淀粉脱支酶的制作方法

专利名称：淀粉脱支酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及被设计成用于包括液化步骤和糖化步骤的淀粉转化过程的新型淀粉脱支酶、特别是支链淀粉酶和异淀粉酶，并涉及这类酶的生产方法以及这类酶在淀粉转化过程中的用途。
背景技术：
将淀粉诸如玉米、马铃薯、小麦、木薯和稻米的淀粉用作商业上大规模生产糖的原料，所生产的糖诸如高果糖糖浆、高麦芽糖糖浆、麦芽糖糊精、直链淀粉、G4-G6寡糖类和其它诸如脂肪替代品这样的碳水化合物产品。淀粉的降解淀粉通常由约80％的支链淀粉和约20％的直链淀粉组成。支链淀粉是一种支链的多糖，其中直链α-1,4 D-葡萄糖残基由α-1,6糖苷键连接。支链淀粉部分被α-淀粉酶所降解，所述的α-淀粉酶可水解α-1,4-糖苷键以便生成支链和直链寡糖。被延长的α-淀粉酶引起的支链淀粉的降解导致生成所谓的对由α-淀粉酶产生的进一步水解不敏感的α-极限糊精。脱支酶可以将支链寡糖类水解成直链寡糖类。将直链寡糖类水解成D-葡萄糖的葡糖淀粉酶可以将剩余的支链寡糖类解聚成D-葡萄糖。
直链淀粉是一种由通过α-1,4-糖苷键彼此连接的D-吡喃葡萄糖单位组成的直链多糖。直链淀粉被α-淀粉酶降解成较短的直链寡糖类，该直链寡糖类被葡糖淀粉酶解聚成D-葡萄糖。
在将淀粉转化成糖的情况中，淀粉被解聚。解聚过程由预处理步骤和两个或三个连续加工步骤即液化过程、糖化过程和取决于所需终产品的任意异构化过程组成。天然淀粉的预处理天然淀粉由在室温下不溶于水的微粒组成。当加热含水淀粉浆时，所述的微粒膨胀并最终破裂，从而使淀粉分子分散入溶液。在这种“胶凝”过程中，粘度显著增加。在一般的工业化过程中如果固体的含量为30-40％，那么必须将淀粉稀释或使其“液化”以便于处理。目前在大多数情况中通过酶降解来获得这种粘度的降低。液化在液化步骤中，长链淀粉被α-淀粉酶(例如TermamylTM，商购自Novo Nordisk A/S,Denmark)降解成较小的支链和直链单位(麦芽糖糊精)。液化过程一般在约105-110℃下进行约5-10分钟，随后在约95℃下进行约1-2小时。pH通常在约5.5-6.2的范围。为了确保酶在这些条件下的最佳稳定性，加入钙例如1mM的钙(40ppm的游离钙离子)。在这种处理步骤后，液化的淀粉具有的“右旋糖当量值”(DE)为10-15。糖化在液化过程后，通过加入葡糖淀粉酶(例如AMGTM，商购自NovoNordisk A/S)和脱支酶诸如异淀粉酶(参见例如美国专利4,335,208)或支链淀粉酶(例如PromozymeTM，商购自Novo Nordisk A/S)(参见例如美国专利4,560,651)而将麦芽糖糊精转化成右旋糖。在该步骤前，使pH值降至低于4.5、例如约3.8，维持高温(95℃以上)例如约30分钟的期限，从而使液化的α-淀粉酶失活以便减少称作“潘糖前体”的短寡糖类的形成，所述的“潘糖前体”不能被脱支酶合适地水解。
然后使温度降至60℃、加入葡糖淀粉酶和脱支酶并使糖化过程进行约24-72小时。
一般来说，当在液化步骤后使α-淀粉酶变性时，少量产物中包括不能被支链淀粉酶或AMG降解的潘糖前体。如果来自液化步骤的活性淀粉酶在糖化过程中出现(即没有变性)，那么其浓度可以为1-2％乃至更高，由于它明显降低糖化产率，所以是非常不需要的。由于该原因，所以另外优选的情况是α-淀粉酶是一种能够将淀粉分子降解成长的支链寡糖类(诸如例如FungamylTM-样α-淀粉酶)而不是较短的支链寡糖类的酶。异构化当所需的终产品糖是例如高果糖糖浆时，可以通过酶异构化将右旋糖糖浆转化成果糖。在糖化过程后，使pH值增至6-8的范围，优选pH约为7.5，并通过离子交换除去钙。然后使用例如固定化葡糖异构酶(诸如SweetzymeTM，商购自Novo Nordisk A/S)将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。脱支酶将可以作用于支链淀粉的脱支酶分成两类分别为异淀粉酶类(E.C.3.2.1.68)和支链淀粉酶类(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶可水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-糖苷支链键且可以通过异淀粉酶不作用于普鲁兰并通过其对α-极限糊精的有限作用而与支链淀粉酶区别开来。
当将酸稳定的ermamylTM-样”α-淀粉酶用于维持整个糖化过程中淀粉酶的活性时(没有失活)，应考虑到降解特异性。在这方面需要维持α-淀粉酶在糖化过程始终的活性，这是因为这样可使得淀粉葡糖苷酶(amyloglucidase)的添加量降低，在经济上有利并且可减少AMGTM的缩合产物异麦芽糖，由此增加DE(右旋糖当量)数值。
从上述讨论中明显看出公知的淀粉转化过程按照一系列步骤进行，这是因为对各种酶的不同需要根据例如温度和pH来决定。因此，要求能够改造这些酶中的一种或多种以便全部过程可以按照更为经济和有效的方式进行。在这方面，一种可能性是改造另外的热不稳定性脱支酶以便使它们在高温下更为稳定。本发明涉及这类热稳定性脱支酶，其应用可产生将在下面详细讨论的许多重要的优点。本发明还涉及具有可变的底物特异性的淀粉脱支酶。
发明概括本发明的一个目的是由此提供在高温下适用于淀粉转化过程的热稳定性脱支酶例如支链淀粉酶和异淀粉酶，特别是使用基因工程技术以便鉴定和合成合适的酶变体。本发明的另一个目的是提供具有可变的底物特异性的新型淀粉脱支酶。
从最广泛的方面来说，本发明的特征由此可以在于涉及具有关于例如热稳定性或底物特异性的改善特性的新型淀粉脱支酶，并涉及生产这类酶的方法，以及这类酶在淀粉转化过程中的用途。
在一个特定的方面中，本发明涉及一种亲代淀粉脱支酶的基因工程变体，该酶变体在pH4-6的范围内具有比亲代酶改善的热稳定性。
本发明的另一个方面涉及一种亲代淀粉脱支酶的基因工程变体，该酶变体比亲代酶具有增加的对支链淀粉和/或糖原的活性。
本发明的进一步方面涉及一种用于生产具有增加的热稳定性的淀粉脱支酶变体的方法，该方法包括下列步骤-鉴定亲一代淀粉脱支酶中的一种或多种氨基酸残基和/或与热稳定性相关的氨基酸区；-通过亲一代和亲二代淀粉脱支酶的氨基酸序列对比来鉴定亲二代淀粉脱支酶中的一种或多种同源氨基酸残基和/或氨基酸区；和-使亲二代淀粉脱支酶中的一种或多种同源氨基酸残基和/或氨基酸区发生突变以便产生具有增加的热稳定性的酶变体。
本发明的另外一个方面涉及一种用于生产具有改变的底物特异性的淀粉脱支酶变体的方法，该方法包括下列步骤-鉴定亲一代淀粉脱支酶中与对所需底物具有的特异性相关的至少一种氨基酸环中的一种或多种氨基酸残基；-通过亲一代和亲二代淀粉脱支酶的氨基酸序列对比来鉴定亲二代淀粉脱支酶中至少一种相应的环中的一种或多种同源氨基酸残基；和-使亲二代淀粉脱支酶中至少一种环中的一种或多种同源氨基酸残基发生突变以便产生具有改变的底物特异性的酶变体。
至少在本发明上下文中，术语“环”指的是所述序列中的β-链/折叠部分后的序列部分。所述的“β-链/折叠”可以通过对本发明的序列与具有公知三维结构的序列进行多重序列对比来鉴定。这类序列对比可以使用获自例如UWGCG软件包(Program Manual for theWisconsin Package，版本8,1994年8月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)的标准序列对比程序来进行。
公知的三维酶结构商购自Brookhaven数据库。它们的实例是米曲霉TAKA α-淀粉酶的三维结构(Swift等，1991)；黑色曲霉酸性淀粉酶的三维结构(Brady等，1991)；猪胰α-淀粉酶的结构(Qian等，1993)；和大麦α-淀粉酶的三维结构(Kadziola等，1994，《分子生物学杂志》(Joural of Molecular Biology)239:104-121；A.Kadziola,丹麦哥本哈根大学化学系论文(Thesis,Dept of Chemistry,U.ofCopenhagen,Denmark))。
本发明还提供了一种用于将淀粉转化成一种或多种糖的方法，该方法包括使用至少一种如本文所述的酶变体使淀粉脱支的步骤。发明详述在本发明的上下文中，术语“热稳定的”一般指的是本发明的脱支酶变体比相关的亲代酶具有改善的热稳定性这一事实。热稳定性的改善程度可以根据诸如亲代酶的热稳定性和酶变体的应用即主要是用于液化还是用于糖化或用于这两个步骤这样的因素而变化。从下面的讨论中明显看出为了进行糖化，所述的酶变体应在至少约63℃、优选至少约70℃的温度下的糖化步骤中将酶活性保持在基本的程度；同时设计成用于液化步骤的酶变体应能够在至少约95℃的温度下将酶的活性维持在基本的程度。
本发明酶变体的改善的热稳定性尤其可以根据下列标准中的一种或多种来定义在一个实施方案中，本发明的酶变体具有由使用下述方法的差示扫描量热法(DSC)定义的改善的热稳定性。
在另一个实施方案中，本发明的酶变体具有由在本文所述的“液化的T1/2检测试验”中使用pH5.0和95℃的温度条件下增加的半衰期(T1/2)来定义的改善的热稳定性，所述的半衰期的增加至少约为5％、优选至少约为10％、更优选至少约为15％、更优选至少约为25％、最优选至少约为50％，诸如至少100％。根据该定义的酶变体适用于淀粉转化过程中的液化步骤。
另一方面或另外，可以将适用于液化的酶变体定义为具有由在本文所述的“液化后残余活性的检测试验”中使用pH 5.0和95℃的温度条件下增加的残余酶活性所定义的改善的热稳定性，所述的残余酶活性的增加至少约为5％、优选至少约为10％、更优选至少约为15％、更优选至少约为25％、最优选至少约为50％。
在另一个实施方案中，本发明的酶变体具有由在本文所述的“糖化的T1/2检测试验”中使用pH4.5和70℃的温度条件下增加的半衰期(T1/2)来定义的改善的热稳定性，所述的半衰期的增加至少约为5％、优选至少约为10％、更优选至少约为15％、更优选至少约为25％、最优选至少约为50％，诸如至少100％。这类变体适用于淀粉转化过程中的糖化步骤。
另一方面或另外，可以将适用于糖化的酶变体定义为具有由在本文所述的“糖化后残余活性的检测试验”中使用pH4.5和63℃的温度条件下增加的残余酶活性所定义的改善的热稳定性，所述的残余酶活性的增加至少约为5％、优选至少约为10％、更优选至少约为15％、更优选至少约为25％、最优选至少约为50％。优选的情况是，在70℃的温度下检测时也可以观察到这种改善的热稳定性。
本文对于给定的酶变体和给定的一组温度、pH和时间的条件所用的术语“基本活性”指的是在与上述改善的热稳定性相关的上述给定的一组条件下所述酶变体的相对酶活性与亲代酶的相对活性相比至少约为25％，优选至少约为50％、特别是至少约为60％、尤其是至少约为70％，诸如至少约为90％或95％，例如至少约为99％。
“来源于”给定酶(“亲代酶”)的酶变体指的是亲代酶的氨基酸序列已经被修饰，即经过如下所述的置换、缺失、插入和/或环转移以便产生所述的酶变体。就由象微生物这样的生物体产生的亲代酶而言，其中本发明的酶变体来源于该亲代酶，该酶变体可以通过适当转化用于产生亲代酶的相同或相似的微生物或其它生物体来产生。
本发明的热稳定性脱支酶的一个优点在于它们在糖化步骤前能够同时进行液化和脱支步骤。这在以前是不可能的，因为具有可接受的特异性活性的公知支链淀粉酶和异淀粉酶是热不稳定性的并且在高于60℃的温度下失活。(某些来自热球菌属的热稳定性支链淀粉酶是公知的，但是它们在高温下具有极低的特异性活性且由此不适合于本发明的目的)。在与α-淀粉酶共同起作用的液化过程中，通过使用本发明的热稳定性脱支酶脱支，可以减少潘糖前体的形成，由此降低了终产物中潘糖的含量并增加了总体糖化产率。按照这种方式也能够延长液化过程的时间而不会危害大量潘糖前体的形成。通过延长液化步骤，使DE产率从10-15增加至例如15-20，从而减少了对葡糖淀粉酶的需求。这种降低的对葡糖淀粉酶的需求反过来对减少不需要的异麦芽糖形成是有利的，从而导致葡萄糖的产率增加。此外，降低葡糖淀粉酶的添加量能够使糖化步骤在高于现有技术中所用的正常的约30-35％底物浓度(较高的DS、干燥物质浓度)的条件下进行。这可以降低下游蒸发过程的成本、例如在高果糖玉米糖浆加工过程中的成本，且还可以减少糖化反应的时间，由此增加生产能力。另外一个优点在于在液化过程中所用的α-淀粉酶在这种情况中不需要失活/变性。
此外，还能够在糖化过程中使用本发明的热稳定性脱支酶，这种糖化过程因几个原因是有利的。在常规的淀粉糖化过程中，过程温度不超过60℃，因为存在糖化支链淀粉酶和AMGTM均不是充分热稳定性的而不能使用较高的温度这一事实。然而，当非常需要在高于约60℃、特别是高于63℃、例如约为70℃的温度下进行该过程以便在相对长的糖化步骤过程中减少微生物生长时，它是不利的。此外，较高的过程温度通常导致每mg酶中的活性较高(较高的特异性活性)，由此能够降低所用酶的重量和/或获得较高的总体酶活性。较高的温度还在糖化过程后产生较高的干物质含量，它对降低蒸发过程的成本来说是有利的。
