核酸佐剂的制作方法

专利名称：核酸佐剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，广泛涉及核酸免疫技术。更具体地说，本发明涉及编码佐剂的多核苷酸，和应用这些多核苷酸的免疫策略。
背景技术：
本领域已描述为了抗表达产物的免疫目的，将DNA和mRNA注射入哺乳动物组织中的技术。该技术，本文命名为“核酸免疫”，已显示了诱导体液和细胞介导的免疫应答。例如，已显示用编码包膜糖蛋白，gp160的DNA构建体免疫小鼠的血清在免疫测定中与重组gp160反应，并且，注射小鼠的淋巴细胞显示了增殖以应答重组gp120。Wang等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA904156-4160。类似地，用人生长激素(hGH)基因免疫的小鼠证实了基于抗体的免疫应答。Tang等(1992)Nature356152-154。肌肉注射由哺乳动物启动子驱动的编码流感核蛋白的DNA已显示了诱导CD8+CTL应答，其可保护小鼠免受后续病毒致死性攻击。Ulmer等(1993)Science2591745-1749。注射位点的免疫组织化学研究揭示成髓细胞吸收DNA，并且病毒蛋白的胞质生产可以显示至少6个月。
发明概述本发明的主要目的是提供一种含有第一和第二核酸序列的多核苷酸佐剂组合物，其中第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区，第二核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区。每个截短的亚基编码区具有5’缺失，并且编码不具氨基末端细菌信号肽的亚基肽。
第一和第二核酸序列可在相同或不同的核酸构建体中存在。截短的亚基编码区可获自或来源于相同的细菌ADP-核糖基化外毒素，并且在一些优选实施方式中，细菌ADP-核糖基化外毒素是霍乱毒素(CT)或大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(LT)。此外，至少一个截短的亚基编码区可被基因修饰以除去由其编码的亚基肽的毒性，例如，其中截短的A亚基编码区已被基因修饰以破坏或失活亚基肽表达产物中的ADP-核糖基转移酶的活性。
本发明的另一个主要目的是提供一种含有第一和第二核酸序列的多核苷酸佐剂组合物，其中第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的修饰的A亚基编码区，第二核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的B亚基编码区。所述修饰的A亚基编码区和B亚基编码区分别编码成熟亚基肽，并且修饰的A亚基编码区已被基因修饰以缺失由其编码的C-末端KDEL或亚基肽的RDEL基序(motif)。
如上所述，第一和第二核酸序列可在相同或不同的核酸构建体中存在。截短的亚基编码区可获自或来源于相同的细菌ADP-核糖基化外毒素，并且在一些优选实施方式中，细菌ADP-核糖基化外毒素是霍乱毒素(CT)或大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(LT)。此外，至少一个截短的亚基编码区可被基因修饰以除去由其编码的亚基肽的毒性，例如，其中截短的A亚基编码区已被基因修饰以破坏或失活亚基肽表达产物中的ADP-核糖基转移酶的活性。
在本发明的某些方面，可以通过粒子形式提供上述组合物，例如，其中组合物是适合以粒子递送设备递送的粒子。在这方面，本组合物可包被至相同或不同的核心载体粒子上，从而适于使用粒子介导的转染技术来递送。优选核心载体粒子的平均直径约为0.1-10μm，并且可以包含金属，例如金。因此，本发明的进一步的目的是提供负载有(例如，含有)如本文所述的粒子组合物的粒子递送设备。
本发明的另一个主要目的是提供组合物在制造药剂的应用，所述组合物含有第一和第二核酸序列，其中每个序列包含ADP-核糖基化外毒素亚基的编码区，所述药剂用于提高脊椎动物个体抗所述个体中目的抗原的免疫应答。通过给所述个体施用目的抗原和组合物，因此，表达由第一和第二核酸序列编码的毒素亚基，其量足以诱导对抗原的免疫应答。第一核酸序列含有获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区，第二核酸序列含有获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区，但条件是每个截短的亚基编码区具有5’缺失，并且编码不具氨基末端细菌信号肽的亚基肽。
