抑制素。通过半干转移(Trans-blot，Bio-Rad)将蛋白质转移到PVDF膜。利用含有5％无脂肪干牛奶的1×TBS缓冲液稀释初级抗血清到1∶4000。利用山羊抗兔IgG/HRP共轭物作为次级抗体(1∶5000)。通过化学荧光检测免疫反应性(Pierce 化学公司，Rockford，Illinois，美国)。
结果表明免疫反应的带对应于小鼠和人内抑制素。从300纳克人内抑制素检测到的信号相当于100纳克小鼠内抑制素检测到的信号。从Western影印测定的蛋白质大小是20千道尔顿。从Western影印测定的蛋白质的大小是20千道尔顿。直接抗小鼠制管张素的抗体没有观察到信号。另外，内抑制素抗体是特异于小鼠和人内抑制素的，并且该抗体与人和小鼠制管张素没有交叉反应性，证明了抗体对内抑制素的特异性。
实施例16内抑制素对内皮细胞增殖的影响如Dhanabal等人(1999)(癌症研究，出版中)，和在VikasP.Sukhatme，1998年11月8日递交的美国专利申请，U.S.S.N.XX/XXX，XXX，“抗血管生成的肽和其应用方法”中对小鼠内抑制素的叙述，利用3H胸腺嘧啶测试人内抑制素抑制C-PAE细胞的增殖的能力。上面文献全部引入本文作为参考。随后，利用HUVE和HMVE-L细胞评估人内抑制素的抗增殖效果。在24孔纤连蛋白(10微克/毫升)包衣的平板上以每孔1％FCS中2×104个细胞播种人内皮细胞。利用bFGF(3纳克/毫升)刺激细胞，同时加入不同浓度的人内抑制素。在37℃温育细胞24小时，接着利用1微居里的3H-胸腺嘧啶脉冲细胞24小时。抽出培养基，利用PBS洗涤细胞3次，然后加入1.5当量浓度NaOH(100微升/孔)溶解细胞，在37℃温育30分钟。利用闪烁计数器测量细胞结合的放射活性。
人内抑制素对C-PAE细胞没有表现抑制效果，而小鼠内抑制素对同样这些细胞表现了依赖剂量的抑制。然后，利用了人内皮细胞(HUVE和HMVE-L)，图13A和13B表示，小鼠和人内抑制素存在对bFGF诱导的增殖的依赖剂量的抑制。对于两个细胞类型，都利用了3纳克/毫升的bFGF作为刺激物。每个值是代表实验的三份培养物的平均值，误差条代表标准偏差。将对照培养物中DNA的合成认为是100％。阴影和空白的条块代表分别代表小鼠和人内抑制素。
在这些条件下，小鼠内抑制素比人内抑制素的潜力更小。在HUVE和HMVE-L细胞中，10微克/毫升的人内抑制素分别抑制它们的3H胸腺嘧啶的掺入为40％和36％。计算在这些细胞中人内抑制素的ED50值的范围是5.0到7.5微克/毫升。浓度范围0.5微克/毫升到10微克/毫升的重组人内抑制素没有抑制人786-0肾细胞癌细胞或人WI-38成纤维细胞的增殖。
实施例17细胞周期分析通过48小时的接触抑制，HUVE和HMVE-L细胞在完全培养基中的生长抑制了。通过胰蛋白酶消化收集细胞，并播种在纤连蛋白(10微克/毫升)包衣的6孔平板中。每个孔播种利用补充了3纳克/毫升bFGF的1％FCS中的0.2×106个细胞。在剂量应答研究中，加入不同浓度的人内抑制素，并且在处理后的24小时收集细胞。利用PBS缓冲液洗涤细胞，并在70％的冰冷乙醇中固定。在含有2％FCS和0．1％吐温-20的PBS缓冲液中，在室温下再水合固定的细胞30分钟，在1500×g离心10分钟，在加入RNase(5微克/毫升)的0.5毫升的上面的缓冲液中再悬浮。在37℃进行RNase消化1小时，接着利用碘化丙锭(5微克/毫升)染色。利用贝克通迪克生FACStar Plus流动细胞计(BecktonDickinson，Waltham，Massachusetts，美国)分析细胞。为了计算细胞周期的不同时期的细胞的百分数，利用了ModFit软件。在时间过程的研究中，加入了10微克/毫升的人内抑制素，在不同的时间点(15，18，24和32小时)收集细胞。为了测试人内抑制素的特异性，在细胞周期的分析中利用了非内皮成纤维细胞系IMR-90和WI-38。