尽管在用于液化过程时认为热稳定性异淀粉酶比热稳定性支链淀粉酶更为有利(因为异淀粉酶的特征在于它们对支链淀粉具有特异性且对高分子量糊精具有活性)，但是优选的方法是改变支链淀粉酶的特异性以便在对较长的支链糊精具有改善的活性方面是更为“异淀粉酶样”的。在各种支链淀粉酶中，在这方面存在主要差别，甚至在同样来源于芽孢杆菌属的支链淀粉酶中也是如此。用于测定稳定性和活性的方法热稳定性通过经在加速强化的条件下温育所述的酶而测定残余活性可以检测支链淀粉酶和异淀粉酶的热稳定性，所述的条件包括在pH4.5的不含稳定的糊精基质的50mM乙酸钠缓冲液中(诸如在糖化过程中一般存在约35％的干物质)。在例如63℃、70℃、80℃、90和95℃的等温线上可以测定稳定性，从而确定1小时的时间期限过程中在定期间隔(例如每5或10分钟1次)取自水浴中的样品的残余活性。为了测定用于液化目的的稳定性，使用5.0的pH值、95℃的温度和30分钟的总检测时间(“液化后对残余活性的检测试验”)。为了测定用于糖化目的的稳定性，使用4.5的pH值、63℃或70℃的温度和30分钟的总检测时间(糖化后对残余活性的检测试验”)。
另一方面，可以将热稳定性表示为“半衰期”(T1/2)，它被定义为在一组给定条件下所检测的酶活性下降至检测开始时原始活性的50％的时间。在这种情况中，“用于液化的T1/2检测试验”使用5.0的pH值和95℃的温度，而“用于糖化的T1/2检测试验”使用4.5的pH值和70℃的温度。或者，该检测试验将如上述对相应残余活性检测试验所述来进行。活性用于测定还原糖的Somogyi-Nelson法使用用于测定还原糖的Somogyi-Nelson法(《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)153,375(1944))既可以测定支链淀粉酶的活性又可以测定异淀粉酶的活性。该方法以下列机理为基础糖将铜离子还原成氧化亚铜，氧化亚铜与砷酸盐钼酸盐试剂反应生成可用分光光度法测定的蓝色。所测定的溶液中必须含有50-600mg的葡萄糖/升。用于Somogyi-Nelson法的程序如下样品值将1ml的糖溶液吸入试管。加入1ml铜试剂。用玻璃珠塞住试管。将试管置于沸水浴上20分钟。冷却该试管。加入1ml的Nelson’s显色试剂。振摇该试管但不反转它。加入10ml的去离子水。反转试管并剧烈振摇。在520nm处测定吸收度，在将液体转入比色杯中之前立即反转试管一次。
空白值与对样品值所述的程序相同，不过用水替代糖溶液。
标准品值与对样品值所述的程序相同。计算在0-2范围内，吸收度与糖的量成正比。
试剂
1.Somogyi’s铜试剂将35.1gNa2HPO4·2H2O和40.0g酒石酸钠钾(KNaC4H4O2·4H2O)溶于700ml去离子水。加入100ml的1N氢氧化钠和80ml的10％硫酸铜(CuSO4·5H2O)。将180g的无水硫酸钠溶于该混合物并用去离子水将体积加至1升。
2.Nelson’s显色试剂将50g的钼酸铵溶于900ml去离子水。然后加入42ml的浓硫酸，随后将6g的砷酸氢二钠七水合物溶于50ml的去离子水，加入去离子水使体积达1升。在使用前使该溶液在37℃下稳定24-48小时并将其保存在置于暗处的加玻璃塞的棕色玻璃瓶中。
3．标准品将100mg的葡萄糖(无水)溶于1升去离子水。底物特异性用于测定和特征化支链淀粉酶和异淀粉酶对各种底物(例如支链淀粉、糖原和普鲁兰)的作用和特异性曲线的方法由Kainuma等在《碳水化合物研究》(Carbohydrate Reseach)61(1978)345-357中描述。使用这些方法可以测定异淀粉酶或支链淀粉酶的相对活性并且可以评估与亲代酶相对活性相比较的本发明酶变体的相对活性，例如，由此来确定支链淀粉酶变体是否比亲代酶对高分子量糖类诸如支链淀粉具有所需增加的特异性。淀粉的转化如上所述，在本发明的一个实施方案中，淀粉转化过程包括在液化步骤中使用本发明的热稳定性脱支酶与α-淀粉酶一起进行脱支的步骤。液化步骤一般在pH4.5-6.5、例如5.0-6.2、95-110℃的温度范围内进行1-3小时、优选1.5-2小时的期限。然而，优选pH尽可能低，例如4.5-5.0，条件是用于液化的酶在上述pH下具有足够的稳定性。如果α-淀粉酶是钙依赖性的，那么在液化步骤中可以加入30-50ppm、诸如约40ppm(或0.75-1.25mM，诸如约1mM)用量的钙以稳定酸。如上所述，在液化步骤后α-淀粉酶不需失活以便在这种情况中减少潘糖的形成。
可以用于液化步骤的特异性α-淀粉酶的实例包括地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶，诸如商购的产品Termamyl、SpezymeAA、SpezymeδAA、Maxamyl和Kleistase；以及WO96/23874(NovoNordisk)和PCT/DK97/00197(Novo Nordisk)中所述的α-淀粉酶突变体。
可以用作本发明亲代酶的异淀粉酶类包括但不限于来源于嗜热acrhaebacterium嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius的热稳定性异淀粉酶(Maruta,K等(1996)《生物化学和生物物理学誌》(Biochimica et Biophysica Acta)1291,p.177-181)、来源于海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)的异淀粉酶(例如SEQ ID NO3的异淀粉酶)和来源于假单胞菌属例如淀粉皮假单胞菌(Pseudomonasamyloderamosa)的异淀粉酶(例如EMBL数据库寄存号J03871或基因库寄存号N90389中公开的淀粉皮假单胞菌异淀粉酶)。
可以用作本发明亲代酶的支链淀粉酶类的实例包括但不限于来源于例如热球菌属的热稳定性支链淀粉酶或来源于例如芽孢杆菌属菌株诸如Bacillus acidopullulyticus(例如PromozymeTM或SEQ ID NO 1)或Bacillus deramificans(例如SEQ ID NO 2或具有基因库寄存号为Q68699的Bacillus deramificans支链淀粉酶)的蛋白质工程支链淀粉酶。
尽管现有技术用于糖化的方法使用不超过约60℃的温度，但是本发明提供了可以在高温下、即在至少约为63℃且优选在至少约为70℃下保持活性的热稳定性脱支酶以便消除微生物生长的可能性。用于糖化的合适的葡糖淀粉酶的实例包括黑色曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶诸如AMGTM。糖化过程一般在约4.0-4.5、优选约为4.0的pH下进行约24-72小时。
当所需的最终的糖产品是例如约50％果糖糖浆的高果糖糖浆时，在pH6-8左右、优选约为7.5下用一种异构酶使形成的D-葡萄糖异构化。合适的异构酶的实例是一种葡萄糖异构酶诸如来源于鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)的葡萄糖异构酶。该异构酶可以是一种固定化葡萄糖异构酶诸如Sweetzyme。
如果在液化步骤前加入，那么通常除去钙。支链淀粉酶和异淀粉酶工程支链淀粉酶和异淀粉酶属于族13淀粉酶(Henrissat,B.等《生物化学杂志》(Biochem.J.)293:781-788,1993)。这提示它们在由A、B和C结构域组成的分子中心部分具有相同的总体结构。B结构域在大小和结构上变化十分明显，而认为其它两种结构域一般具有高度的同源性。A结构域由α-8/β-8结构(β-桶)和β-链与α-螺旋(不过，在某些情况中螺旋可以不存在)之间的8个环组成。来源于β-桶的β-链部分的序列表明了底物结合区。这些区对于酶的特异性来说特别有意义(Svensson,B.等《生物化学协会学报》(Biochemical SocietyTransactions)第20卷；McGregor《蛋白质化学杂志》(J.Prot.Chem.)7:399,1988)。然而，通过使用有关特异性序列的信息以及用于分析支链淀粉酶和异淀粉酶序列的一般策略，本发明提供了能够改造这些酶所必需的工具，从而生产了具有改善的热稳定性和/或特异性的变体。序列表本文参照下列序列表SEQ ID NO 1来自Bacillus acidopullulyticus的支链淀粉酶；SEQ ID NO 2来自Bacillus deramificans的支链淀粉酶；SEQ ID NO 3+SEQ ID NO 12来自海洋红嗜热盐菌(Rhodothermusmarinus)的异淀粉酶；SEQ ID NO 4来自淀粉皮假单胞菌JD270的异淀粉酶(Chen,JH等(1990)《生物化学和生物物理学誌》(Biochimica et BiophysicaActa)1087,pp.307-315)(Brookhaven数据库1BF2)；
SEQ ID NO 5来自肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)的支链淀粉酶(Kornacker等《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)4:73-85(1990))；SEQ ID NO 6来自产气克雷白氏杆菌(Klebsiella aerogenes)的支链淀粉酶(Katsuragi等《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)169:2301-2306(1987))；SEQ ID NO 7来自假单胞菌属种类SMP1的异淀粉酶(Tognoni,A.等，美国专利5,457,037)；SEQ ID NO 8来自Favobacterium odoratum的异淀粉酶(JP9623981,Susumu Hizukuri等)；SEQ ID NO 9来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的异淀粉酶ATCC33909(《生物化学和生物物理学誌》(Biochimica etBiophysica Acta)1291(1996),177-181,Kazuhiko Maruta,K等)；SEQ ID NO 10来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的异淀粉酶(基因库寄存号Y08256)；SEQ ID NO 11来自玉米(Zea mays)的异淀粉酶(寄存号U18908)SEQ ID NO 14:Bacillus acidopullulyticus pulB基因(SEQ IDNO:13)。支链淀粉酶的结构附

图1表示4种不同的支链淀粉酶的氨基酸序列以及这些序列的对比(alignment)。以这种序列对比所产生的信息为基础，能够进行同源置换以便获得所需的改善的热稳定性和/或改变的底物特异性的特征。
4种序列是SEQ ID NO 5、6、1和2。异淀粉酶的结构附图2表示7种不同的异淀粉酶的氨基酸序列以及这些序列的对比。以这种序列对比所产生的信息为基础，能够进行同源置换以便获得所需的改善的热稳定性和/或改变的底物特异性的特征。
7种序列是SEQ ID NO 4、7、8、9、10、3和11。
目前已经在Brookhaven数据库中的1BF2号下公开了淀粉皮假单胞菌异淀粉酶的X-射线结构。该结构证明了序列对比法的总体情况，而且表明与所提示的对比具有一定的差异。从淀粉皮假单胞菌异淀粉酶(1BF2)的3D结构中推定的正确环数如下所示环 提示的 从结构中推定的1.210-230211-2312.250-292251-2953.319-376319-3304.401-436401-4365.461-479461-4686.482-485482-5037.530-539533-5808.605-636606-636支链淀粉酶和异淀粉酶的序列对比附图3表示所选择的支链淀粉酶和异淀粉酶(SEQ ID NO 1、2、3和4中的那些)的“关键对比序列(key alignment)”，换句话说，是表示相应序列中同源氨基酸残基的最适宜的对比序列。虚线(“----”)表示推定的β-链位置。各组虚线后是环数，表明在环序列中的位置。在下面的表1中可以找到有关各环位置的信息。
通过将来自两种或多种相关淀粉脱支酶“关键对比序列”的最为同源的序列与新型淀粉脱支酶的序列进行比较并对这两种序列进行序列对比可以确定来自新型序列的残基，这些残基与来自关键对比序列的序列中的残基同源。例如，通过使用来自UWGCG软件包(Program Manualfor the Wisconsin Package，版本8,1994年8月，Genetics ComputerGroup,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)的GAP程序可以发现这种同源性。然后通过使用教科书的编辑程序或其它合适的计算机程序可以将新型序列放入所述的关键对比序列中。
下面的表1提供了有关所关注的选择区在各种所选择的支链淀粉酶和异淀粉酶的环中的位置的信息，这些环区相对于产生本发明酶变体的修饰而言是一般关注的。下面的环3构成结构域B(MacGregor,1988)，而其它的环属于结构域A。表1
如果对于表1中给定的酶和环来说列出了1个以上的区，那么首先列出的区(即a．)是在每种情况中所述环的预测的长度。下一个区(即b．)是优选用于修饰的区，而最后的区(即c．)是最优选的。
通过在一个或多个这些环中进行修饰即置换、缺失、插入和/或环转移可以生产具有关于改善的热稳定性和/或改变的底物特异性的所需特性的工程蛋白质。本发明的酶变体可以含有任意合适的一种或多种置换、缺失、插入和/或环转移的组合以便获得改善的热稳定性和/或改变的活性的所需特性。
