专利名称：具有镇咳祛痰作用的伊贝总生物碱的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属天然药物类，具体地说是一种具有镇咳祛痰作用的伊贝总生物碱的制备工艺。
伊犁贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)属于百合科贝母属(Fritillaria)植物，其干燥鳞茎是一味传统止咳化痰中药[1]。近年来的化学研究证明伊犁贝母药材中含有的成分为异甾体生物碱，如西贝素(imperialine)和西贝素苷(imperialine-3β-D-glucoside)等，且认为西贝素是伊梨贝母所含的主要生物碱[2-4]。文献从伊犁贝母中提取甾体生物碱使用的提取溶剂是70-95％乙醇直接提取，中性提取物酸化(一般用1-3％盐酸调pH值3-4)后，用石油醚、二氯甲烷脱脂，再碱化(氨水或氢氧化钠)以氯仿萃取得总生物碱提取物，或提取物回收有机溶剂后，先上大孔树脂柱，水洗去糖后，再用不同浓度的甲醇洗脱生物碱，而后再酸化、脱脂，碱化后用氯仿萃取得总生物碱提取物[2-6]，或先将贝母药材碱化再用苯等有机溶剂提取其它贝母中甾体生物碱[7]。这些提取工作均是为了进行单个化合物的研究，至今未见有关伊犁贝母止咳祛痰活性成分制备工艺的文献报道和专利报道。
本发明的目的是研究伊犁贝母药材传统止咳祛痰作用的活性组份的最佳提取工艺。
本发明的目的可以通过以下措施来达到取伊犁贝母药材，粉碎成0.5-1.0cm粗粉，采用药材重量16-18倍的30-50％乙醇渗漉，流速5-10ml/min。渗漉液浓缩至浓缩液与药材的体积比为1∶1-3，用酸调pH值至2-5，离心去除沉淀，酸性溶液用碱调pH值9-15后，用氯仿或二氯甲烷萃取，回收有机溶剂，真空干燥提取物得伊贝总碱。
本发明的优点本发明工艺所用提取溶剂种类和浓度、提取方法、药材粒径大小等是经过正交设计研究而成，保证了所得到的伊贝母总生物碱得率最高，且主要活性成分除文献认为的西贝素外还有西贝素苷，且西贝素苷的量比西贝素高，两者的含量之和大于50％。其研究步骤和详细数据如下1．药材选用百合科贝母属植物伊犁贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鳞茎，药材的性状特征、粉末特征、理化性质应符合中国药典2000版一部“伊贝母”项下的内容。2．优化的提取工艺技术条件2.1提取溶剂根据本课题组长期研究贝母的经验，溶剂种类对提取效率影响较大，为了选择提取工艺优化的因素和水平，我们设计了提取溶剂的初选实验。取粒径约0.5cm的药材粉末约50g，精密称定，分别以混合溶剂(乙醚∶氯仿∶95％乙醇=25∶8∶2.5)、50％丙酮、二氯甲烷、30％乙醇及50％乙醇冷浸过夜，其中，混合溶剂和二氯甲烷提取液直接浓缩，其它溶剂提取液浓缩成50ml，经酸化、碱化处理，再以氯仿萃取3次，合并3次提取液，用非水滴定法测定提取物中总生物碱含量，结果如表1所示。
表1不同溶剂对总生物碱提取效率的影响
以上结果表明，二氯甲烷提取效果最差，混合溶剂次之。50％丙酮、30％乙醇及50％乙醇提取效果较好。虽然几种溶剂中30％乙醇提取效果最好，50％丙酮提取效果略好于50％乙醇，但考虑到工业化生产的成本，拟选择乙醇作为提取溶剂，进行提取工艺优化。2.2优化的冷浸提取工艺为了确定药材粒径、乙醇浓度、用量以及提取次数对提取效率的影响，我们以正交设计实验，以总生物碱的含量为指标，对提取工艺进行了优化。实验设计如表2和表3所示。将药材粉碎成三个粒度等级，按正交试验表中要求，进行试验。用冷浸法提取，提取液浓缩后，经酸化、碱化处理，氯仿萃取，按非水滴定法测定提取物中总生物碱含量，结果见表3所示。
表2因素水平表
不考虑交互作用，选取L9(34)正交表实验。
表3提取工艺正交表