本发明相关的主要目是提供用于提高抗个体中目的抗原的免疫应答的方法。该方法通常需要(a)给所述个体施用目的抗原；(b)提供含有第一和第二核酸序列的佐剂组合物，其中第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区，第二核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区；和(c)给所述个体施用佐剂组合物，藉此通过引入到所述个体，表达第一和第二核酸序列，以提供足够量的亚基肽来诱导提高的抗目的抗原的免疫应答。截短亚基编码区的原因在于每个亚基编码区具有5’缺失，并且编码不具氨基末端细菌信号肽的亚基肽。
本发明还有一个主要目的是提供组合物在制造药剂的应用，所述组合物含有第一和第二核酸序列，其中每个序列包含细菌ADP-核糖基化外毒素亚基的编码区，所述药剂用于提高脊椎动物个体抗所述个体中目的抗原的免疫应答。通过给所述个体施用目的抗原和组合物，因此，表达由第一和第二核酸序列编码的毒素亚基，其量足以诱导提高的对抗原的免疫应答。第一核酸序列含有获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的修饰的A亚基编码区，第二核酸序列含有获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的B亚基编码区，但条件是修饰的A亚基和B亚基编码区分别编码成熟亚基肽，并且进一步条件是修饰的A亚基编码区已被基因修饰以缺失由其编码的亚基肽的C-末端KDEL或RDEL基序。
本发明相关的主要目是提供用于提高抗个体中目的抗原的免疫应答的方法。该方法通常需要(a)给所述个体施用目的抗原；(b)提供含有第一和第二核酸序列的佐剂组合物，其中第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的修饰的A亚基，第二核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的B亚基编码区；和(c)给所述个体施用佐剂组合物，藉此通过引入到所述个体，表达第一和第二核酸序列，以提供足够量的亚基肽来诱导提高的对抗原的免疫应答。修饰亚基编码区的原因在于它们分别编码成熟亚基肽，但是已基因修饰A亚基编码区以缺失由其编码的亚基肽的C-末端KDEL或RDEL基序。
在本发明应用和方法中，施用佐剂组合物需要用本发明多核苷酸佐剂组合物转染个体细胞。含有本发明核酸分子的表达盒子和/或载体可以用于转染细胞，而且在允许个体中亚基肽表达的条件下进行转染。该方法可以进一步需要给个体施用至少一个第二组合物的步骤。
在免疫期间可以在体内或离体进行转染过程(例如，在进行次级免疫步骤前获得随后被引入个体的转染细胞)。当应用体内转染时，可以通过肌肉或真皮内注射质粒DNA的方法给个体施用核酸分子，优选地，利用粒子介导的递送技术给个体施用。可以以任何适合的疫苗组合物形式，例如肽亚基组合物的形式，核酸疫苗组合物的形式，或整体或分裂的病毒流感疫苗组合物的形式提供疫苗组合物(含有目的抗原)。
在一些方法中，给个体的相同位点施用目的抗原和佐剂组合物。例如，可以同时施用佐剂组合物和目的抗原(例如，在单一疫苗组合物中提供)。在一些优选实施方式中，以粒子形式施用佐剂和，可选地目的抗原，例如其中佐剂组合物包被在核心载体粒子上，而且用粒子介导的递送技术递送给个体。
在这些方法中，优选本发明多核苷酸佐剂组合物的施用引起增加的抗共施用目的抗原的细胞免疫应答。该提高的免疫应答通常可以以增加的产生干扰素的CD4+和/或CD8+T淋巴细胞效价，增加的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，和抗目的抗原的T辅助性1-类似免疫应答(Th1)(以增加的通常与细胞免疫(例如，IgG2a)有关的亚类的抗原特异性抗体的效价，常常伴随通常与体液免疫(例如，IgG1)有关的亚类的抗体效价的降低为特征)为特征，而不是T辅助性2-类似免疫应答(Th2)。T辅助性2-类似免疫应答(Th2)就像当用细菌ADP-核糖基化外毒素佐剂，如CT或LT免疫个体时通常产生的那样。
本发明优点包括，但不限于本发明佐剂组合物提供显著佐剂效果和因此提高免疫个体中共施用抗原免疫原性的能力，还包括有助于抗共施用抗原的Th1样免疫应答的能力，共施用抗原在疫苗产品中是有益的。