按照本发明，SEQ ID NO:1的环区即369-397(a．表示的区)可以适当被相应的SEQ ID NO.4的空间排列的区即176-195(即a．表示的区)所取代。此外，环1的371-385区(SEQ ID NO:1)(即b．表示的区)可以相应地被环1的179-193区(SEQ ID NO.4)(即b．表示的区)所取代。
在本发明的上下文中，将简化名称用于表示给定位置上的氨基酸置换。例如“G81P”指的是81位上的甘氨酸残基被脯氨酸残基所置换，而“F489G,A”指的是489位上的苯丙氨酸残基被甘氨酸或丙氨酸所置换。对改善的热稳定性的改造当对改善的热稳定性进行改造时，亲一代和亲二代酶之一或两者可以是异淀粉酶或支链淀粉酶。为了获得异淀粉酶和支链淀粉酶的改善的热稳定性，我们可以使用如下进一步所述的序列同源性信息将目标主要集中在已经证实对于稳定性来说是重要的B区。热稳定性-序列同源性可以将几种不同的手段用于获得增加的热稳定性的目的，它们包括脯氨酸置换法、Gly至Ala置换法以及Asn和Gln置换法。下面提供了这些手段的进一步内容和实例。
脯氨酸置换法
建议将脯氨酸置换法即用脯氨酸残基取代一个或多个非脯氨酸氨基酸残基的方法作为用于获得以异淀粉酶和支链淀粉酶的序列对比为基础的热稳定性的一种手段。可能的脯氨酸置换的实例在下面提供。
异淀粉酶在淀粉皮假单胞菌异淀粉酶(SEQ ID NO 4)中脯氨酸置换的位置包括G81P、G99P、T18P、T199P、Q202P、T221、Q226P、A238P、T278P、R286P、A294P、G467P、G64P、V67P、E69P、A549P、G713P、T719P和D736P；而优选S356P、T376P、T278P、N348P和S454P。
在海洋红嗜热盐菌(R.marinus)异淀粉酶(SEQ ID NO 3)中脯氨酸置换位置包括G154P、N305P和N669P；而优选R588P和K480P。
支链淀粉酶在B.acidopullulyticus支链淀粉酶(SEQ ID NO 1)中优选的位置包括A210P、V215P、L249P、K383P、S509P、T811P和G823P。
在B.deramificans支链淀粉酶(SEQ ID NO 2)中优选的位置包括G306P、V311P、L345P、D605P、T907P、和A919P。
Gly至Ala的置换例如在淀粉皮假单胞菌异淀粉酶(SEQ ID NO 4)中G181AAsn(N)和Glin(Q)的置换新的残基选自所有20种可能的氨基酸残基，而优选从序列对比中观察到的同源位置上的残基，优选Leu、Ile、Phe、Ala、Thr、Ser和Tyr。特别关注如下SEQ ID NO 1:
环1:N379、N384环2:N426、Q432、N434、N437、N444、N446环3:N486、N490、Q502、N512、N515、N521环4:-
环5:Q596环6:N616、N621、Q628环7:N679、N681、Q684环8:N720、N722、N731、Q732SEQ ID NO 2:
环1:N475、N480环2:N522、N533、N590环3:N582、N608、N611、N617环4:-环5:Q691、Q698环6:N712、N717环7:N764、N775环8:N815、N817、N820SEQ ID NO 3:
环1:-环2:N227、N232环3:N286、N305、N314、N315、N327、N333环4:-环5:Q405环6:-环7:N482、N485、N489、N496、N500、Q513环8:N54、N548、N549、Q553、N555、N560、Q562SEQ ID NO 4:
环1:Q218、Q225环2:Q254、Q257、N258、N261、N266、N270、Q271、N272、N280环3:N322、N348、N358、Q359、N364、N370、N372、N375
环4:N408、N412、N421、N424、N428环5:N468、Q471、Q477环6:-环7:N547、N550、N551、N553、N567、Q572环8:Q615、N617、N618、N619、N622对于改善热稳定性对环2和3中的修饰是特别关注的。环2是所关注的，因为它与序列N-末端部分中的另一个结构域发生相互作用。环3是所关注的，因为它可能与位于结构域A和结构域B之间的钙结合位点有关。对改变的底物特异性的工程化当对改变的底物特异性进行工程化时，亲一代和亲二代酶之一或两者可以是异淀粉酶或支链淀粉酶，不过，本发明目的所特别关注的是获得支链淀粉酶对高分子量支链淀粉物质诸如糖原和支链淀粉具有改善的特异性；换句话说，例如通过环1-8、优选环1、2、4和5中的修饰将“异淀粉酶样”特异性转移给支链淀粉酶。
为了将异淀粉酶样活性转移给支链淀粉酶，特别关注的是从异淀粉酶至支链淀粉酶的环转移，例如通过将来自异淀粉酶的环5插入支链淀粉酶环5的位点或通过将来自异淀粉酶的环1插入具有表1中所示编号的支链淀粉酶环1的位点。序列知识中的活性、序列同源性和总β-链、α-螺旋以及环位置使用来自例如淀粉皮假单胞菌异淀粉酶(SEQ ID NO:4)(高异淀粉酶活性)的序列信息可以将活性即特异性活性或特异性转移给支链淀粉酶。使用来自例如B.acidopullulyticus支链淀粉酶(SEQ ID NO:1)的序列信息可以将活性即特异性活性或特异性转移给异淀粉酶。对环分析特别存在于来自异淀粉酶中的β-链(或所建议的支链淀粉酶中的β-链)末端的环序列开始处的特异性残基。
对所有的支链淀粉酶来说，如下所述建议的改变用于相应于所讨论的两种支链淀粉酶的那些同源位置提供的具有异淀粉酶样活性的支链淀粉酶通过在B.acidopullulytieus(SEQ ID NO:1)和B.deramificans(SEQ ID NO:2)支链淀粉酶的β-链后的环区中的置换可以提供它
为了将淀粉皮假单胞菌异淀粉酶对高分子量支链淀粉物质的高活性转移给海洋红嗜热盐菌(R.marinus)异淀粉酶或其它异淀粉酶或转移给支链淀粉酶，如上所述进行序列对比。如上所述通过评估序列同源性并考虑酶的“结构”，可以推定用于突变的策略。
从淀粉皮假单胞菌转移高活性优选在不以任何实质性的程度失去海洋红嗜热盐菌(R.marinus)异淀粉酶的热稳定性的条件下进行。尽管通常难以在不改变热稳定性的条件下改变底物活性，但是所关注的是本发明在海洋红嗜热盐菌(R.marinus)异淀粉酶中以及在更具有热稳定性的支链淀粉酶中获得了较高的活性而同时又基本上保持了较高的热稳定性。这一结果能够通过下列步骤实现将欲突变的异淀粉酶和支链淀粉酶与“关键对比序列”进行序列对比并选择欲突变的亲代酶以及使用获自这类氨基酸序列对比的信息欲突变的特异性氨基酸残基和区。
以这些理论为基础，下面的表提供了可以进行可能的突变以便获得对高分子量淀粉物质具有较高活性的海洋红嗜热盐菌(R.marinus)(SEQ ID NO 3)的实例。用于SEQ ID NO 3的较高活性的突变；环1:K183E、L184Q、H185D、P186T、E187S、V188I、E190A、P191Q；优选L184Q、P186T、E187S、P191Q；环2:H222Q、A223E、K224T、V225Q、H226N、R228A、H229N、L230D、231与232之间的插入片段VPN、E232S、R233D、G234A、L235N、R236Q、N242M、P243T、L244E、C245N、A248S、E250D、P251R；优选K224T、V225Q、R228A、P251R；环3:G289A、V293T、L294W、294与295之间插入的TSSDPTT、G295A、P296T、T297I、L298Y、F300W、I303L、R306A、A307T、K310E、A311L、D312T、P313S、N314G、缺失的P316、R317Q、F318Y、L319F、V320Y、Y322N、T325I、N327A、T328N、L329F、D330N、V331T、G332Y、P334T；优选P296T、R306A、P313S、缺失的P316、V331T、P334T；环4:A404S、A405V、A407G；环5:D397A、V398I、P400G、G401N、G402S、V405L、H407G、W410Q、Q411G；环6:R418L、Y419F、A422S、V423L、R425Q、F426A、W427Q；环7:F469M、E472K、L474V、V475Y；环8:L542Y、S543L、Q5446L、H447Q。定点诱变一旦分离了编码DNA序列的异淀粉酶或支链淀粉酶并鉴定了用于突变的所需位点，则可以使用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有位于所需突变位点侧翼的核苷酸序列。在一种特殊的方法中，在携带酶基因的载体中生成一种DNA的单链缺口即编码所述酶的序列。然后使具有所需突变的合成的核苷酸退火而产生单链DNA的同源部分。接着用DNA聚合酶Ⅰ(克列诺片段)填充剩余的缺口并使用T4连接酶连接构建体。这种方法的特殊实例在Morinaga等的(1984)《生物技术》(Biotechnology)2,p.646-639中描述。美国专利4,760,025中公开了通过对弹夹进行最低限度改变来引入编码多种突变的寡核苷酸的技术方案。然而，用Morinaga的方法甚至可以在任意的时间引入更大量的突变，这是因为可以引入不同长度的大量的寡核苷酸。
Nelson和Long(1989)在《分析生物化学》(AnalyticalBiochemistry)180,p.147-151中描述了将突变引入编码酶的DNA序列的另一种方法。它包括3步生成含有通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中引物之一而引入的所需突变的PCR片段。通过用限制性内切核酸酶裂解可以从PCR生成的片段中分离携带突变的DNA片段并将其重新插入表达质粒。随机诱变随机诱变在翻译成上述所示的氨基酸序列的基因的至少三部分中或在完整基因内作为定位诱变或区域特异性随机诱变合适地进行。
通过使用本领域中任意公知的方法可以方便地进行编码亲代酶的DNA序列的随机诱变。
与上述相关，本发明的进一步方面涉及一种用于生产亲代酶变体的方法，其中所述的变体表现出比亲代改善的热稳定性，该方法包括下列步骤(a)使编码亲代酶的DNA序列进行随机诱变；(b)在宿主细胞内表达步骤(a)中获得的突变DNA序列；和(c)筛选表达具有比亲代酶改变的特性(例如热稳定性)的酶变体的宿主细胞。
优选使用掺杂的引物进行上述本发明方法的步骤(a)。
例如，通过使用合适的物理或化学诱变剂、通过使用合适的寡核苷酸或通过使DNA序列进行PCR产生的诱变可以进行所述的随机诱变。此外，通过使用任意组合的这些诱变剂可以进行所述的随机诱变。例如，所述的诱变剂可以是诱导转换、颠换、倒位、混杂、缺失和/或插入的一种诱变剂。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟基胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟基胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这类诱变剂时，一般通过下列步骤来进行诱变在发生所述诱变的适宜条件下和有精选的诱变剂存在的情况下保温编码欲诱变的亲代酶的DNA序列并选择具有所需特性的突变DNA。
当使用寡核苷酸进行诱变时，可以在变化的位置上在合成寡核苷酸的过程中用三种非亲代核苷酸掺入或嵌入所述的寡核苷酸。可以进行掺入(doping)或嵌入(spiking)步骤以便避免出现不需要氨基酸的密码子。如果认为合适，通过任何公开的技术例如使用PCR、LCR或任意DNA聚合酶和连接酶可以将经掺入或嵌入的寡核苷酸引入编码葡糖淀粉酶的DNA中。
优选使用“恒定随机掺入”来进行掺入过程，其中预先确定了各位置上野生型和突变型的百分比。此外，掺入过程可以直接定向于优先选择引入某些核苷酸，且由此优先选择引入一种或多种特定氨基酸残基。可以进行掺入过程例如以便在各位置上引入90％的野生型和10％的突变型。在选择掺入方案中的另外的考虑以遗传以及蛋白质结构的约束因素为基础。通过使用特别是确保避免引入终止密码子的DOPE程序可以实施所述的掺入方案(Jensen,LJ,Andersen,KV,Svendsen,A，和Kretzschmar,T(1998)《核酸研究》(Nucleic Acids Research)26:697-702)。
当使用PCR产生的诱变时，在增加错掺核苷酸的条件下使编码亲代葡糖淀粉酶的经化学处理或非处理的基因进行PCR(Deshler 1992；Leung等《技术》(Technique)第1卷，1989,pp.11-15)。
通过例如将含有亲代酶的质粒转入突变株、使该突变株与所述的质粒一起生长并从所述的突变株中分离突变的质粒可以将大肠杆菌(Fowler等《分子基因遗传学》(Molec.Gen.Genet.)133,1974,pp.179-191)、啤酒糖酵母(S,cereviseae)或任意其它微生物生物体的突变株用于编码酶的DNA的随机诱变。随后可以将所述的突变质粒转入表达生物体。