在开始时，4.5％的“生长抑制”的接触抑制细胞是在S期(图16A)。当利用bFGF(3纳克/毫升)单独刺激细胞24小时时，在S期的细胞的百分数增加了3.5倍。在利用20克/毫升的内抑制素处理后，在S期的细胞的百分数减少到基线。利用浓度增加的内抑制素(0.5克/毫升到20克/毫升)观察到了该蛋白质的依赖剂量的抑制性。在利用人内抑制素处理非内皮细胞(IMR-90和WI-38)时，S期细胞的百分数未受影响(图16B和16C)。
为了确定内抑制素对内皮细胞产生抑制效果的最早的时间点，利用10微克/毫升的人内抑制素进行了时间过程的研究。图16D表示了人内抑制素的时间过程影响，表明在HUVE细胞处理后15小时时，可以看到人内抑制素的效果。
实施例18在MATRIGEL中内皮细胞管的形成利用0．5毫升MATRIGEL(Collaborative Biomedical Product，Bedford，Masachusetts，美国)包衣24孔组织培养平板。在37℃温育平板1小时(Gately等人，(1996)癌症研究，564887-90)。在凝胶上部加入0.5毫升M199培养基中浓度为5×104的ECV304细胞，接着加入不同浓度的重组人内抑制素。在37℃，在5％CO2的潮湿大气中温育培养物8到10小时。利用尼康相机对管网的代表区域照相，最后放大200倍。
利用10微克/毫升的内抑制素处理明显抑制了内皮细胞管的形成。在对照细胞中，形成的管是明显的，连续的，六角型结构，没有中断。相反，内抑制素处理的管的平均直径更小，并且明显地经常中断，表明人内抑制素对内皮细胞管的形成有影响。
实施例19膜连蛋白V-FITC测试在启动细胞程序死亡后，大多数细胞类型将膜磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜的内表面转移到外侧(van Engeland等人(1998)细胞计量术，311-9；Zhang等人(1997)，生物技术23525-31；Koopman等人(1994)血液841415-20)。利用Annexin V的FITC共轭物，高PS亲和力的38千道尔顿的钙依赖磷脂结合蛋白染色可以检测PS和由此的细胞程序死亡。通常可以在泡沫形成和DNA片断化之前检测PS。
简要地说，将在含有1％FCS和3纳克/毫升bFGF的EGM培养基中的200，000个细胞涂布在纤连蛋白包衣的6孔平板上。在孔中加入不同浓度的人和小鼠内抑制素，收集细胞并在处理后加工18小时。利用人重组TNF-α(40纳克/毫升)作为阳性对照。在PBS中洗涤细胞，再悬浮于结合缓冲液(10毫摩尔/升HEPES/NaOH，pH7.4，140毫摩尔/升NaCl，2.5毫摩尔/升CaCl2)。加入的Annexin V-FITC的最后浓度为100纳克/毫升，在黑暗中温育细胞10分钟，在PBS中再次洗涤，并且再悬浮于300升结合悬浮液。在流动细胞计分析之前，在每个样品中加入10微升碘化丙锭(PI)。利用标准的Cell Quest软件(贝克通-迪克生，Waltham，Massachusetts，美国)进行数据分析。设定了四分体设置，允许阴性对照小于1％阳性率。利用人内抑制素(10微克/毫升)处理非内皮细胞IMR-90和W138，并且如上所述进行。
10微克/毫升的内抑制素在Annexin荧光密度上显示了一个明显的改变，在HMEV-L细胞中观察到了更明显的效果。10微克/毫升的内抑制素对对照和处理细胞之间的平均荧光密度差异是明显的(p=0.01)。10微克的内抑制素和阳性对照TNF-α(40纳克/毫升)对荧光密度的改变是相似的。低于1微克/毫升浓度的内抑制素没有显示出任何明显的AnnexinV阳性率。有趣的是，在这些细胞中，小鼠内抑制素在Annexin阳性率上没有显示任何增加，但在C-PAE和BAE细胞中，正如HUVE细胞在存在人内抑制素时观察到的，小鼠内抑制素表现出可比较的荧光染色(Dhanabal等人(1998)，生物化学杂志)。对于非内皮细胞IMR-90和WI-38，没有观察到annexin阳性。根据这些结果对于内皮细胞，内抑制素的作用似乎是选择性的。利用小鼠内抑制素在C-PAE细胞中已经得到了同样的数据(Dhanabal等人(1998)生物化学杂志)。