鉴于本文的公开，本领域普通的技术人员将容易想到本发明的这些和其它目的，方面，实施方式和优点。
附图简述

图1是质粒pPJV2002的限制图谱和功能图谱，该质粒含有霍乱毒素(CT)亚基A(CTA)肽截短的编码序列，其中该质粒进一步含有人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子和相关内含子A序列，及允许从哺乳动物细胞分泌截短的CTA表达产物的人组织血纤蛋白溶酶原激活体信号肽的编码序列。该图进一步包含pPJV2002质粒的完整核酸序列(SEQ IDNO1)。
图2是质粒pPJV2003的限制图谱和功能图谱，该质粒含有霍乱毒素(CT)亚基B(CTB)肽截短的编码序列，其中该质粒进一步含有hCMV立即早期启动子和相关内含子A序列，及允许从哺乳动物细胞分泌截短的CTB表达产物的人组织血纤蛋白溶酶原激活体信号肽的编码序列。该图进一步包含pPJV2003质粒的完整核酸序列(SEQ ID NO2)。
图3是质粒pPJV2006的限制图谱和功能图谱，该质粒含有CTA肽截短的编码序列，其中进一步修饰截短的CTA编码序列以缺失其编码的亚基肽中C-末端KDEL基序。质粒进一步含有hCMV立即早期启动子和相关内含子A序列，及允许从哺乳动物细胞分泌截短的CTA表达产物的人组织血纤蛋白溶酶原激活体信号肽的编码序列。该图进一步包含pPJV2006质粒的完整核酸序列(SEQ ID NO3)。
图4是质粒pPJV2004的限制图谱和功能图谱，该质粒含有大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(LT)亚基A(LTA)肽截短的编码序列，其中该质粒进一步含有hCMV立即早期启动子和相关内含子A序列，及允许从哺乳动物细胞分泌截短的LTA表达产物的人组织血纤蛋白溶酶原激活体信号肽的编码序列。该图进一步包含pPJV2004质粒的完整核酸序列(SEQ ID NO4)。
图5是质粒pPJV2005的限制图谱和功能图谱，该质粒含有LT亚基B(LTB)肽截短的编码序列，其中该质粒进一步含有hCMV立即早期启动子和相关内含子A序列，及允许从哺乳动物细胞分泌截短的LTB表达产物的人组织血纤蛋白溶酶原激活体信号肽的编码序列。该图进一步包含pPJV2005质粒的完整核酸序列(SEQ ID NO5)。
图6是质粒pPJV2007的限制图谱和功能图谱，该质粒含有LTA肽截短的编码序列，其中截短的LTA编码区被进一步修饰以缺失其编码的亚基肽中C-末端RDEL基序。该质粒进一步含有hCMV立即早期启动子和相关内含子A序列，及允许从哺乳动物细胞分泌截短的LTA表达产物的人组织血纤蛋白溶酶原激活体信号肽的编码序列。该图进一步包含pPJV2007质粒的完整核酸序列(SEQ ID NO6)。
图7描述了实施例5中进行的ELISA结果。矩形图表示接受下述制剂的动物中出现的抗gp120抗体的对数倒数效价，在图中从左到右，含有空pWRG7504载体(“EmpVec”)的制剂#1；含有EmpVec(pWRG7054)和pCIA-EnvT质粒(“gp120”)的制剂#2；含有与pPJV2002和pPJV2003佐剂载体(“CTA/B”)联合的EmpVec(pWRG7054)的制剂#3；含有与pPJV2002和pPJV2003佐剂载体(“CTA/B”)联合的pCIA-EnvT质粒(“gp120”)的制剂#4；含有与pPJV2006和pPJV2003佐剂载体(“CTA-KDEL/B”)联合的pCIA-EnvT质粒(“gp120”)制剂#5；或无疫苗和/或佐剂组合物(首次用于试验的)。
图8描述了实施例5中进行的原位ELISA结果。矩形图表示接受下述制剂的动物脾细胞中gp120特异性IFN-γ产生的相对水平，图中从左到右，含有空pWRG7504载体(“EmpVec”)的制剂#1；含有EmpVec(pWRG7054)和pCIA-EnvT质粒(“gp120”)的制剂#2；含有与pPJV2002和pPJV2003佐剂载体(“CTA/B”)联合的EmpVec(pWRG7054)的制剂#3；含有与pPJV2002和pPJV2003佐剂载体(“CTA/B”)联合的pCIA-EnvT质粒(“gp120”)的制剂#4；或含有与pPJV2006和pPJV2003佐剂载体(“CTA-KDEL/B”)联合的pCIA-EnvT质粒(“gp120”)的制剂#5。