所诱变的DNA序列可以方便地存在于由表达亲代酶的生物体制备的基因组或cDNA文库中。另一方面，所述的DNA序列可以存在于合适的载体诸如质粒或噬菌体上，照此可以通过与诱变剂一起或与诱变剂接触来培养它。所诱变的DNA还可以通过整合入所述细胞的基因组或通过存在于掩蔽在细胞中的载体上而存在于宿主细胞中。最终，所诱变的DNA可以是分离型。可以理解的是进行随机诱变的DNA序列优选是cDNA或基因组DNA序列。
在某些情况中，可以在进行表达步骤(b)或筛选步骤(c)之前便利地扩增突变的DNA序列。这类扩增可以按照本领域中公知的方法来进行，目前优选的方法是使用以亲代酶的DNA或氨基酸序列为基础制备的寡核苷酸引物的PCR产生的扩增法。
在用诱变剂培养或接触诱变剂后，通过在允许发生表达的条件下培养携带所述DNA序列的合适宿主细胞来表达突变的DNA。用于这一目的的宿主细胞可以是一种已经用任选存在于载体上的所述突变的DNA序列转化的宿主细胞或一种在诱变处理过程中携带编码亲代酶的DNA序列的宿主细胞。合适的宿主细胞的实例如下革兰氏阳性菌诸如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、Bacillus alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；和革兰氏阴性菌诸如大肠杆菌。
突变DNA序列可以进一步包括编码允许表达所述突变DNA序列的功能的DNA序列。定位随机诱变随机诱变可以有利地定位于上述亲代酶的一部分上。例如，当已经将某些酶的区域鉴定为对给定酶的特性来说特别重要时并且当预计所修饰的区可产生具有改善的特性的变体时，上述定位诱变是有利的。当已经阐明亲代酶的三级结构且该结构与所述酶的功能相关时，通常可以鉴定这类区。
通过使用如上所述PCR产生的诱变技术或本领域中公知的其它合适的技术方便地进行定位、或区域特异性、随机诱变。另一方面，例如，通过插入合适的载体可以分离编码所修饰的部分DNA序列的DNA序列，且随后通过使用如上所述的任意诱变方法可以使所述的部分进行诱变。与其它亲代酶的同源性在一个实施方案中，本发明还涉及具有与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中任意一种的同一性程度至少约为60％、优选至少约为70％、优选至少约为80％、优选至少约为90％、优选至少约为93％、更优选至少约为95％、甚至更优选至少约为97％且最优选至少约为99％的氨基酸序列并具有支链淀粉酶或异淀粉酶活性的分离的亲代多肽类的变体(下文称作“同源多肽类”)。在一个优选的实施方案中，这种同源亲代多肽类具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中任意一种的不同之处在于相差5个氨基酸、优选相差4个氨基酸、更优选相差3个氨基酸、甚至更优选相差2个氨基酸且最优选相差1个氨基酸。
将氨基酸序列的同源性确定为表明从第二种序列衍生第一种序列的两种序列之间的同一性程度。通过使用任意常用的算法、优选通过使用来自GCG软件包版本8(1994年8月)、应用缺口补偿错误值即缺口生成补偿为3.0且缺口延伸补偿为0.1的缺口程序(GeneticComputer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)可以确定“同源性”(同一性)。
所述的亲代多肽类优选含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4中任意一种的氨基酸序列或其等位变体或其具有支链淀粉酶或异淀粉酶活性的片段。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的片段是具有从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失的一种或多种氨基酸的多肽类。
等位变体指的是含有相同染色体位点的基因的任意两种或多种可选择形式。等位变异通过突变自然发生且可以在群体内产生多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽类。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
在另一个实施方案中，所分离的具有支链淀粉酶或异淀粉酶活性的亲代多肽类由核酸序列编码，所述的核酸序列在极低的严格条件、更优选在低严格条件、更优选在中等严格条件、更优选在中度-高度严格条件下、甚至更优选在高严格条件下且最优选在极高严格条件下与核酸探针杂交，所述的核酸探针在相同条件下与(ⅰ)SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的核酸序列；(ⅱ)(ⅰ)的亚序列；或(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatus,1989，《分子克隆》(Molecular Cloning)，“实验室手册”(ALaboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor,New York)。SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的亚序列可以是至少100个核苷酸或优选至少200个核苷酸。此外，该亚序列可以编码分别具有支链淀粉酶或异淀粉酶活性的多肽片段。亲代多肽类也可以是具有支链淀粉酶或异淀粉酶活性的等位变体或多肽类的片段。
可以将SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的核酸序列或其亚序列以及SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其片段用于设计核酸探针以便按照本领域中众所周知的方法从不同属或种的菌株中鉴定并克隆编码具有支链淀粉酶或异淀粉酶活性的多肽类的DNA。特别地，可以将这类探针用于在标准DNA印迹过程后与所关注属或种的基因组或cDNA杂交以便鉴定并分离其中相应的基因。这类探针可以比完整序列短很多，但是至少应有15个核苷酸、优选至少有25个核苷酸且更优选至少有35个核苷酸长。也可以使用较长的探针。既可以使用DNA探针又可以使用RNA探针。一般将所述的探针进行标记以便检测相应的基因(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。这类探针也包括在本发明内。
因此，可以对由这类其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与如上所述探针杂交并编码具有支链淀粉酶或异淀粉酶活性的多肽的DNA。来自这类其它生物体的基因组或其它DNA可以用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术来分离。可以将来自所述文库的DNA或所分离的DNA转到或固定在硝酸纤维或其它合适的载体物质上。为了鉴定与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述的载体物质用于DNA印迹。为了本发明的目的，杂交表明在极低至极高严格条件下核酸序列与符合SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示核酸序列、其互补链或其亚序列的核酸探针杂交。使用X光片来检测在这些条件下核酸探针与之杂交的分子。
对于至少有100个核苷酸长度的较长探针来说，优选至少在45℃(极低的严格条件)、更优选至少在50℃(低严格条件)、更优选至少在55℃(中等严格条件)、更优选至少在60℃(中-高度严格条件)、甚至更优选至少在65℃(高度严格条件)且最优选至少在70℃(极高的严格条件)下将载体物质最终用2×SSC、0.2％SDS洗涤3次，每次15分钟。
对于约有15个核苷酸至约70个核苷酸长度的较短探针来说，将严格条件定义为在标准DNA印迹过程后在5℃-10℃和低于使用Bolton和McCarthy计算法(1962，《美国国家科学院学报》(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)48:1390)计算的Tm以及在0.9MNaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1XDenhardt’s溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸一氢钠、0.1mMATP和0.2mg酵母RNA/ml中进行的预杂交、杂交和杂交后洗涤。
对于约有15个核苷酸至约70个核苷酸长度的较短探针来说，将载体物质在6×SCC+0.1％SDS中洗涤1次、15分钟，并使用6×SSC在5℃-10℃和低于计算的Tm条件下洗涤2次、每次15分钟。
本发明还涉及通过下列步骤生产的分离的核酸序列(a)在极低、低、中等、中-高度、高度或极高严格条件下使DNA与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的序列或其互补链或其亚序列杂交；和(b)分离所述的核酸序列。所述的亚序列优选是至少有100个核苷酸的序列诸如编码具有支链淀粉酶或异淀粉酶活性的多肽片段的序列。
所关注的亲代多肽类具有至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％且最优选至少100％的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的成熟多肽的支链淀粉酶或异淀粉酶活性。
通过下列非限制性实施例来进一步解释本发明。实施例实施例1供体生物体Bacillus acidopullulyticus含有编码pulB基因的DNA序列(SEQ ID NO:13)的支链淀粉酶(Kelly，A.P.,Diderichsen,B.,Jorgensen,S.和McConnett,D.J.(1994)“Bacillusacidopullulyticus支链淀粉酶B基因的分子遗传学分析”-《FEMS微生物学通讯》(FEMS Microbiology Letters)115,97-106)。其它菌株大肠杆菌菌株通过使用来自由提供者所述的BIO-RAD的GenePulserTM电穿孔仪进行电穿孔来制备并转化大肠杆菌SJ2细胞(Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjφholm,C.(1990)“编码α-乙酰乳酸脱羧酶，即一种来自短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的胞外酶的aldB的克隆”-《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)172,4315-4321)。
枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PL1801。该菌株是带有破裂的apr和npr基因的枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjφholm,C.(1990)“编码α-乙酰乳酸脱羧酶，即一种来自短芽孢杆菌的胞外酶的aldB的克隆”-《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)172,4315-4321)。
如Yasbin,R.E.,Wilson,G.A.和Young,F.E.在(1975)“枯草芽孢杆菌溶原菌株中的转化和转染用于感受态细胞中原噬菌体的选择性诱导的证据”-《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)121,296-304中所述来制备和转化感受态细胞。质粒pMOL944。该质粒是主要含有使质粒能够在枯草芽孢杆菌中繁殖的成分、卡那霉素抗性基因并带有强启动子和克隆自地衣形芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC14580的amyL基因的信号肽的pUB110衍生物。所述的信号肽含有SacⅡ位点，这使得能够方便地用所述信号肽克隆编码蛋白质浸液成熟部分的DNA。这可导致对直接定向于细胞外部的前蛋白质进行表达。通过常规的基因工程法来构建该质粒并简述如下。
pMOL944的构建用唯一的限制酶NciⅠ来消化pUB110质粒(McKenzie,T.等，1986,《质粒》(Plasmid)15:93-103)。用NciⅠ来消化从在质粒pDN1981(P.L.Jφrgensen等，1990《基因》(Gene)96,p37-41)上编码的amyL启动子扩增的PCR片段并将其插入NciⅠ消化的pUB110以便得到质粒pSJ2624。
所用的两种PCR引物具有如下序列#LWN5494 5′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′#LWN5495 5′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′引物#LWN5494将NotⅠ位点插入质粒。
然后用SacI和NotI消化质粒pSJ2624并用SacⅠ和NotⅠ消化在pDN1981上编码的amyL启动子上扩增的新PCR片段并将这种DNA片段插入SacⅠ-NotⅠ消化的pSJ2624以便得到质粒pSJ2670。