实施例20细胞迁移测试前面的实验表明C-PAE细胞没有应答bFGF和VEGF迁移，所以利用ECV304细胞测定人内抑制素阻止bFGF介导的迁移的能力。利用12孔Boyden趋化室(Neuro-probe公司，CabinJohn，MI)以及聚碳酸酯膜(25×80毫米，无PVD，8孔，Poretics公司，Livermore，加里弗尼亚，美国)进行迁移测试。利用含有0.5％明胶，1毫摩尔/升CaCl2，和150毫摩尔/升NaCl的溶液在37℃过夜包衣室预防了生长因子与室的非特异结合。在含有5纳克/毫升DiI(1，1’-二十爸烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐DiIC18，分子探测，Eugene，Oregon，美国)的10％FBS生长ECV304细胞过夜，并且利用含有0.5％BSA的PBS洗涤。在胰蛋白酶消化后，利用Coulter-CounterZl(Luton，U.K.)计数细胞，在含有0.5％FBS的培养基199中稀释到300，000个细胞/毫升。利用含有25纳克/毫升bDFD的培养基199填充下面的室。利用15，000个细胞/孔以及不同浓度的重组内抑制素播种上面的室。允许细胞在37℃迁移4小时。然后，利用细胞刮刀除去膜的上面表面上的细胞，在3％的福尔马林中固定下面表面上的迁移细胞，并利用PBS洗涤。利用荧光显微镜在550纳米以及数码相机获得了固定膜的象，利用OPTIMAS 6.0版本软件确定每个膜上的细胞数。每个处理进行2次，利用重组的小鼠内抑制素作为阳性对照。
观察到了依赖剂量的迁移的抑制。在每个孔中，在三个不同的区域计数迁移的细胞数，获得平均值。图17，一个条块图表示了结果。每个值是来自代表实验的平均值，误差条代表标准偏差。在10微克/毫升和5微克/毫升观察到了明显的抑制水平。在小于0.1微克/毫升的浓度时，观察到只有临界迁移抑制。然后，在相同的条件下测试HIVE细胞，同样显示了可比较的应答方案。在HUVE细胞的情况中，细胞允许迁移16到20小时。
实施例21制管张素的ELISA效价测定利用10微克/毫升纯化的制管张素抗原包衣96孔平板，在室温下温育1小时，并且利用磷酸缓冲盐/0.05％吐温20洗涤3次。然后，在室温下，利用5％牛奶粉末和0.01％BSA封闭平板1小时，然后利用PBS/0.05％TWEEN20洗涤3次。将不同稀释度的测试血液抗血清稀释10倍，一式三份加到孔中，然后在室温下温育1小时。然后利用PBS/0.05％TWEEN20洗涤它们三次，加入次级抗体(抗兔IgG/碱性磷酸酶)，并且在室温下温育1小时，然后洗涤3次。加入磷酸酶底物，并且温育20-30分钟，读取405纳米处的吸光值。小鼠和人制管张素表现了基本等同的结果。
实施例22在内皮细胞增殖测试中制管张素的影响如本文所述生产小鼠制管张素(参见图18A和18B)。通过硫酸铵沉淀(70％)浓缩含有重组制管张素蛋白质的粗上清液。在50毫摩尔/升磷酸钠缓冲液pH7.4中溶解沉淀的蛋白质，在4℃过夜透析(在608小时的间隔有3材chantes)。利用Amicon浓缩器(YM10)通过超滤进一步浓缩透析的样品。利用赖氨酸-琼脂糖4B树脂(Pharmacia，新泽西)填充Bio-Rad柱，并且利用50毫摩尔/升磷酸钠缓冲液，pH7.4平衡。利用蠕动泵在柱上加载浓缩的样品。利用平衡缓冲液洗涤柱直到A280是0.001。利用10个柱体积的含有200毫摩尔/升的NaCl的磷酸钠缓冲液，pH7.4再次洗涤柱。利用0.2Mε-氨基-N己酸，pH7.4洗脱重组的制管张素蛋白质。合并吸光值和SDS-PAGE分析测量的含有明显量的蛋白质的组分，在PBS，pH7.4中透析24-36小时。通过BCA测试(Pierce)测量蛋白质浓度。在冷室(4℃)中进行所有的纯化过程。利用Superdex-75柱，在FPLC上分离大小进一步纯化重组的蛋白质。
