专利名称：人载脂蛋白ApoAⅠ在毕赤氏酵母胞内表达的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人载脂蛋白ApoA I的表达方法。具体是通过构建毕赤氏酵母重组工程菌株，经摇瓶发酵和诱导在酵母细胞内高效表达rApoA I蛋白。
背景技术：
人载脂蛋白ApoA I(apolipoproteinAI)由243个氨基酸残基组成，分子质量为28.3KD，主要在肝脏中合成，是高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)的重要组分，也是HDL功能的主要执行者。ApoA I在胆固醇的转运和代谢、抗动脉粥样硬化、抗内毒素、抗炎、抗病毒及抑制急性相炎症反应造成的组织损伤中起重要作用，因此其已成为脂类代谢研究的重点之一。
目前的研究表明，在肝及周围组织细胞的细胞膜上存在高亲和力的ApoA I和HDL受体，并发现肝脏选择性摄取HDL胆固醇酯。因此游离的HDL和ApoA I具有肝脏靶向的特点，这一特点使得ApoA I在肝脏靶向药物研究中有良好的应用前景。
HDL和ApoA I主要从人血清中分离提取，但产量低，成本高，而且由于人血液供应短缺和难以解决血液污染等问题，很难实现大规模生产，因此大大限制了其开发和应用。用基因工程方法构建重组ApoA I工程菌株，是大规模生产ApoA I蛋白的最佳手段。目前国外有人用大肠杆菌表达rApoA I，但表达水平低，约为20mg/L。国内有人用昆虫杆状病毒表达系统表达rApoA I，虽表达水平较高，但无法大规模生产，且培养液成本也很高。由于毕赤氏酵母表达系统具有真核系统的翻译后加工的特点，且发酵条件简单，表达水平高，表达产物活性好，因此，本发明选用毕赤氏酵母表达系统进行人载脂蛋白基因apoA I的表达研究，结果，研究取得重要的突破，其中分泌型表达菌株的表达水平达到180mg/L左右(摇瓶)，而胞内表达菌株的表达水平达到40mg/L左右(摇瓶)，从保持ApoA I蛋白分子的完整性角度看，胞内表达优于分泌表达。目前国内外均未见采用毕赤氏酵母表达rApoAI的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达水平高、生产成本低的人载脂蛋白ApoA I的表达方法。
本发明提出的人载脂蛋白ApoA I的表达方法，是将人工合成的apoA I基因插入胞内表达质粒pPIC3.5k(INVJTROGEN公司产品)；线性化后电击导入毕赤化酵母GS115(INVJTROGEN公司产品)中，获得重组工程菌株；经摇瓶发酵和甲醇诱导，实现rApoAI的胞内表达。收集酵母细胞，用SDS-PAGE和Western Blotting检测，证明酵母细胞内有明显的rApoA I蛋白表达，其分子质量与人血浆中提取的ApoA I相同。
本发明的具体操作步骤如下(1)构建重组表达质粒把人工合成的apoA I基因插入pPIC9k质粒(INVJTROGEN公司产品)，得到pPIC9k-apoAI重组质粒，以此为模板，设计引物进行PCR扩增。将含有apoA I基因的PCR产物用EcoRI和BamH I双酶切，胞内表达质粒pPIC3.5k也用EcoRI和BamH I双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，获得重组表达质粒pPIC3.5k-apoA I；(2)筛选重组工程菌株将重组表达质粒pPIC3.5k-apoA I经Bgl II酶切，用电击转化毕赤氏酵母GS115，转化液涂布RDB平板，培养后获得转化子；转化子经G418抗性筛选，获得高抗性菌株；G418高抗性菌株经PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌株GS115/pPIC3.5k-apoA I；(3)摇瓶发酵将高表达的重组工程菌株接种于BMGY培养基生长，然后转入BMMY培养基中进行甲醇诱导，使胞内表达rApoA I。
(4)rApoA I的SDS-PAGE检测取发酵液离心，收集菌体，用15％SDS-PAGE检测，有明显的r ApoA I蛋白的表达，(表达水平约为40mg/L)。
(5)rApoA I的Western blotting检测Western blotting中的一抗为Rabbit anti-Human ApolipoproteinA-I，二抗为Goat anti-Rabbit IgG(Alkaline phosphatase conjugated)。
鉴于人载脂蛋白ApoA I具有抗动脉粥样硬化、抗内毒素和抗炎症等功能，而且在肝脏靶向药物研究中有良好的应用前景，因此采用毕赤氏酵母成功表达rApoA I，为今后将ApoA I开发成一类新药或作为靶向药物的载体，奠定了基础。
图1本发明的重组表达质粒pPIC3.5k-apoA I的构建2本发明的酵母转化子的PCR鉴定1.DL-2000 Marker；2、3、pPIC3.5k-apoAI；4、宿主菌GS115；5、GS115/pPIC9k-apoA I.