这一克隆过程取代了使用相同启动子进行的第一个amyL启动子的克隆，但是方向相反。用于PCR扩增的两种引物具有如下序列#LWN5938 5｀-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′#LWN5939 5｀-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′用限制酶PstⅠ和BclⅠ消化质粒pSJ2670并用PstⅠ和BclⅠ消化由编码碱性淀粉酶SP722(专利号WO9526397-A1)的克隆DNA序列扩增的PCR片段并将其插入以便得到质粒pMOL944。用于PCR扩增的两种引物具有如下序列#LWN7864 5｀-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′#LWN7901 5｀-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′引物#LWN7901将SacⅡ位点插入质粒。
枯草芽孢杆菌中支链淀粉酶pulB的亚克隆和表达。
使用由这两种寡核苷酸组成的PCR引物组对编码本发明DNA序列的pulB进行PCR扩增pulB．上．saCⅡ5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GAT TCT ACC TCG ACA GAA GTC-3′pulB．下．NotⅠ5′-GTT GAG AAA A GC GGC CGC TTC TTT AAC ACA TGC TAC GG-3′限制位点SacⅡ和NotⅡ如下描述。
pulB上SacⅡ引物恰好位于pulB基因的信号序列之后且在pMOL944载体中克隆后产生与amyL信号序列的信号融合物。
pulB下引物恰好位于pulB基因的mRNA终止子之后。
基因组DNA的制备使菌株Bacillus pullulyticus(ID noxxxx)在液体TY培养基中增殖。16小时后在30℃和300rpm下培养，收集细胞并通过Pitcher等所述的方法(Pitcher,D.G.,Saunders,N.A.,Owen,R.J.(1989)“用硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA”-《微生物学应用通讯》(Lett.Appl.Microbiol.)8,151-156)来分离基因组DNA。
将如上所述分离自B.pullulyticus的染色体DNA用作使用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)按照制造商的说明进行的PCR反应的模板。在含有200μM的各dNTP、2.5个单位的Amplitaq聚合酶(Perkin Elmer,Cetus,USA)和100pmol的各引物的PCR缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.3、50mMKCl、1.5mMMgCl2、0.01％(w/v)明胶)中引发PCR反应。
使用DNA热循环仪(Landgraf,Germany)进行PCR反应。一种情况是在94℃下保温1分钟；随后使用在96℃下变性10秒、在60℃下退火30秒和在72℃下延伸150秒组成的循环方案进行30个循环的PCR。通过在0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve,FMC)中的电泳来分析5μl等份的扩增产物。2.5kb大小的DNA片段外观表明对基因片段进行了适当的扩增。PCR片段的亚克隆使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)、按照制造商的说明纯化如上所述生成的45μl等份的PCR产物。用50μl的10mMTris-HCl,pH8.5来洗脱纯化的DNA。
用SacⅡ和NotⅠ消化5μg的pMOL944和25μl纯化的PCR片段、使其在0.8％的低胶凝温度琼脂糖(SeaPlaque GTG,FMC)凝胶中电泳、从凝胶中切下相关的片段并使用QIAquick Gel提取试剂盒(Qiagen,USA)按照制造商的说明进行纯化。然后将分离的PCR DNA片段与SacⅡ-NotⅠ消化和纯化的pMOL944连接。在16℃下，使用0.5μg的各DNA片段、1U的T4DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(BoehringerMannheim,Germany)使连接过程过夜进行。将该连接混合物用于转化感受态枯草芽孢杆菌PL2306。将转化的细胞铺平板固定在LBPG-10μg/ml的卡那霉素-0.1％AZCL-普鲁兰-琼脂平板上。在37℃下培养18小时后，观察到阳性表达克隆的支链淀粉酶的细胞为被蓝色环包围的集落。在上述所用的琼脂平板上将一种这样的阳性克隆重新划线几次，将该克隆称作PULxxx。在37℃下使该克隆PULxxx在TY-10μg/ml的卡那霉素中生长过夜，并在次日使用Qiaprep旋式质粒小量制备试剂盒#27106、按照制造商对枯草芽孢杆菌质粒制备的建议将1ml细胞用于从该细胞中分离质粒。支链淀粉酶的表达在30℃下，在2个500ml带挡板的摇瓶中使PULxxx以300rpm在含有10μg/ml卡那霉素的25×200mlBPX培养基中生长。
pulB序列(SEQ ID NO:14)AAAAAATGCTTAATAGAAGGAGTGTAATCTGTGTCCCTAATACGTTCTAGGTATAATCATTTTGTCATTCTTTTTACTGTCGCCATAATGTTTCTAACAGTTTGTTTCCCCGCTTATAAAGCTTTAGCAGATTCTACCTCGACAGAAGTCATTGTGCATTATCATCGTTTTGATTCTAACTATGCAAATTGGGATCTATGGATGTGGCCATATCAACCAGTTAATGGTAATGGAGCAGCATACGAGTTTTCTGGAAAGGATGATTTTGGCGTTAAAGCAGATGTTCAAGTGCCTGGGGATGATACACAGGTAGGTCTGATTGTCCGTACAAATGATTGGAGCCAAAAAAATACATCAGACGATCTCCATATTGATCTGACAAAGGGGCATGAAATATGGATTGTTCAGGGGGATCCCAATATTTATTACAATCTGAGTGATGCGCAGGCTGCAGCGACTCCAAAGGTTTCGAATGCGTATTTGGATAATGAAAAAACAGTATTGGCAAAGCTAACTAATCCAATGACATTATCAGATGGATCAAGCGGCTTTACGGTTACAGATAAAACAACAGGGGAACAAATTCCAGTTACCGCTGCAACAAATGCGAACTCAGCCTCCTCGTCTGAGCAGACAGACTTGGTTCAATTGACGTTAGCCAGTGCACCGGATGTTTCCCATACAATACAAGTAGGAGCAGCCGGTTATGAAGCAGTCAATCTCATACCACGAAATGTATTAAATTTGCCTCGTTATTATTACAGCGGAAATGATTTAGGTAACGTTTATTCAAATAAGGCAACGGCCTTCCGTGTATGGGCTCCAACTGCTTCGGATGTCCAATTACTTTTATACAATAGTGAAACAGGACCTGTAACCAAACAGCTTGAAATGCAAAAGAGTGATAACGGTACATGGAAACTGAAGGTCCCTGGTAATCTGAAAAATTGGTATTATCTCTATCAGGTAACGGTGAATGGGAAGACACAAACAGCCGTTGACCCTTATGTGCGTGCTATTTCAGTCAATGCAACACGTGGTATGATAGTCGATTTAGAAGATACGAATCCTCCTGGATGGAAAGAAGATCATCAACAGACACCTGCGAACCCAGTGGATGAAGTAATCTACGAAGTGCATGTGCGTGATTTTTCGATTGATGCTAATTCAGGCATGAAAAATAAAGGGAAATATCTTGCCTTTACAGAACATGGCACAAAAGGCCCTGATAACGTGAAAACGGGTATTGATAGTTTGAAGGAATTAGGAATCAATGCTGTTCAATTACAGCCGATTGAAGAATTTAACAGCATTGATGAAACCCAACCAAATATGTATAACTGGGGCTATGACCCAAGAAACTACAACGTCCCTGAAGGAGCGTATGCAACTACACCAGAAGGAACGGCTCGCATTACCCAGTTAAAGCAACTGATTCAAAGCATTCATAAAGATCGGATTGCTATCAATATGGATGTGGTCTATAACCATACCTTTAACGTAGGAGTGTCTGATTTTGATAAGATTGTTCCGCAATACTATTATCGGACAGACAGCGCAGGTAATTATACGAACGGCTCAGGTGTAGGTAATGAAATTGCGACCGAGCGTCCGATGGTCCAAAAGTTCGTTCTGGATTCTGTTAAATATTGGGTAAAGGAATACCATATCGACGGCTTC
CGTTTCGATCTTATGGCTCTTTTAGGAAAAGACACCATGGCCAAAATATCAAAAGAGCTTCATGCTATTAATCCTGGCATTGTCCTGTATGGAGAACCATGGACTGGCGGTACCTCTGGATTATCAAGCGACCAACTCGTTACGAAAGGTCAGCAAAAGGGCTTGGGAATTGGCGTATTCAACGATAATATTCGGAACGGACTCGATGGTAACGTTTTTGATAAATCGGCACAAGGATTTGCAACAGGAGATCCAAACCAAGTTAATGTCATTAAAAATAGAGTTATGGGAAGTATTTCAGATTTCACTTCGGCACCTAGCGAAACCATTAACTATGTAACAAGCCATGATAATATGACATTGTGGGATAAAATTAGCGCAAGTAATCCGAACGATACACAAGCAGATCGAATTAAGATGGATGAATTGGCTCAAGCTGTGGTATTTACTTCACAAGGGGTACCATTTATGCAAGGTGGAGAAGAAATGCTGCGGACAAAAGGCGGTAATGATAATAGTTACAATGCCGGGGATAGCGTGAATCAGTTCGATTGGTCAAGAAAAGCACAATTTGAAAATGTATTCGACTACTATTCTTGGTTGATTCATCTACGTGATAATCACCCAGCATTCCGTATGACGACAGCGGATCAAATCAAACAAAATCTCACTTTCTTGGATAGCCCAACGAACACTGTAGCATTTGAATTAAAAAATCATGCCAATCATGATAAATGGAAAAACATTATAGTTATGTATAATCCAAATAAAACTGCACAAACTCTCACTCTACCAAGTGGAAATTGGACAATTGTAGGATTAGGCAATCAAGTAGGTGAGAAATCACTAGGCCATGTAAATGGCACGGTTGAGGTGCCAGCTCTTAGTACGATCATTCTTCATCAGGGTACATCTGAAGATGTCATTGATCAAAATTAATATTGATTAAGAAATGATTTGTAAAACATTTAAGTCCATTTACACGGGATACTGTGTAAATGGATTTTAGTTTTATCCGTAGCATGTGTTAAAGAAGTAAATAGTAAATGGCAATTT所表示的用于两种扩增引物的靶物培养基TY(如Ausubel所述，F.M.等(编辑)“分子生物学最新方案”John Wiley和Sons,1995)。
LB琼脂(如Ausubel所述，F.M.等(编辑)“分子生物学最新方案”John Wiley和Sons,1995)。
LBPG是用0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾(pH7.0)补充的LB琼脂。
将AZCL-普鲁兰加入到LBPG琼脂中至来自Megazyme,Australia的AZCL-普鲁兰为0.5％。
BPX培养基在EP 0 506780中描述(WO 91/09129)。实施例2Bacillus acidopullulyticus支链淀粉酶(PromozymeTM)的纯化通过对Bacillus acidopullulyticus发酵来纯化Bacillusacidopullulyticus支链淀粉酶(如EP63,909中所述)，使该支链淀粉酶分泌入培养基。
将助滤剂加入到培养肉汤中，将该肉汤通过滤布过滤。将该溶液进一步通过赛氏厚度滤板过滤，从而产生澄明溶液。通过在10kDa截断的聚醚砜膜上超滤来浓缩滤液，随后用蒸馏水渗滤(dialfiltration)以降低传导性。将浓缩酶的pH调节至pH4.5。所浓缩酶的传导性为0.7mS/cm。