图9描述了实施例5中进行的ELISPOT测定法的结果。矩形图表示接受下述制剂的动物中产生IFN-γ的脾细胞的相对水平，图中从左到右，含有空pWRG7504载体(“EmpVec”)的制剂#1；含有EmpVec(pWRG7054)和pCIA-EnvT质粒(“gp120”)的制剂#2；含有与pPJV2002和pPJV2003佐剂载体(“CTA/B”)联合的EmpVec(pWRG7054)的制剂#3；含有与pPJV2002和pPJV2003佐剂载体(“CTA/B”)联合的pCIA-EnvT质粒(“gp120”)的制剂#4；或含有与pPJV2006和pPJV2003佐剂载体(“CTA-KDEL/B”)联合的pCIA-EnvT质粒(“gp120”)的制剂#5。
图10描述了实施例6中进行的ELISA结果。在图中，几何平均吸光度值表示在血清样品(以四个不同稀释度)中出现的抗HBcAg抗体的效价，所述的血清样品在加强免疫时(本研究的第6周)，接受下述制剂的动物中采集的，或是含有HBcAg/HBsAg载体质粒(pWRG7193)的制剂#1；或是含有与pPJV2002和pPJV2003佐剂载体(“CTA/B”)联合的HBcAg/HBsAg载体质粒(pWRG7193)的制剂#2。
图11描述了实施例6中进行的ELISA结果。在图中，几何平均吸光度值表示在血清样品(以四个不同稀释度)中出现的抗HBcAg抗体的效价，所述的血清样品在加强免疫后2周(本研究的第8周)，从接受下列制剂的动物中采集的，或是含有HBcAg/HBsAg载体质粒(pWRG7193)的制剂#1；或是含有与pPJV2002和pPJV2003佐剂载体(“CTA/B”)联合的HBcAg/HBsAg载体质粒(pWRG7193)的制剂#2。
图12描述了实施例7中进行的ELISA结果。矩形图表示接受下列制剂的每个免疫组的1og IgG1IgG2a比率，在图中从左到右，含有与空载体质粒对照(pWRG7054)联合的pM2-FL质粒(“M2”)的制剂#1；含有与pPJV2002和pPJV2003 CTA/B佐剂载体(“M2+CT”)联合的pM2-FL质粒的制剂#2；或含有与pPJV2004和pPJV2005 LTA/B佐剂载体(“M2+LT”)联合的pM2-FL质粒的制剂#2。
图13A-13D描述了在实施例8的第一次研究中用于评估对肝炎B病毒表面和核心抗原免疫应答的IFN-γ和IL4 ELISPOT测定法的结果。矩形图表示各个实验组中每1×105脾脏细胞的斑点数。
图14描述了实施例9中进行的HSV-2病毒攻击研究的存活结果。
发明详述详述本发明前，可以理解本发明不限于本身的特定示例性分子或过程参数，因为当然，所述分子或过程参数可以变化。用在本文的术语仅仅是为了描述本发明特定实施方式的目的，而不意味限制本发明，这也是可以理解的。此外，除非另外说明，本发明的实践将利用所有本领域技术人员范围内的病毒学，微生物学，分子生物学，重组DNA技术和免疫学的常规方法。文献中全面解释了这些技术。参见，例如Sambrook，等，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，1989)；DNA CloningA Practical Approach，vol.I & II(D.Glover，ed.)OligonucleotideSynthesis(N.Gait，ed.，1984)；A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；和Fundamental Virology，第二版，vol.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.)。
因此无论上文和下文，本文引用的所有出版物、专利和专利申请都整体并入参考文献。
必需注意，除了内容清楚规定外，在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一种”或“一个”和“所述”或“该”等冠词包括复数对象。
定义除了另外定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明相关的本领域普通技术人员通常的理解具有相同的含意。尽管与本文所述类似或等同的大量方法和材料可以用于本发明实践中，但是本文描述了优选的材料和方法。
在描述本发明中，将用到下面的术语，而且按如下所述定义这些术语。