在低血清中，在明胶包衣的平板上每孔播种12，500个C-PAE细胞。允许细胞在37℃粘连过夜。除去过度培养基，加入含有3纳克/毫升bFGF的新低血清培养基。加入不同稀释度的纯化的重组制管张素，在37℃温育48小时。然后，利用3H-胸腺嘧啶(1微居里/20微升/孔)脉冲标记细胞24小时。然后收集细胞，并且测量胸腺嘧啶的掺入。图20表示了结果，在Y轴表示了DNA合成，X表示了制管张素。通常，制管张素的浓度增加，DNA合成下降。
实施例23在肾肿瘤模型中制管张素的影响在无胸腺的裸鼠中皮下植入肾肿瘤细胞系786-0。在每个小鼠的侧面接种200升磷酸缓冲盐中的约5百万个细胞。允许每个肿瘤长到约200立方毫米。
在3星期中，每天，在每个动物的腹膜内给予20微克纯化的重组小鼠制管张素(1毫克/公斤)。
实施例24在毕赤氏酵母表达系统中表达制管张素由ATCC(美国典型培养物保藏中心)克隆MPL8-2000(纤溶酶原编码质粒)提供了小鼠制管张素cDNA克隆和它的序列。从这一序列制造两个引物5’-AAG AAT TGC TGT TGT ATC TGTCAG AAT GT-3’(SEQ ID NO)和5’-AGC GGC CGC CTACCC TCC TGT CTC TGA-3’(SEQ ID NO)。
通过ATCC(美国典型培养物保藏中心)克隆PKSK067提供了人制管张素cDNA克隆和它的序列。从这一序列制造两个引物5’-AAG AAT TCG TGT ATC TCT CAG AGT GC-3’(SEQ IDNO)和5’-AGC GGC CGC CTA TTC TGT TCC TGA GTA-3’(SEQ ID NO)。
如本文所述在修饰的毕赤氏酵母表达系统中克隆和表达了两个制管张素(参见图21A-B)。
实施例25静息蛋白胶原XV的羧基部分的分离将下面的cDNA文库用作DNA-PCR的模板。
K562-erthyroid文库JMN-人mesothioliomaHFK-人胎肾文库786-0人肾细胞癌MAB-人成年的脑293-对照从GIBCO-BRL合成了对应于Collagen XV NC-1区的“C”末端部分的引物(图22，图23表示了静息蛋白的氨基酸序列)。上游引物TTT TTT GAA TTC ATT TCA AGT GCC AAT TATGAG AAG CCT GCT CTG CAT TTG(SEQ ID NO)下游引物AAG AAT GCG GCC GCT TAC TTC CTA GCG TCT GTCATG AAA CTG TTT TCG AT(SEQ ID NO)利用标准方案进行了DNA-PCR。简要地说，利用来自每个cDNA文库的100纳克DNA作为模板。扩增条件是94℃1分钟，65℃1分钟，和72℃42秒，循环30次。
纯化了下文命名为“静息蛋白”的540bp的扩增片断，并利用EcoRI和NotI消化。图24图解说明了将CollagenXV克隆进入毕赤氏酵母表达载体(pPICZαA，可从Vitrogen，圣迭戈，CA购买)。图25表示了构建体，载体，等等。利用上面的限制酶也消化了载体pPICZαA，并与静息蛋白片断连接。利用寄主菌株Top10F’进行初步转化。将阳性克隆测序证明了修饰。利用SacI酶将质粒线性化，通过氯化锂转化，在酵母寄主菌株GS115中同源重组。根据Pichia表达手册中所述进行重组。允许菌落在30℃的YPD/Zeicin平板上生长2天。选择在Zeocin上生长的克隆用于小规模诱导。根据制造商的推荐进行诱导过程(In Vitrogen)。