将浓缩的支链淀粉酶加样至用20mM CH3COOH/NaOH,pH4.5平衡的S-Sepharose FF柱，并用线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱该酶。支链淀粉酶的活性洗脱为单峰。将收集的具有支链淀粉酶活性的级分转入Sephadex G25柱上的20mM KH2PO4/NaOH,pH7.0中。通过加样至用20mMKH2PO4/NaOH,pH7.0平衡的Q-Sepharose FF柱来进一步纯化所述的酶。在洗涤柱后，用线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱该支链淀粉酶。收集具有支链淀粉酶活性的级分并在Sephadex G25柱上将缓冲液交换成20mMCH3COOH/NaOH,pH4.5。然后将支链淀粉酶加样至用20mMCH3COOH/NaOH,pH4.5平衡的SOURCE 30S柱。在洗涤柱后，用增加的线性NaCl梯度(0→0.2M)洗脱支链淀粉酶活性。收集具有支链淀粉酶活性的级分并用截断10kDa的再生的纤维素膜在超滤室上浓缩。将浓缩的酶加样至用20mMCH3COOH/NaOH、200mMNaCl,pH4.5平衡的Superdex200的体积排阻柱。通过SDS-PAGE分析洗脱自Superdex200柱的级分并收集纯的支链淀粉酶级分。
所述的支链淀粉酶在SDS-PAGE上迁移为具有Mr=100kDa的带。
基本上以同样方式可以纯化其它的支链淀粉酶和异淀粉酶。
Sepharose、Sephadex、SOURCE和Superdex是由AmershamPharmacia Biotech拥有的商品名。实施例3支链淀粉酶和异淀粉酶的热稳定性通过DSC(差示扫描量热法)可以检测支链淀粉酶和异淀粉酶的热稳定性。将热变性温度Td作为以恒定程序化加热速率加热酶溶液后获得的差示热分析图上变性峰的峰值(Cp对T)。实验可以将例如来自Har Scientific(Utah,USA)DSC Ⅱ装置的合适的DSC装置用于本实验。将50mM缓冲溶液用作pH10(50mM甘氨酸缓冲液)、pH7(50mM HEPES缓冲液+10mM EDTA)或pH4(50mM柠檬酸盐缓冲液)下酶的溶剂(约2mg/ml)。如上所述可以纯化该酶。将750μl酶溶液转入标准1ml密封哈斯特洛伊耐蚀镍基合金安瓿(HartScientific)。将安瓿进行量热法实验并冷却至5℃15分钟。在DSC扫描前进行热平衡。在5℃-95℃的范围内以约90K/小时的扫描速率进行DSC扫描。使用约+/-2℃的精确度测定变性温度。将结果表示为对作为pH函数的变性峰的峰值。实施例4活性脱支活性试验下列结果表明特异性活性(活性/mg纯的酶)高度依赖于酶的种类。异淀粉酶对高分子量支链淀粉物质诸如糖原和支链淀粉酶具有极高的活性，而支链淀粉酶对这些底物的活性极低。活性单位反映出在10分钟保温期过程中形成的还原末端的数量。使用支链淀粉酶观察到了相反的情况，即对高分子量支链淀粉物质诸如糖原和支链淀粉具有低活性，而对例如普鲁兰具有高活性。
当酶脱支与液化过程中α-淀粉酶的作用一起发生时对支链淀粉和糖原具有高活性是特别优选的。另一方面，当在糖化步骤中发生酶脱支时即在液化过程后当高分子量成分被断裂成较小的寡糖时，对小的寡核苷酸诸如普鲁兰具有高活性是优选的。如果可以将支链淀粉酶改变成对高分子量化合物诸如支链淀粉具有高活性(特异性)，那么当在液化过程中加入支链淀粉酶时，这种改变是极为优选的。
所用的底物家兔肝脏的糖原和普鲁兰。预试验已经证实需要高浓度的底物以便当开始进行线性试验时底物不是限制因素。在本发明的上下文中，“高”底物浓度为10％w/v。Somogyi-Nelson试验测定了通过酶降解所述底物而形成的还原末端的量。由于正常的试验时间达到了3小时，所以还原末端的形成受到相当的限制，即使在酶浓度较高的情况下(10％w/v)也是如此。这意味着该试验测定了在极高的背景值上还原末端的相对较小的差异，其中的背景值远高于酶处理过程中可测定的吸收度差异。由于这一原因，如下用NaBH4氧化糖原和普鲁兰中的还原末端以便降低底物背景的水平将1000mg的糖原溶于40ml已经加入0.2％NaOH的水中。在搅拌过程中谨慎加入800mgNaBH4。在25℃下，将该溶液搅拌48小时，此后通过加入Amberlite IR-118H即一种除去硼离子并终止反应的阳离子交换剂来终止反应。过滤该溶液以除去基质并蒸发至得到10ml。将该溶液对去离子水充分透析以便除去残余的硼离子。发现该方法将背景值减少至少到十分之一。
按照Somogyi-Nelson法、使用50mM乙酸钠、在pH值为4.5、5.0和5.5且温度为50℃(异淀粉酶)或60℃(支链淀粉酶)下进行该试验，反应时间为10分钟。将葡萄糖用作标准品，由含有0-200mg葡萄糖/升的溶液构建标准曲线。表3来自家兔肝脏的糖原温度 pH PUN/mg来自B.acidopullulyticus60℃ 4.5 50的支链淀粉酶(SEQ ID NO 1)60℃ 5.0 4960℃ 5.5 51来自B.deramificans 60℃ 4.5 37的支链淀粉酶(SEQ ID NO 2)60℃5.03160℃5.530来自假单胞菌属的异淀粉酶50℃4.52829(SEQ ID NO 4)50℃5.0285850℃5.52709普鲁兰来自B.acidopullulyticus 60℃4.5402的支链淀粉酶(SEQ ID NO1)60℃5.041460℃5.5393来自B.deramificans的60℃4.5288支链淀粉酶(SEQ ID NO 2)60℃5.027660℃5.5255来自假单胞菌属的异淀粉酶50℃4.514(SEQ ID NO 4)50℃5.01450℃5.56SEQ ID NO 12:(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度2181个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)
(ⅵ)原始来源(B)菌株海洋红嗜热盐菌DSM 4252(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..2181(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:ATG TCA CAT AGC GCG CAA CCG GTT ACG TCG GTA CAG GCC GTC TGG CCC 48Met Ser His Ser Ala Gln Pro Val Thr Ser Val Gln Ala Val Trp Pro1 5 10 15GGC CGG CCT TAT CCG CTG GGT GCC ACC TGG GAC GGG CTG GGC GTC AAC 96Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Trp Asp Gly Leu Gly Val Asn20 25 30TTT GCC CTC TAC AGC CAG CAC GCC GAG GCG GTC GAA CTG GTG CTG TTC 144Phe Ala Leu Tyr Ser Gln His Ala Glu Ala Val Glu Leu Val Leu Phe35 40 45GAC CAC CCG GAC GAT CCC GCG CCT TCG CGC ACG ATC GAA GTG ACC GAA 192Asp His Pro Asp Asp Pro Ala Pro Ser Arg Thr Ile Glu Val Thr Glu50 55 60CGG ACA GGC CCG ATC TGG CAT GTG TAC CTG CCC GGC CTG CGT CCC GGC 240Arg Thr Gly Pro Ile Trp His Va1 Tyr Leu Pro Gly Leu Arg Pro Gly65 70 75 80CAG CTC TAC GGC TAT CGC GTC TAC GGA CCC TAC CGG CCG GAG GAA GGC 288Gln Leu Tyr Gly Tyr Arg Val Tyr Gly Pro Tyr Arg Pro Glu Glu Gly85 90 95CAC CGC TTC AAT CCG AAC AAG GTG CTG CTC GAC CCC TAC GCG AAG GCC 336His Arg Phe Asn Pro Asn Lys Val Leu Leu Asp Pro Tyr Ala Lys Ala100 105 110ATC GGC CGG CCC CTT CGC TGG CAC GAC AGC CTC TTC GGT TAC AAA ATC 384Ile Gly Arg Pro Leu Arg Trp His Asp Ser Leu Phe Gly Tyr Lys Ile115 120 125GGC GAT CCG GCC GGG GAT CTG TCG TTC TCC GAA GAA GAC AGC GCT CCG 432Gly Asp Pro Ala Gly Asp Leu Ser Phe Ser Glu Glu Asp Ser Ala Pro
130 135 140TAC GCG CCG CTG GGA GCC GTC GTG GAG GGC TGT TTC GAG TGG GGC GAC480Tyr Ala Pro Leu Gly Ala Val Val Glu Gly Cys Phe Glu Trp Gly Asp145 150 155 160GAC CGC CCG CCG CGC ATT CCC TGG GAA GAC ACG ATC ATC TAC GAA ACG528Asp Arg Pro Pro Arg Ile Pro Trp Glu Asp Thr Ile Ile Tyr Glu Thr165 170 175CAC GTC AAG GGC ATC ACG AAG CTG CAT CCG GAA GTG CCG GAG CCG CTG576His Val Lys Gly Ile Thr Lys Leu His Pro Glu Val Pro Glu Pro Leu180 185 190CGG GGG ACG TAT CTG GGG CTG ACC TGC GAG CCG GTG CTG GAG CAC CTG624Arg Gly Thr Tyr Leu Gly Leu Thr Cys Glu Pro Val Leu Glu His Leu195 200 205AAG CAG CTG GGC GTC ACC ACG ATC CAG CTC CTT CCG GTG CAC GCA AAA672Lys Gln Leu Gly Val Thr Thr Ile Gln Leu Leu Pro Val His Ala Lys210 215 220GTG CAC GAT CGG CAC CTG GTC GAG CGC GGC CTG CGC AAC TAC TGG GGC720Val His Asp Arg His Leu Val Glu Arg Gly Leu Arg Asn Tyr Trp Gly225 230 235 240TAC AAT CCG CTC TGC TAC TTT GCG CCG GAG CCC GAG TAC GCC ACG AAC768Tyr Asn Pro Leu Cys Tyr Phe Ala Pro Glu Pro Glu Tyr Ala Thr Asn245 250 255GGG CCG ATC TCG GCC GTG CGC GAG TTC AAG ATG ATG GTG CGG GCG CTG816Gly Pro Ile Ser Ala Val Arg Glu Phe Lys Met Met Val Arg Ala Leu260 265 270CAT GCT GCC GGC TTC GAG GTG ATC GTC GAC GTG GTC TAC AAC CAC ACG864His Ala Ala Gly Phe Glu Val Ile Val Asp Val Val Tyr Asn His Thr275 280 285CGC GAA GGC GGC GTG CTG GGC CCC ACG CTG TCG TTC CGG GGC ATC GAC912Gly Glu Gly Gly Val Leu Gly Pro Thr Leu Ser Phe Arg Gly Ile Asp290 295 300AAC CGC GCC TAC TAC AAG GCC GAT CCG AAC AAC CCG CGC TTT CTG GTC960Asn Arg Ala Tyr Tyr Lys Ala Asp Pro Asn Asn Pro Arg Phe Leu Va1305 310 315 320GAT TAC ACG GGC ACC GGC AAC ACG CTG GAC GTG GGC AAC CCC TAC GTC1008Asp Tyr Thr Gly Thr Gly Asn Thr Leu Asp Val Gly Asn Pro Tyr Val325 330 335ATC CAG CTC ATC ATG GAC AGC CTG CGC TAC TGG GTC ACT GAA ATG CAC1056Ile Gln Leu Ile Met Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His340 345 350GTC GAC GGC TTT CGG TTC GAC CTG GCC