术语“佐剂”意指能特异或非特异改变，提高，定向，重新定向，加强或起始抗原特异性免疫应答的任何材料和组合物。因此，佐剂和抗原的共施用可以导致在施用抗原的个体中，达到期望免疫应答必需的较低或较少剂量，或共施用在个体中可以引起定性和/或定量不同的免疫应答。通过给动物施用佐剂和疫苗组合物，同时单独施用疫苗组合物，并且用标准测定法，如放射免疫测定法，ELISAs，CTL测定法等等本领域已知测定法比较两个组中的抗体和/或细胞介导的免疫，可以测定佐剂的有效性。通常，在疫苗组合物中，尽管单一分子可以有佐剂和抗原两种特性，但是佐剂是与抗原分离的单独部分。
“佐剂组合物”意指任何含有佐剂的药物组合物。可以通过任何适合的药物形式，例如作为液体，粉末，乳膏，洗液，乳剂，凝胶或类似形式递送佐剂组合物，通过本发明方法递送佐剂组合物。然而，优选的佐剂组合物将是粒子形式。尽管没有经常明确说明，但是倾向于与野生型或纯化肽或化学佐剂具有类似生物活性的分子。
术语“肽”所用的是其最广泛的意义，指两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽聚模拟物(peptidomimetics)。可以通过肽键或通过其它键，例如酯，醚等连接亚基。如本文所用，术语“氨基酸”指或天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，和氨基酸类似物和肽聚模拟物。如果肽链短，三个和多个氨基酸通常称为“寡肽”。如果肽链长，肽通常指“多肽”或“蛋白质”。
“抗原”指任何试剂，通常是能诱导个体免疫应答的大分子。术语可以用于指单独大分子或抗原大分子的同质或异质群。如本文所用，“抗原”通常用于指含有一个或多个抗原表位的肽或碳水化合物分子。对于本发明目的而言，可以从任何适合来源获得或得到抗原。而且，对于本发明目的而言，只要肽保持足够的免疫原性，“抗原”包含有修饰的肽，如对天然序列的缺失，添加和置换(通常在天然存在时是保守的)。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或可以是偶然的，如通过产生抗原的宿主突变。
抗目的抗原的“免疫应答”是个体中对该抗原的体液和/或细胞免疫应答的发展。对于本发明目的而言，“体液免疫应答”指通过抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是通过T-淋巴细胞和/或其它白血细胞介导的免疫应答。
术语“核酸免疫”用在本文指引入宿主细胞编码一个或多个选定抗原的核酸分子进行一个抗原或许多抗原的体内表达。术语也包含引入宿主细胞编码一个或多个选定佐剂的核酸分子进行一个佐剂或许多佐剂的体内表达。如通过标准肌肉或真皮内注射；经皮的粒子递送；吸入；局部地，或通过口、鼻内或粘膜施用方式，可以直接引入核酸分子进入受体个体。可选的方案，在离体条件下，可以引入分子进入从个体分离的细胞。在后一种情况下，再引入含有目的核酸分子的细胞进入个体，因此可以增加抗核酸分子编码抗原的免疫应答，或因此核酸分子编码的佐剂可以发挥其佐剂作用。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文是互换使用的，指任何长度核苷酸(或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以有任何三维结构，可以进行任何已知或未知的功能。多核苷酸非限制性的例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。
多核苷酸通常由四个核苷酸碱基腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))的特异序列组成。因此，术语核酸序列是多核苷酸分子的字母表示。可以在有中央处理单元计算机的数据库中输入该字母表示，并且用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性检索。
“载体”能转移核酸序列到靶细胞(例如，病毒载体、非病毒载体、粒子载体和脂质体)。通常，“载体构建体”、“表达载体”、和“基因转移载体”指能引导目的基因表达的任何核酸构建体，而且其能转移基因到靶细胞。因此，该术语包括克隆和表达载体及病毒载体。“质粒”是染色体外遗传成分形式的载体。
“编码”选定佐剂和/或抗原的核酸序列是核酸分子，当该核酸分子置于合适调节序列控制时，其在体内被转录(DNA情况下)和翻译(RNA情况下)成多肽。由5’-(氨基)末端的起始密码子和3’-(羧基)末端的翻译终止密码子确定编码序列的范围。对于本发明目的而言，该核酸序列可以包括，但不限于病毒的cDNA、原核或真核mRNA、病毒或原核DNA或RNA的基因组序列、甚至是合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3’端。