图3本发明的SDS-PAGE电泳图谱m、蛋白分子质量标准；1.GS115细胞抽提物；2、3、4、pPIC3.5k-apoA I细胞抽提物；5、人血浆中提取的ApoA I；6、GS115/pPIC9k-apoAI发酵上清液。
图4本发明的Western blotting检测1、GS115/pPIC9k-apoA I发酵上清液；2、GS115/pPIC3.5k-apoA I细胞抽提物；3、人血浆中提取的ApoA I；4、GS115细胞抽提物。
具体实施例方式
实施例1、重组表达质粒的构建和鉴定以带有人工合成基因apoA I的质粒pPIC9k-apoA I为模板，设计引物进行PCR扩增。正向引物5’-GGGGATCCAAACGATGGATGAACCACCTCAGTCTCCATGG-3’，5’端引入BamH I位点，反向引物5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。PCR反应条件按常规设置进行，PCR产物用EcoR I和BamH I双酶切，胞内表达质粒pPIC3.5k也用EcoR I和BamH I双酶切，然后进行连接和转化。从转化子中提取重组表达质粒pPIC3.5k-apoA I，酶切鉴定和DNA序列测定，证明重组表达质粒的构建完全正确。
实施例2、重组表达质粒电转化毕赤氏酵母GS115接种毕赤氏酵母GS115(his4)于YPD培养基中，28-30℃振荡培养至OD600＝1.3-1.5，离心，收集菌体，用预冷无菌水和1mol/L山梨醇各洗涤一次，最后用1mol/L山梨醇200μl悬浮，即得到GS115感受态细胞。取80μl GS115感受态细胞和5μg以Bgl II酶切的重组表达质粒混合，在1300V，25μF，200Ω条件下电击转化，用1mol/L山梨醇1ml悬浮后，涂布RDB平板，28-30℃培养3-4天，结果得到1400多个转化子。
实施例3、G418高抗性酵母转化子的筛选将在RDB平板上生长的1400多个酵母转化子菌落点种到含G418浓度为1.5、3.0、4.0mg/ml的YPD平板上，28-30℃培养，逐级筛选G418抗性菌株。结果在含4mg/mlG418平板上获得27个菌株。
实施例4、酵母转化子的PCR鉴定取上述G418高抗性菌株的菌落置于无菌水中，混匀和煮沸，离心后取上清液进行PCR。引物参见实施例1。PCR反应条件按常规设置进行。阳性克隆为重组工程菌株GS115/pPIC3.5k-apoA I实施例5、高表达重组工程菌的筛选将重组工程菌株GS115/pPIC3.5k-apoA I接种于含3mlBMGY的试管，28-30℃振荡培养16-20小时，取1.5ml菌液转入50ml BMGY培养基(摇瓶)中，28-30℃振荡培养22-26小时，菌液离心，收集菌体。用15ml BMMY培养基(摇瓶)悬浮菌体，28-30℃振荡培养70-75小时，每24小时补加一次甲醇。取发酵液离心，收集菌体，用15％SDS-PAGE检测。结果获得4株高表达菌株，选其中5号菌株作为实验菌株，其胞内表达的rApoA I的分子质量与人血浆中分离的ApoA I相同，r ApoA I占菌体总可溶性蛋白的7.86％，表达水平约为40mg/L。
实施例6、表达产物的Western blotting鉴定将电泳的SDS-PAGE凝胶剥离，电转移到NC薄膜上，NC膜用5％脱脂牛奶封闭；加入一抗(Rabbit anti-Human ApolipoproteinA-I)，37℃振荡1h，洗涤2次；加入二抗(Goatanti-Rabbit IgG(Alkaline phosphatase conjugated)，37℃振荡1h，洗涤1次；用底物缓冲液洗涤1次；在10ml碱性磷酸酶底物缓冲液中加入33μl BCIP和66μl NBT，将NC膜浸入，37℃显色3min；用水冲洗终止反应。
权利要求
1.一种人载脂蛋白ApoA I在毕赤氏酵母胞内表达的方法，其特征是将人工合成的apoAI基因插入胞内表达载体pPIC3.5k；线性化后电击导入毕赤氏酵母GS115中，获得重组工程菌株；经过摇瓶发酵和甲醇诱导，实现rApoA I的胞内表达；
2.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于具体操作步骤如下(1)构建重组表达质粒把人工合成的基因apoA I插入质粒pPIC9k，得到重组质粒pPIC9k-apoA I，以此为模板，设计引物进行PCR扩增，将含有apoA I基因的PCR产物用EcoR I和BamH I双酶切，胞内表达质粒pPIC3.5k也用EcoR I和BamH I双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，获得重组表达质粒pPIC3.5k-apoA I；(2)筛选重组工程菌株将重组表达质粒pPIC3.5k-apoA I经Bgl II酶切，用电击转化毕赤氏酵母GS115，转化液涂布RDB平板，培养后获得转化子；转化子经G418抗性筛选，获得高抗性菌株；G418高抗性菌株经PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌株GS115/pPIC3.5k-apoA I；(3)摇瓶发酵将高表达的重组工程菌株接种于BMGY培养基生长，然后转入BMMY培养基中进行甲醇诱导，使胞内表达rApoA I。
3.根据权利要求2所述表达方法，其特征在于PCR引物序列如下正向引物5’-GGGGATCCAAACGATGGATGAACCACCTCAGTCTCCATGG-3’反向引物5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’
全文摘要
本发明属生物工程技术领域，具体为一种人载脂蛋白ApoA I在毕赤氏酵母胞内表达的方法。它将人工合成的apoA I基因插入胞内表达质粒pPIC3.5k，电击导入毕赤氏酵母菌株GS115，经摇瓶发酵和甲醇诱导，在酵母细胞内有明显的rApoA I蛋白表达，其分子质量与人血浆中提取的ApoA I相同。
文档编号C12P21/02GK1637145SQ20041008931
公开日2005年7月13日 申请日期2004年12月9日 优先权日2004年12月9日
发明者宋大新, 赵志安, 杨婷婷, 张淼, 张彦 申请人:复旦大学