GCC GCG CTG GCC CGC GAG CTG1104Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ala Ala Leu Ala Arg Glu Leu355 360 365TAC GAC GTG GAC ATG CTC TCG ACC TTT TTT CAG GTC ATT CAG CAG GAC 1152Tyr Asp Val Asp Met Leu Ser Thr Phe Phe Gln Val Ile Gln Gln Asp370 375 380CCG GTG CTC AGC CAG GTC AAG CTC ATC GCC GAA CCC TGG GAC GTC GGG 1200Pro Val Leu Ser Gln Val Lye Leu Ile Ala Glu Pro Trp Asp Val Gly385 390 395 400CCG GGG GGG TAT CAG GTG GGA CAT TTT CCC TGG CAG TGG ACC GAG TGG 1248Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly His Phe Pro Trp Gln Trp Thr Glu Trp405 410 415AAC GGC CGC TAT CGT GAC GCC GTG CGC CGC TTC TGG CGG GGC GAT CGG 1296Asn Gly Arg Tyr Arg Asp Ala Val Arg Arg Phe Trp Arg Gly Asp Arg420 425 430GGC CTC AAC GGT GAG TTT GCC ACG CGC TTT GCC GGC TCC AGC GAT CTG 1344Gly Leu Asn Gly Glu Phe Ala Thr Arg Phe Ala Gly Ser Ser Asp Leu435 440 445TAC GAA CGT AGC GGT GGT CGT CCG TTC GCT TCG ATC AAC TTC GTC ACG 1392Tyr Glu Arg Ser Gly Arg Arg Pro Phe Ala Ser Ile Asn Phe Val Thr450 455 460GCG CAC GAC GGC TTC ACG CTG GAA GAC CTG GTC AGC TAC ACG AAA AAG 1440Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Ser Tyr Thr Lys Lys465 470 475 480CAC AAC GAA GCG AAT CTG GAA GGC AAC CGG GAC GGC ATG GAC GAA AAC 1488His Asn Glu Ala Asn Leu Glu Gly Asn Arg Asp Gly Met Asp Glu Asn485 490 495TAC AGC ACG AAC TGC GGG GTG GAG GGA CCC ACG CAG GAT CCG TCC GTG 1536Tyr Ser Thr Asn Cys Gly Val Glu Gly Pro Thr Gln Asp Pro Ser Val500 505 510CTG GCC TGC CGG GAA GCG CTC AAG CGC AGC CTG ATC AGC ACG CTC TTT 1584Leu Ala Cys Arg Glu Ala Leu Lys Arg Ser Leu Ile Ser Thr Leu Phe515 520 525CTC TCG CAG GGC GTG CCC ATG CTG CTG GGCGGC GAC GAG CTG TCG CGC 1632Leu Ser Gln Gly Val Pro Met Leu Leu Gly Gly Asp Glu Leu Ser Arg530 535 540ACG CAG CAC GGC AAC AAC AAC GCC TAT TGC CAG GAC AAC GAG ATC AGC 1680Thr Gln His Gly Asn Asn Asn Ala Tyr Cys Gln Asp Asn Glu Ile Ser545 550 555 560TGG TAC AAC TGG CAG CTC GAC ACG CGC AAG CAG CAG TTT CTG GAG TTC 1728Trp Tyr Asn Trp Gln Leu Asp Thr Arg Lys Gln Gln Phe Leu Glu Phe565 570 575GTG CGC CAG ACG ATC TGG TTT CGC AAG CAG CAT CGG AGC TTC CGG CGC 1776Val Arg Gln Thr Ile Trp Phe Arg Lys Gln His Arg Ser Phe Arg Arg580 585 590CGC CAT TTT CTG ACC GGA TTG CCC AAC GGC GGA AGG CCC CGA CGC AGT 1824Arg His Phe Leu Thr Gly Leu Pro Asn Gly Gly Arg Pro Arg Arg Ser595 600 605CTG GTG GCA CCT GAG GGT CGG CCC ATG CGC CAC GAG GAC TGG ACC AAC 1872Leu Val Ala Pro Glu Gly Arg Pro Met Arg His Glu Asp Trp Thr Asn610 615 620CCG GAG CTG ACG GCC TTC GGA CTG CTG CTG CAC GGC GAC GCC ATT CAG 1920Pro Glu Leu Thr Ala Phe Gly Leu Leu Leu His Gly Asp Ala Ile Gln625 630 635 640GGG ACC GAC GAG CAC GGA CGA CCG TTT CGC GAC GAC ACG TTT CTG ATT 1968Gly Thr Asp Glu His Gly Arg Pro Phe Arg Asp Asp Thr Phe Leu Ile645 650 655CTG TTC AAC AAC GGC AGC GAA GCC GTG CCG GTC GTG GTG CCG GAG GTA 2016Leu Phe Asn Asn Gly Ser Glu Ala Val Pro Val Val Val Pro Glu Val660 665 670TGC TCC TGT GGC AAG CCG CAC CAC TGG GAG GTG GTC CCG GTG TTT CAA 2064Cys Ser Cys Gly Lys Pro His His Trp Glu Val Val Pro Val Phe Gln675 680 685CGC AAT GTG GAG CCC CCC ACG TGC GCG CCC GGC GAG ACG CTG TCG CTC 2112Arg Asn Val Glu Pro Pro Thr Cys Ala Pro Gly Glu Thr Leu Ser Leu690 695 700CCG CCC GGC GTG CTG ACG GTG CTG GTG GCC GTA CCG CCG TTC TCG GAT 2160Pro Pro Gly Val Leu Thr Val Leu Val Ala Val Pro Pro Phe Ser Asp705 710 715 720GGA AAC ACG GAG CCG GCC TGA 2181Gly Asn Thr Glu Pro Ala *725
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>淀粉脱支酶<130>淀粉脱支酶<140><141><160>14<170>Patentln版本2.1<210>1<211>862<212>PRT<213>Bacillus acidopullulyticus<220><221>肽<222>(1)..(862)<223>支链淀粉酶<400>1Val Ser Leu Ile Arg Ser Arg Tyr Asn His Phe Val Ile Leu Phe Thr1 5 10 15Val Ala Ile Met Phe Leu Thr Val Cys Phe Pro Ala Tyr Lys Ala Leu20 25 30Ala Asp Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp35 40 45Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val50 55 60Asn Gly Ash Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Lys Asp Asp Phe Gly65 70 75 80Val Lys Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asp Thr Gln Val Gly Leu85 90 95Ile Val Arg Thr Asn Asp Trp Ser Gln Hys Asn Thr Ser Asp Asp Leu100 105 110His Ile Asp Leu Thr Lys Gly His Glu Ile Trp Ile Val Gln Gly Asp
115 120 125Pro Asn Ile Tyr Tyr Asn Leu Ser Asp Ala Gln Ala Ala Ala Thr Pro130 135 140Lys Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys145 150 155 160Leu Thr Asn Pro Met Thr Leu Ser Asp Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val165 170 175Thr Asp Lys Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Thr Ala Ala Thr Asn180 185 190Ala Ash Ser Ala Ser Ser Ser Glu Gln Thr Asp Leu Val Gln Leu Thr195 200 205Leu Ala Ser Ala Pro Asp Val Ser His Thr Ile Gln Val Gly Ala Ala210 215 220Gly Tyr Glu Ala Val Asn Leu Ile Pro Arg Asn Val Leu Asn Leu Pro225 230 235 240Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr Ser Asn Lys245 250 255Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp Val Gln Leu260 265 270Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln Leu Glu Met275 280 285Gln Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro Gly Asn Leu290 295 300Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Gln305 310 315 320Thr Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn Ala Thr Arg325 330 335Gly Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly Trp Lys Glu340 345 350Asp His Gln Gln Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val Ile Tyr Glu355 360 365Val His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly Met Lys Asn