K1201.75273.14195.62167.28K2193.54222.92196.67194.24K3194.3 93.53 197.30228.07K167.25 91.05 65.21 55.76K264.51 74.31 65.56 64.75K364.77 31.18 65.77 76.03R 2.74 59.87 0.56 20.27A因素三水平中，K1＞K3＞K2，所以因素A取A1时，提取物总生物碱含量高；B因素三水平中，K1＞K2＞K3，所以因素B取B1时，提取物总生物碱含量高；C因素三水平中，K3＞K2＞K1，所以因素C取C3时，提取物总生物碱含量高；D因素三水平中，K3＞K2＞K1，所以因素D取D3时，提取物总生物碱含量高；所以，不考虑主次因素的最佳工艺为A1,B1,C3,D3，即药材粒径为0.5cm大小，50％乙醇，10倍量溶剂，提取3次。然而，从提取总生物碱量极差可知，因素从主到次的顺序依次为B＞D＞A＞C，因素B(溶剂浓度)为主要因素，而因素C(溶剂用量)和因素A(药材粒径)影响不大，为次要因素。由于溶剂用量是次要因素，6倍量溶剂总生物碱平均得量为65.21mg,8倍量溶剂总生物碱平均得量为65.56mg,10倍量溶剂总生物碱平均得量为65.77mg，所以实际的最优条件可为A1,B1,C1,D3或A1,B1,C2,D3。由于这两个条件在所做的9次实验中没有出现过，为此我们又设计了两个实验加以验证，见表4。
表4正交实验最优条件验证
根据以上结果，伊贝母总生物碱提取的最佳工艺为A1,B1,C1,D3，即药材粒径为0.5cm大小，50％乙醇，6倍量溶剂，提取3次。2.3提取方式对提取效率的影响分别取粉碎成0.5cm的药材粉末约20g，精密称定，以6倍量59％乙醇按下列方法提取冷浸6倍量溶剂冷浸过夜，提取3次。
渗漉18倍量溶剂渗漉。
热回流6倍量溶剂热回流，提取3次。
分别合并各种提取液，按非水滴定法分别测定提取物中总生物碱量，结果如表5。
表5提取方式对提取效率的影响
以上结果可见，热提的提取效率最高，渗漉次之，冷浸较差，但三者差异不显著。从工业化生产角度考虑，热提取成本高，冷浸法操作较渗漉法复杂，故工业化生产首推渗漉法。
综上研究可见，工业化提取伊贝母生物碱的工艺如下药材粉碎至0.5cm，以18倍量的50％乙醇渗漉。2.4伊贝母总碱的分离、纯化、浓缩与干燥工艺2.4.1分离与纯化工艺本课题组研究表明，伊犁贝母鳞茎酸化后脱脂除去的脂溶性杂质很少，因而分离与纯化工艺研究如下渗滤液薄膜蒸发或旋转蒸发至体积与药材重量比为1∶1-3。浓缩后的渗滤液以盐酸调节pH值至2-5，离心，去除沉淀，酸水溶液以碱调节pH值至8-13，氯仿萃取4次，每次1/2体积(药材重量的1/2)，合并萃取液，水洗至中性，无水Na2SO4脱水。2.4.2浓缩与干燥工艺经无水Na2SO4脱水的萃取液静置，过滤，减压回收溶剂，真空干燥，即得。3．伊贝母总生物碱的止咳祛痰活性3.1氨水引咳法镇咳试验3.1.1试验材料3.1.1.1受试药物伊贝总碱，总碱含量72.6％，批号9908263.1.1.2阳性对照药磷酸可待因3.1.1.3阴性对照药0.5％CMC-Na溶液3.1.1.4仪器与试剂水浴锅，大烧杯，注射器，玻璃钟罩，小儿听诊器，浓氨水3.1.1.5受试动物 昆明种小白鼠3.1.2方法与结果3.1.2.1操作步骤3.1.2.1.1给药剂量按表6剂量给药表6镇咳试验小鼠给药剂量
3.1.2.1.2药物配制溶剂按照给药剂量及给药体积0.2ml/10g小鼠，用0.5％CMC-Na作为溶剂配制相应浓度药液。
配制方法受试药置于研钵中，加入适量溶剂研磨成混悬液，再稀释成所需浓度药液。阳性药直接用一定量溶剂配成所需浓度药液。3.1.2.1.3试验步骤取小鼠176只随机分成11组，每组16只，雌雄各半，依次编号称重，连续灌胃给药5天，于末次给药后1h、2h、3h、4h，分别对各组小鼠采用序贯法测定EDT50(半数小鼠喷雾致咳时间)，并计算R值，R＞130％判为有镇咳作用，R＞150％则有明显镇咳作用。3.1.2.2结果表7伊贝总碱对小鼠氨水引咳的镇咳作用(n=16)