在毕赤氏酵母表达系统中静息蛋白的表达将来自YPD/Zeocin的单个菌落接种到500毫升带挡板烧瓶中的25毫升BMGY/Zeo(100微克/毫升)中。在30℃的振摇温育器中培养培养物直到培养物的OD600达到2-6(约16-24小时)。利用1∶100稀释度的对数生长期的细胞接种1升培养物。加入500毫升BMGY培养基，在2升的带挡板烧瓶中生长细胞，培养到OD600为15-20(2-3天)。在室温下，在5000rpm离心收集细胞10分钟。丢弃上清液，将细胞沉淀再悬浮于300-400毫升BMMY培养基中，诱导重组蛋白质的表达。为了保持诱导状态，每24小时加入100％的甲醇直到最后浓度为0.5％。在诱导后第2，第3，第4天收集上清液，通过考马斯染色的SDS-PAGE分析蛋白质的表达。利用肝素-琼脂糖柱纯化静息蛋白利用60-70％的硫酸铵沉淀浓缩上清液。在10，000rpm离心沉淀的蛋白质10分钟，将沉淀再悬浮于磷酸缓冲盐，在4℃透析过夜。最后利用10毫摩尔/升Tris和50毫摩尔/升NaCl，pH7.4进行透析。利用5毫升肝素-琼脂糖(Pharmacia)树脂填充聚丙烯柱，并利用10毫摩尔/升的Tris，50毫摩尔/升的NaCl，pH7.4平衡。以流速10-15毫升/小时，20-30毫升为一批将浓缩的粗蛋白质样品加载到柱上。利用平衡缓冲液洗涤柱直到280纳米的吸光值＜0.001。利用NaCl的逐步梯度(0.2M，0.6M和1.0M)进行结合蛋白质的洗脱。洗脱方法没有显示任何明显的蛋白质峰，当通过SDS-PAGE分析样品时，发现大部分蛋白质没有结合到柱上。降低NaCl的浓度，改变pH也没有改变结合的方式。所以重组蛋白质没有结合肝素柱。所以我们决定在静息蛋白分子的氨基末端加His.Tag基序简化纯化过程。His.Tag静息蛋白重组蛋白质的构建合成了侧接EcoRI限制位点的组氨酸残基(6个组氨酸的跨度)的两个互补低聚核苷酸。利用EcoRI消化载体pPICZαA。混合每50微升的引物(100micorM)，在95℃变性5分钟，并且在冰上立即冷却。在16℃过夜，将退火的引物连接进入EcoRI消化的载体骨架。在70℃热活化连接酶10分钟。利用Glass Max纯化柱除去过量的引物。利用寄主菌株Top 10F’转化连接的载体。通过PCR和限制酶分析筛选重组的克隆。通过测序进一步证明His.Tag基序的存在。
利用SacI线性化重组的pPICZoαA/His.静息蛋白，利用菌株GS115和标准的方法进行重组。
静息蛋白的生物活性是在本文叙述的测试方法中测定的。图26表示了本文所述的细胞迁移测试中静息蛋白的活性，图27表示了本文所述的肿瘤测试方法中静息蛋白的活性。
当如本文所述生产了静息蛋白后，也可以生产静息蛋白的片段，Apomigren，并且利用所述的方法测定它的活性。同等意义在参考优选的实施方案特定地表示和叙述了本发明后，本领域技术人员应该理解，不脱离附加的权利要求定义的本发明的精神和范围，其中是可以做各种形式和细节上的变化的。
权利要求
1．一种生产具有生物活性的抗血管生成蛋白质，或具有生物活性的突变体，片段，衍生物或融合蛋白质的方法，该方法包括(a)在酵母表达载体中插入含有编码抗血管生成蛋白质或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的聚核苷酸序列的据核苷酸，其中载体含有多个克隆位点；和(b)利用步骤(a)的载体转化适当的酵母菌株，并且在适当的条件下培养酵母菌株生成抗血管生成蛋白质，从而生产了具有生物活性的抗血管生成蛋白质，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
2．根据权利要求1所述的方法，其中酵母菌株是巴斯德毕赤氏酵母。
3．根据权利要求1所述的方法，其中表达载体包括pPICZαA载体。