“启动子”是起始和调节编码多肽的多核苷酸转录的核苷酸序列。启动子可以包括诱导型启动子(其中分析物、辅因子、调节蛋白等诱导可操作地与启动子连接的多核苷酸序列的表达)，阻抑型启动子(其中分析物、辅因子、调节蛋白等阻抑可操作地与启动子连接的多核苷酸序列的表达)，及组成型启动子。倾向术语“启动子”或“控制元件”包括全长启动子区域和这些区域的功能(例如，控制转录或翻译)片段。
“可操作地连接”指元件的排列，其中装配所述组分以进行其通常的功能。因此，当适合的酶存在时，可操作地与核酸序列连接的特定启动子能影响该序列的表达。只要启动子起到引导序列表达的功能，启动子不需要与序列邻接。因此，例如，可以在启动子序列和核酸序列间存在间插的非翻译但转录序列，仍然可以认为启动子序列“可操作地连接”编码序列。
“重组体”在本文用于描述基因组、cDNA、半合成或合成来源的核酸分子(多核苷酸)，利用其来源或操作，其与其天然相关的全部或部分多核苷酸无关，和/或与其天然所连接的多核苷酸以外的多核苷酸连接。当单个重组核酸分子中含有的两个核酸序列在天然存在时，通常相互不相关时，这两个核酸序列相互是“异源的”。
“分离的多核苷酸”是来源于整个生物体的单独和分离的核酸分子，在天然存在时，该分子是在整个生物体中发现的；或是缺少与其天然存在时，通常相关序列的全部或部分的核酸分子；或是天然存在的序列，但该序列有与其相关的异源序列(如下所定义)。如果序列和来源分子区域、其cDNA、其互补序列有相同或基本相同的碱基对序列，或如果如下所述其显示了序列同一性，那么序列是“来源于或获自”所述分子。
检测核酸和氨基酸“序列同一性”或“序列同源性”的技术也是本领域已知的。通常，该技术包括检测基因的mRNA核苷酸序列和/或检测由其编码的氨基酸序列，和比较这些序列与第二核苷酸序列或氨基酸序列。通常，“同一性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸对应。可以通过检测它们的“同一性百分比”比较两个或多个序列(多核苷酸或氨基酸)。无论核酸或氨基酸序列，两个序列的同一性百分比是两个比对序列间的精确匹配数除以较短序列的长度，乘以100。Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics2482-489(1981)的局部同源性算法提供了用于核酸序列的适合的比对。通过用Dayhoff，(Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3353-358，National Biomedical ResearchFoundation，华盛顿，美国)开发及Gribskov，(Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986))标准化的记分矩阵，该算法可以用于氨基酸序列。Genetics Computer Group(Madison，WI)在“BestFit”实用申请中提供了该算法检测序列同一性百分比的示例性具体实施。在Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual，第8版(1995)(可从Genetics Computer Group，Madison，WI得到)中描述了这个方法的缺省参数。在本发明上下文确立同一性百分比的优选方法是利用MPSRCH程序包，其版权由the University of Edinburgh所有，由JohnF.Collins和Shane S.Sturrok开发，IntelliGenetics，Inc.(MountainView，CA)发行。这套程序包可以利用Smith-Waterman算法，其中缺省参数用于记分表(例如，空位设置罚值12，空位扩展罚值1和空位6)。“匹配”值产生的数据放映了“序列同一性”。用于估算序列间同一性或类似性百分比的其它适合程序通常是本领域已知的，例如，另一个具有缺省参数应用的比对程序是BLAST。例如，利用下面缺省参数应用BLASTN和BLASTP遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝双链；截断值＝60；E值(expect)＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；分类＝HIGH SCORE；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIR。可以在下面网址中发现这些程序的详细内容http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