3.2酚红排泌法祛痰试验3.2.1试验材料3.2.1.1受试药物同前3.2.1.2阳性对照药愈创木酚3.2.1.3阴性对照药0.5％CMC-Na溶液3.2.1.4药品与仪器酚红，NaHCO3,NaOH，生理盐水，752分光光度计，手术剪，眼科镊，小试管3.2.1.5受试动物昆明种小白鼠3.2.2方法与结果3.2.2.1方法3.2.2.1.1绘制标准曲线0.25％酚红配制用2.5ml 1mol/lNaOH溶解2.5g酚红，再加生理盐水至100ml，摇匀即得。用吸管准确吸取0.25％酚红20ml，加0.5％NaHCO3至50ml得1mg/ml酚红溶液，之后依次稀释至10、8、6、4、3、2、1.5、1、0.5、0.25μg/ml系列溶液。分别于λ=558nm处测定吸光度。
经拟合得回归方程为A=0.1331C-1.9778,r=0.99973.2.2.1.2药液配制阳性药愈创木酚的浓度为0.75mg/ml，其余药液配制方法同前。3.2.2.1.3试验步骤取小鼠176只，随机分为11组，每组16只，雌雄各半，各组小鼠依次称重编号，连续灌胃给药5天，于末次给药后半小时给小鼠ip5％酚红溶液0.25ml，半小时后将小鼠脱颈椎处死。剪开颈部皮肤，分离气管，将甲状软骨下至气管分叉处气管段剪下。再纵行剪开浸泡于2ml5％HCO3溶液中，充分振摇后于752分光光度计558nm处测定吸光度，记录A值。并代入回归方程求取对应C值。3.2.2.2结果表8伊贝总碱对小鼠酚红排泌量的影响(x±SD,n=14)
注与阴性对照组相比较，*p＜0.05
表9伊贝母总碱的质量参数
参考文献1．中华人民共和国药典委员会。中华人民共和国药典(一部，2000版)，2．徐东铭，黄恩喜，王淑琴，闻晓光，吴秀英。伊贝母生物碱的研究。植物学报1990；32(10):789-7933．徐东铭，在原重倍，庄子升，杨秀伟，黄恩喜，李超生。伊贝碱甙A的分离和鉴定。药学学报1990；25(10):795-7974．黄恩喜，李超生，徐东铭。伊贝母生物碱成分的研究。中国中药杂志1990；15(9):39-405．徐雅娟，徐东铭，黄恩喜，吴秀英，金向群，崔东滨，刘诗月。伊贝母的分离和鉴定。药学学报1992；27(2):121-1246．徐雅娟，徐东铭，崔东滨，高继山，黄恩喜，刘诗月，于德泉。伊贝母中伊贝碱甙C的分离和结构鉴定。药学学报1994；29(3)；200-2037．扈成浩，尚尔宁，林文翰，蔡孟深。宁夏贝母化学成分的研究。药学学报1993；28(7):516-52权利要求
1.一种具有镇咳祛痰作用的伊贝总生物碱的制备工艺，其特征在于取伊犁贝母药材，粉碎成0.5-1.0cm粗粉，采用药材重量16-18倍的30-50％乙醇渗漉，流速5-10ml/min。渗漉液浓缩至浓缩液与药材的体积比为1∶1-3，用酸调pH值至2-5，离心去除沉淀，酸性溶液用碱调pH值9-15后，用氯仿或二氯甲烷萃取，回收有机溶剂，真空干燥提取物得伊贝总碱。
2.根据权利要求1所述的具有镇咳祛痰作用的伊贝总生物碱的制备工艺，其特征在于伊犁贝母总生物碱提取的最佳工艺为，药材粒径为0.5cm大小，药材重量6倍的50％乙醇提取3次。
全文摘要
本发明是研究伊犁贝母药材传统止咳祛痰作用的活性组份的最佳提取工艺,该工艺其特征在于:取伊犁贝母药材,粉碎成0.5－1.0cm粗粉,采用药材重量16－18倍的30－50%乙醇渗漉,流速5－10ml/min。渗漉液浓缩至浓缩液与药材的体积比为1∶1－3,用酸调pH值至2－5,离心去除沉淀,酸性溶液用碱调pH值9－15后,用氯仿或二氯甲烷萃取,回收有机溶剂,真空干燥提取物得伊贝总碱。
文档编号A61P11/10GK1320603SQ0110815
公开日2001年11月7日 申请日期2001年3月22日 优先权日2001年3月22日
发明者李萍, 李松林, 曾令杰, 季晖, 孙飘扬, 周云曙 申请人:中国药科大学, 江苏恒瑞医药股份有限公司