4．根据权利要求1所述的方法，其中通过下面的一个或几个测试方法测定生物活性内皮细胞迁移；哺乳动物中肿瘤生长的抑制；细胞周期中G1期内皮细胞的抑制；在内皮细胞中诱导细胞程序死亡。
5．编码抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的多肽，其中蛋白质选自包括内抑制素，制管张素或静息蛋白，或其任何突变体，衍生物，片段或融合蛋白质或任何其中的联合的组。
6． 根据权利要求1所述的方法，其中生产的本发明的蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的产量是每升培养液1-20微克或更多的浓度。
7． 权利要求1所述的方法生产的具有生物活性的抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
8． 权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的分离的聚核苷酸另外含有聚核苷酸接头，步骤(b)生产的抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质另外含有产生接头聚核苷酸的至少一个氨基酸残基。
9． 权利要求8所述的方法，其中产生的抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质含有另外两个氨基末端氨基酸残基。
10．其中氨基酸残基是谷氨酸(E)或苯丙氨酸(F)的权利要求9的蛋白质，突变体，衍生物，片段，或融合蛋白质。
11．权利要求8所述的方法生产的具有生物活性的抗血管生成蛋白质，突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
12．编码抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的权利要求8的多肽，其中该蛋白质选自包括内抑制素，制管张素或其任何联合的组。
13．包括权利要求8的方法生产的抗血管生成蛋白质，突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的和药物可接受载体的组合物。
14．权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的载体包括pPICzαA的质粒，其中质粒含有多个克隆位点，克隆位点包括His.Tag序，其中步骤(b)生产的抗血管生成蛋白质，突变体，衍生物，片段或融合蛋白质含有组氨酸标记基序。
15．权利要求14所述的方法，其中酵母菌株是巴斯德毕赤氏酵母。
16．权利要求14所述的方法，其中通过下面的一个或几个测试方法测定生物活性内皮细胞迁移；在哺乳动物中肿瘤生长的抑制；在细胞周期的G1期的内皮细胞的抑制；或内皮细胞的程序死亡的诱导。
17．权利要求14所述的方法，其中生产的蛋白质，突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的浓度是每升培养液10-20微克或更多。
18．权利要求14的方法生产的具有生物活性的抗血管生成的蛋白质，突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
19．编码抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的权利要求14的多肽，其中蛋白质选自包括内抑制素，制管张素，静息蛋白或其任何联合的组。
20．包括权利要求1的方法生产的抗血管生成蛋白质，突变体，衍生物，片段和融合蛋白质和药物可接受载体的组合物。
21．利用权利要求1的方法生产的抗血管生成蛋白质，突变体，衍生物，片段或融合蛋白质抑制哺乳动物中不需要的血管生成的方法，包括多哺乳动物给药有效量的抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