作为替代方案，在多核苷酸同源区形成稳定双螺旋的条件下，可以通过多核苷酸杂交检测同源性，随后用单链特异性核酸酶消化，及消化片段大小的检测。用上述方法测定，当序列与确定长度的分子显示至少约80-85％，优选至少约90％，和最优选地至少约95％-98％序列同一性时，两个DNA或两个多肽序列相互是“基本同源的”。如本文所用，基本同源也指显示与特定DNA或多肽序列有完整同一性的序列。可以在Southern杂交实验，在例如严格条件下，鉴定基本同源性的DNA序列，所述条件由该特定系统所限定。例如，严格杂交条件可以包括50％甲酰胺，5x Denhardt’s溶液，5x SSC，0.1％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA，并且冲洗条件可以包含在37℃，2x SSC，0.1％SDS，接着68℃，1xSSC，0.1％SDS。定义适合的杂交条件是本领域技术。参见，例如，Sambrook等，上文；DNA Cloning，上文；Nucleic Acid Hybridization，上文。
术语“经皮的”递送指皮内(例如进入真皮或表皮)，经皮(例如经皮肤的)和经粘膜施用，即，通过试剂的递送进入或穿过皮肤或粘膜组织。参见，例如Transdermal Drug DeliveryDevelopmental Issues andResearch Initiatives，Hadgraft和Guy(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications，Robinson和Lee(eds.)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery of Drugs，卷1-3，Kydonieus和Berner(eds.)，CRC出版社，(1987)。因此，该术语包括利用如美国专利号5,630,796所述的粒子递送装置(例如，无针注射器)的试剂递送，及如美国专利号5,865,796所述的粒子介导递送装置的递送。
通过“核心载体”指为了给予确定的粒子大小和完成细胞膜穿透所需动量的足够高密度，载体上包被待处理核酸(例如，DNA、RNA)，因此用粒子介导技术可以(参见，例如美国专利号5,100,792)递送待处理分子。核心载体通常包括钨、金、铂、铁酸盐、聚苯乙烯和乳胶。参见，例如Particle Bombardment Technology for Gene Transfer，(1994)Yang，N.ed.，Oxford University出版社，New York，NY 10-11页。
通过“粒子递送装置”指不需要常规针的辅助经皮递送粒子组合物穿透皮肤。整个本文件讨论本发明所用的粒子递送装置。
本文所用的术语“治疗”包括下面任何一个感染或再感染的预防；症状的减少和消除；病原体的减少或完全消除。治疗可以在预防(感染前)或治疗(感染后)阶段实现。
在本文可互换使用术语“个体”和“受处理者”，指脊索(cordata)亚门的任何成员，包括，非限定于，人和任何其它灵长目动物，包括非人灵长目如黑猩猩和其它猿及猴种；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养的哺乳动物如狗和猫；实验动物包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养、野生和猎鸟如鸡、火鸡和其它鸡形目的鸟、鸭子、鹅等等。术语不表示特定的年龄。因此，意指包括成年和新出生的个体。因为所有这些脊椎动物的免疫系统类似地起作用，所以本文所述方法意指在任何上述脊椎动物物种中应用。
概述详述本发明前，可以理解本发明不限于特定的配方或过程参数，因为，当然，所述配方或过程参数可以变化。用在本文的术语只是为了描述本发明特定实施方式的目的，而不意味限制本发明，这也是可以理解的。