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660agtgcaccgg atgtttccca tacaatacaa gtaggagcag ccggttatga agcagtcaat 720ctcataccac gaaatgtatt aaatttgcct cgttattatt acagcggaaa tgatttaggt 780aacgtttatt caaataaggc aacggccttc cgtgtatggg ctccaactgc ttcggatgtc 840caattacttt tatacaatag tgaaacagga cctgtaacca aacagcttga aatgcaaaag 900agtgataacg gtacatggaa actgaaggtc cctggtaatc tgaaaaattggtattatctc 960tatcaggtaa cggtgaatgg gaagacacaa acagccgttg acccttatgt gcgtgctatt 1020tcagtcaatg caacacgtgg tatgatagtc gatttagaag atacgaatcc tcctggatgg 1080aaagaagatc atcaacagac acctgcgaac ccagtggatg aagtaatcta cgaagtgcat 1140gtgcgtgatt tttcgattga tgctaattca ggcatgaaaa ataaagggaa atatcttgcc 1200tttacagaac atggcacaaa aggccctgat aacgtgaaaa cgggtattga tagtttgaag 1260gaattaggaa tcaatgctgt tcaattacag ccgattgaag aatttaacag cattgatgaa 1320acccaaccaa atatgtataa ctggggctat gacccaagaa actacaacgt ccctgaagga 1380gcgtatgcaa ctacaccaga aggaacggct cgcattaccc agttaaagca actgattcaa 1440agcattcata aagatcggat tgctatcaat atggatgtgg tctataacca tacctttaac 1500gtaggagtgt ctgattttga taagattgtt ccgcaatact attatcggac agacagcgca 1560ggtaattata cgaacggctc aggtgtaggt aatgaaattg cgaccgagcg tccgatggtc 1620caaaagttcg ttctggattc tgttaaatat tgggtaaagg aataccatat cgacggcttc 1680cgtttcgatc ttatggctct tttaggaaaa gacaccatgg ccaaaatatc aaaagagctt 1740catgctatta atcctggcat tgtcctgtat ggagaaccat ggactggcgg tacctctgga 1800ttatcaagcg accaactcgt tacgaaaggt cagcaaaagg gcttgggaat tggcgtattc 1860aacgataata ttcggaacgg actcgatggt aacgtttttg ataaatcggc acaaggattt 1920gcaacaggag atccaaacca agttaatgtc attaaaaata gagttatggg aagtatttca 1980gatttcactt cggcacctag cgaaaccatt aactatgtaa caagccatga taatatgaca 2040ttgtgggata aaattagcgc aagtaatccg aacgatacac aagcagatcg aattaagatg 2100gatgaattgg ctcaagctgt ggtatttact tcacaagggg taccatttat gcaaggtgga 2160gaagaaatgc tgcggacaaa aggcggtaat gataatagtt acaatgccgg ggatagcgtg 2220aatcagttcg attggtcaag aaaagcacaa tttgaaaatg tattcgacta ctattcttgg 2280ttgattcatc tacgtgataa tcacccagca ttccgtatga cgacagcgga tcaaatcaaa 2340caaaatctca ctttcttgga tagcccaacg aacactgtag catttgaatt aaaaaatcat 2400gccaatcatg ataaatggaa aaacattata gttatgtata atccaaataa aactgcacaa 2460actctcactc taccaagtgg aaattggaca attgtaggat taggcaatca agtaggtgag 2520aaatcactag gccatgtaaa tggcacggtt gaggtgccag ctcttagtac gatcattctt 2580catcagggta catctgaaga tgtcattgat caaaattaat attgattaag aaatgatttg 2640taaaacattt aagtccattt acacgggata ctgtgtaaat ggattttagt tttatccgta 2700gcatgtgtta aagaagtaaa tagtaaatgg caattt 273权利要求
1．一种亲代淀粉脱支酶的基因工程变体，该酶变体在pH4-6的范围内比所述的亲代酶具有改善的热稳定性。
2．权利要求1的酶变体，其中所述的酶是支链淀粉酶。
3．权利要求1的酶变体，其中所述的酶是异淀粉酶。
4．权利要求1-3中任意一项的酶变体，其中所述的酶变体具有由差示扫描量热法(DSC)、使用本文所述的方法定义的改善的热稳定性。
5．权利要求1-3中任意一项的酶变体，其中所述的酶变体具有由在本文所述的“液化的T1/2检测试验”中使用pH5.0和95℃的温度条件下增加的半衰期(T1/2)来定义的改善的热稳定性，所述的半衰期的增加至少约为5％、优选至少约为10％、更优选至少约为15％、更优选至少约为25％、最优选至少约为50％，诸如至少100％。
6．权利要求1-3中任意一项的酶变体，其中所述的酶变体具有由在本文所述的液化后残余活性的检测试验”中使用pH5.0和95℃的温度条件下增加的残余酶活性来定义的改善的热稳定性，所述的残余酶活性的增加至少约为5％、优选至少约为10％、更优选至少约为15％、更优选至少约为25％、最优选至少约为50％。
7．权利要求1-3中任意一项的酶变体，其中所述的酶变体具有由在本文所述的“糖化的T1/2检测试验”中使用pH4.5和70℃的温度条件下增加的半衰期(T1/2)所定义的改善的热稳定性，所述的半衰期的增加至少约为5％、优选至少约为10％、更优选至少约为15％、更优选至少约为25％、最优选至少约为50％，诸如至少100％。
8．权利要求1-3中任意一项所述的酶变体，其中所述的酶变体具有由在本文所述的“糖化后残余活性的检测试验”中使用pH4.5和63℃的温度条件下增加的残余酶活性所定义的改善的热稳定性，所述的残余酶活性的增加至少约为5％、优选至少约为10％、更优选至少约为15％、更优选至少约为25％、最优选至少约为50％。
9．权利要求8的酶变体，它在70℃的温度下检测时具有增加的残余酶活性。
10．一种亲代淀粉脱支酶的基因工程变体，该酶变体对支链淀粉和/或糖原具有的活性比所述的亲代酶增加。
11．权利要求10的酶变体，其中所述的亲代酶是支链淀粉酶。
12．权利要求11的酶变体，其中所述的支链淀粉酶由下列属的细菌产生芽孢杆菌属、例如Bacillus acidopullulyticus或Bacillusderamificans；或热球菌属；或克雷白氏杆菌属、例如肺炎克雷白氏杆菌或产气克雷白氏杆菌。
13．权利要求10的酶变体，其中所述的亲代酶是异淀粉酶，例如由下列属的细菌产生的异淀粉酶假单胞菌属、例如淀粉皮假单胞菌；或来自硫化叶菌属、例如嗜酸热硫化叶菌或硫磺矿硫化叶菌；或红嗜热盐菌属、例如海洋红嗜热盐菌。
14．权利要求10-13中任意一项的酶变体，其中所述的酶变体进一步具有如权利要求1-9中任意一项所定义的改善的热稳定性。
15．一种用于生产具有增加的热稳定性的淀粉脱支酶变体的方法，该方法包括下列步骤-鉴定亲一代淀粉脱支酶中与热稳定性相关的一种或多种氨基酸残基和/或氨基酸区；-通过亲一代和亲二代淀粉脱支酶的氨基酸序列对比来鉴定亲二代淀粉脱支酶中的一种或多种同源氨基酸残基和/或氨基酸区；和-使亲二代淀粉脱支酶中的一种或多种同源氨基酸残基和/或氨基酸区发生突变以便产生具有增加的热稳定性的酶变体。
16．权利要求15的方法，其中通过使位于环中、优选位于环2或3中的同源氨基酸残基和/或氨基酸区发生突变来获得增加的热稳定性。
17．权利要求15的方法，其中突变在至少一种相当于下列位置的氨基酸残基上进行SEQ ID NO:1的369-397、419-458、484-525、553-568、582-608、613-616、661-670和708-739位；SEQ ID NO:2的465-493、515-554、580-621、649-664、680-711、714-717、757-765和804-834位；SEQ ID NO:3的176-195、218-257、283-334、359-381、395-413、416-419、461-470和537-568位；和SEQ ID NO:4的210-230、250-292、319-376、401-437、461-479、482-485、533-580和605-636位。
18．权利要求15的方法，其中通过用脯氨酸残基取代至少一种非脯氨酸残基来获得增加的热稳定性。
19．权利要求15的方法，其中通过将至少一个Gly置换成Ala来获得增加的热稳定性。
20．权利要求15的方法，其中通过用另一种氨基酸残基置换至少一个Asn或Gln残基来获得增加的热稳定性，所述的另一种氨基酸残基优选一种选自Leu、Ile、Phe、Ala、Thr、Ser和Tyr组成的组的氨基酸残基。
21．权利要求18-20中任意一项的方法，其中所述的置换在环3、5和/或6中进行。
22．一种用于生产具有可变的底物特异性的淀粉脱支酶变体的方法，该方法包括下列步骤-鉴定亲一代淀粉脱支酶中与对所需底物具有的特异性相关的至少一种氨基酸环中的一种或多种氨基酸残基；-通过亲一代和亲二代淀粉脱支酶的氨基酸序列对比来鉴定亲二代淀粉脱支酶中至少一种相应的环中的一种或多种同源氨基酸残基；和-使亲二代淀粉脱支酶中至少一种环中的一种或多种同源氨基酸残基发生突变以便产生具有改变的底物特异性的酶变体。
23．权利要求22的方法，其中突变在至少一种相当于下列位置的氨基酸残基上进行SEQ ID NO:1的369-397、419-458、484-525、553-568、582-608、613-616、661-670和708-739位；SEQ ID NO:2的465-493、515-554、580-621、649-664、680-711、714-717、757-765和804-834位；SEQ ID NO:3的176-195、218-257、283-334、359-381、395-413、416-419、461-470和537-568位；和SEQ ID NO:4的210-230、250-292、319-376、401-437、461-479、482-485、533-580和605-636位。
24．权利要求22的方法，其中突变在环1、2、4、5和/或7中进行。
25．权利要求22-24中任意一项的方法，其中所述的突变是环转移。
26．权利要求22-25中任意一项的方法，其中所述的亲一代淀粉脱支酶是异淀粉酶而亲二代淀粉脱支酶是支链淀粉酶。
27．权利要求22-26中任意一项的方法，其中所述的改变的底物特异性是对支链淀粉和/或糖原的增加的活性。
28．权利要求15-27中任意一项的方法，其中通过将亲二代淀粉脱支酶的氨基酸序列与关键对比序列中的最为同源的序列进行序列对比来在亲二代淀粉脱支酶中鉴定适合于突变的同源氨基酸残基和/或氨基酸区；其中所述的关键对比序列包括至少两种相关淀粉脱支酶的氨基酸序列的对比序列。
29．权利要求28的方法，其中的关键对比序列包括至少两种选自SEQ ID NO1、2、3和4组成的组的氨基酸序列的对比序列。
30．权利要求15-29中任意一项的方法，其中在与本文表1中鉴定的相应的环同源的亲二代淀粉脱支酶的至少一种环中进行亲二代淀粉脱支酶的突变。
31．一种用于将淀粉转化成一种或多种糖的方法，该方法包括使用至少一种如权利要求1-30中任意一项所定义的酶变体使淀粉脱支的步骤。
32．权利要求31的方法，其中淀粉的转化包括使用至少一种如权利要求1-6中任意一项所定义的酶变体和至少一种α-淀粉酶在至少约95℃温度下进行液化的步骤。
33．权利要求32的方法，其中所述的酶变体是支链淀粉酶或异淀粉酶。
34．权利要求31-33中任意一项的方法，其中淀粉的转化包括使用至少一种如权利要求1-4或7-9中任意一项所定义的酶变体和至少一种葡糖淀粉酶在至少约63℃、优选至少约70℃温度下进行糖化的步骤。
35．权利要求34的方法，其中所述的酶变体是支链淀粉酶。
全文摘要
本发明涉及一种亲代淀粉脱支酶即支链淀粉酶或异淀粉酶的基因工程变体,所述的酶变体在pH为4－6的范围内具有比亲代酶改善的热稳定性和/或比亲代酶增加的对支链淀粉和/或糖原的活性;本发明涉及生产具有改善的热稳定性和/或改变的底物特异性的这类淀粉脱支酶变体的方法并涉及一种使用至少一种这类酶变体将淀粉转化成一种或多种糖的方法。
文档编号C12N9/44GK1309701SQ9980808
公开日2001年8月22日 申请日期1999年7月2日 优先权日1998年7月2日
发明者H·比斯加德－法兰参, A·斯万德森 申请人:诺沃奇梅兹有限公司