22．一种生产具有生物活性的抗血管生成蛋白质，或具有生物活性的其突变体，片段，衍生物，或融合蛋白质的方法，该方法包括(a)在含有pPICzαA质粒的酵母表达载体中插入含有编码抗血管生成蛋白质，其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的聚核苷酸的分离的聚核苷酸，其中聚核苷酸另外含有接头，其中聚核苷酸接头至少编码一个氨基酸，其中质粒含有多个克隆位点；和(b)利用步骤(a)的载体转化巴斯德毕赤氏酵母酵母菌株并在适当的条件下培养酵母菌株生产含有接头聚核苷酸产生的至少一个氨基酸残基的抗血管生成蛋白质，从而生成具有生物活性的抗血管生成蛋白质，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
23．权利要求22所述的方法，其中的聚核苷酸编码制管张素，内抑制素，静息蛋白或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质，或同它们的任何联合。
24．权利要求22的方法生产的具有生物活性的抗血管生成蛋白质。
25．一种生产具有生物活性的抗血管生成蛋白质或其具有生物活性的突变体，片段，衍生物，或融合蛋白质的方法，该方法包括(a)在酵母表达载体中插入含有编码抗血管生成蛋白质，或其突变体，衍生物，片段，或融合蛋白质的据核苷酸的分离的聚核苷酸，其中聚核苷酸另外含有接头，其中聚核苷酸接头编码至少一个氨基酸，其中质粒含有多个克隆位点，其中克隆位点另外含有组氨酸标记基序；和(b)利用步骤(a)的载体转化巴斯德毕赤氏酵母酵母菌株，并在适当条件下培养酵母菌株生产至少含有接头聚核苷酸产生的一个氨基酸残基的抗血管生成蛋白质，其中蛋白质另外含有组氨酸标记基序，从而生产具有生物活性的抗血管生成蛋白质，或其突变体，衍生物，片段，或融合蛋白质。
26．权利要求25所述的方法，其中的聚核苷酸编码内抑制素，制管张素，或静息蛋白，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质，或它们的任何联合。
27．权利要求25的方法生产的生物活性抗血管生成蛋白质。
28．一种生产具有生物活性的制管张素，或其生物活性突变体，片段，衍生物或融合蛋白质的方法，该方法包括(a)在包括pPICzαA质粒的酵母表达载体中插入含有编码制管张素，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的聚核苷酸序列的分离的聚核苷酸，其中聚核苷酸另外含有聚核苷酸接头，其中聚核苷酸接头编码至少一个氨基酸，其中质粒含有多个克隆位点；和(b)利用步骤(a)的载体转化巴斯德毕赤氏酵母酵母菌株，并在适当的条件下培养酵母菌株生产含有接头聚核苷酸产生的至少一个氨基酸残基的制管张素，从而生产具有生物活性的制管张素，或其突变体，衍生物，片段，或融合蛋白质。
29．权利要求28所述的方法生产的生物活性制管张素。
30．一种生产生物活性制管张素，其生物活性突变体，片段，衍生物或融合蛋白质的方法，该方法包括(a)在含有pPICzαA质粒的酵母表达载体中插入含有编码制管张素，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的聚核苷酸序列的分离的聚核苷酸，其中聚核苷酸另外含有接头，其中接头编码至少一个氨基酸，其中质粒含有多个克隆位点，其中克隆位点另外含有组氨酸标记基序；和(b)利用步骤(a)的载体转化巴斯德毕赤氏酵母酵母菌株，并在适当的条件下培养酵母菌株生产其中蛋白质至少含有接头聚核苷酸产生的一个氨基酸残基和组氨酸标记基序的制管张素。
31．权利要求30所述的方法生产的生物活性制管张素。
32．一种生产生物活性内抑制素，或其生物活性突变体，片段，衍生物或融合蛋白质的方法，该方法包括(a)在含有pPICzαA质粒的酵母表达载体中插入含有编码内抑制素，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的聚核苷酸序列的分离的聚核苷酸，其中聚核苷酸另外含有聚核苷酸接头，其中聚核苷酸接头至少编码一个氨基酸，其中质粒含有多个克隆位点；和(b)利用步骤(a)的载体转化巴斯德毕赤氏酵母菌株，并在适当的条件下培养酵母菌株生产至少含有接头聚核苷酸产生的一个氨基酸残基的内抑制素，从而生产生物活性内抑制素，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
33．权利要求32的方法生产的生物活性内抑制素。
34．一种生产生物活性内抑制素，或其生物活性突变体，片段，衍生物或融合蛋白质的方法，该方法包括(a)在含有pPICzαA质粒的酵母表达载体中插入含有编码内抑制素，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的聚核苷酸序列的分离的聚核苷酸，其中聚核苷酸另外含有聚核苷酸接头，其中聚核苷酸接头编码至少一个氨基酸，其中质粒含有多个克隆位点，其中克隆位点另外含有组氨酸标记基序；和(b)利用步骤(a)的载体转化巴斯德毕赤氏酵母菌株，比在适当条件下培养酵母菌株生产至少含有接头聚核苷酸产生的一个氨基酸残基，其中蛋白质另外含有组氨酸标记基序，从而生产生物活性内抑制素，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
35．权利要求34所述的方法生产的生物活性内抑制素。
36．一种生产生物活性静息蛋白，其生物活性突变体，片段，衍生物或融合蛋白质的方法，该方法包括(a)在含有pPICzαA质粒的酵母表达载体中插入含有编码静息蛋白，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的聚核苷酸序列的分离的聚核苷酸，其中聚核苷酸另外含有聚核苷酸接头，其中聚核苷酸接头编码至少一个氨基酸，其中质粒含有多个克隆位点；和(b)利用步骤(a)的载体转化巴斯德毕赤氏酵母菌株，比在适当条件下培养酵母菌株生产至少含有接头聚核苷酸产生的一个氨基酸残基，从而生产生物活性静息蛋白，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
37．根据权利要求36的方法生产的生物活性静息蛋白。
38．一种生产生物活性制管张素，或其生物活性突变体，片段，衍生物或融合蛋白的方法，该方法包括(a)在含有pPICzαA质粒的酵母表达载体中插入含有编码制管张素，或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质的聚核苷酸序列的分离的聚核苷酸，其中聚核苷酸另外含有接头，其中接头编码至少一个氨基酸，其中质粒含有多个克隆位点，其中克隆位点另外含有组氨酸标记基序；和(b)利用步骤(a)的载体转化巴斯德毕赤氏酵母菌株，并在适当的条件下培养酵母菌株生产其中蛋白质至少含有接头聚核苷酸产生的一个氨基酸残基和组氨酸标记基序的制管张素，从而生产生物活性制管张素或其突变体，衍生物，片段或融合蛋白质。
39．权利要求38所述的方法生产的生物活性静息蛋白。
全文摘要
公开了制备具有抗生血管特性的蛋白质包括制管张素(angiostatin),内抑制素(endostatin)和静息蛋白(静息蛋白)。利用的系统是生产高效价生物活性蛋白质的酶母表达系统,特定地是巴期德毕赤氏酵母的酵母系统。
文档编号C12N15/12GK1284134SQ98811934
公开日2001年2月14日 申请日期1998年12月8日 优先权日1997年12月8日
发明者维卡斯·P·萨克哈特姆 申请人:贝斯以色列护理医疗中心