本发明提供了含有核酸序列的新组合物，其中组合物中第一序列是获自或来源于ADP-核糖基化细菌毒素的A亚基编码序列，组合物中第二序列是获得或来源于ADP-核糖基化细菌毒素的B亚基编码序列。第一和第二序列在免疫方法中是有用的，其中为了在免疫个体中提供佐剂效果(抗共施用的目的抗原)，递送它们给个体。ADP-核糖基化细菌毒素是相关细菌外毒素家族，包括白喉毒素(DT)，百日咳毒素(PT)，霍乱毒素(CT)，大肠杆菌(E.coli)热不稳定毒素(LT1和LT2)，假单胞菌(Pseudomona)内毒素A，假单胞菌(Pseudomona)外毒素S，蜡样芽孢杆菌(B.cereus)胞外酶，球形芽孢杆菌毒素(B.sphaericus)，肉毒梭菌(C.botulinum)C2和C3毒素，泥渣梭菌(C.limosum)胞外酶，及产气荚膜梭菌(C.perfringens)，C.spiriforma和艰难梭菌(C.difficile)的毒素，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EDIN，和ADP-核糖基化细菌毒素突变体，如CRM197，非毒性白喉毒素突变体(参见，例如Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251175；和Constantino等(1992)Vaccine)。大多数ADP-核糖基化细菌毒素被组织为A:B多聚体，其中A亚基含有ADP-核糖基转移酶的活性，B亚基作为结合部分。用于本发明组合物的优选ADP-核糖基化细菌毒素包括霍乱毒素和大肠杆菌(E.coii)热不稳定毒素。
霍乱毒素(CT)和相关的大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(LT)是其各自肠毒素细菌株系的分泌产物，其是有效的免疫原，并且当系统、口服或粘膜施用时显示了强毒性。当通过肌肉或口服途径施用CT和LT时，两者提供抗原佐剂效果是已知的。低于毒性所需剂量时就已观察到了这些佐剂效果。两种毒素是极其类似的分子，在氨基酸水平上至少约70-80％是同源的。
CT和LT毒素是六聚体，由5个B亚基分子组成的环形环环绕单分子A亚基构成。A亚基具有引起G蛋白修饰的ADP核糖基酶活性，所述修饰引起A亚基在哺乳动物细胞内在化后的cAMP和蛋白激酶A正调节。可以通过外源蛋白酶切割A亚基产生由单二硫桥连接的A1和A2片段。CT的A亚基含有与蛋白质跨越高尔基网进入ER挽回有关的C-末端KDEL肽基序(对于LT的A亚基是RDEL)。对于内在化后为毒性A片段递送到正确细胞区室，及该细胞区室内毒素的保留，这可能是重要的。A1亚基进入细胞胞质，并且通过催化G蛋白质ADP-核糖基化触发C1流出，其激活引起提高cAMP水平的腺苷酸环化酶。提高的cAMP引起蛋白激酶A磷酸化和打开囊性纤维化跨膜传导调节蛋白氯离子通道。
片段A2的主要作用是与B亚基相互作用。通过B亚基的5个考贝介导毒素内在化，B亚基对GM1神经节苷脂，普遍存在哺乳动物细胞表面的鞘糖脂具有结合活性。
A和B亚基对于佐剂活性的相对重要性是有争议的。在本领域存在这样的推测，即A亚基可以调节与B亚基相关的佐剂效果。一些研究证明A亚基的突变废除了佐剂活性，而其它研究表明阻断ADP-核糖基酶活性的A亚基突变对佐剂活性没有影响。其它报告表明对于纯化的B亚基或重组B亚基制剂，佐剂效果的变化水平。可能A和B亚基有独立产生佐剂活性的单独功能。这些功能分别是ADP-核糖基转移酶的活性和受体触发活性。尤其是与B细胞上GM1受体结合的LT的B亚基引起多克隆活化，其在缺乏显著增殖时出现，而且包括许多重要分子，如MCH II类、B7、CD40、ICAM-1和IL2-Rα的正调节。对于T细胞，向伴刀豆球蛋白A刺激的T细胞添加CT或LT全毒素或重组B亚基引起胸腺嘧啶加入的减少。还没有报道这些分子对巨噬细胞和树突状细胞的作用。在PBMC培养中，EtxB刺激高水平的TNF-α和IL-10而不是IL-12产生。这与利用CT和LT形式作为佐剂有关的主要Th2样应答的观察结果一致。
因此本发明的意外特征是本发明多核苷酸佐剂组合物的施用优先产生增强的抗共施用抗原的Th1样免疫应答，而不是应用ADP-核糖基化外毒素佐剂化合物预期的Th2样应答。
ADP-核糖基化外毒素亚基的编码序列在一个实施方式中，提供包含一个或多个重组核酸分子的组合物，所述一个或多个分子含有第一和第二核酸序列，其中(a)第一核酸序列是得自或来源于ADP-核糖基化外毒素截短的A亚基肽编码区，和(b)第二核酸序列是得自或来源于ADP-核糖基化外毒素截短的B亚基肽编码区。因为已基因改变了每个所述编码区以产生5’缺失，所以编码区提供“截短的”亚基肽，因此编码的亚基肽没有氨基末端细菌信号肽。
在另一实施方式中，提供包含一个或多个重组核酸分子的组合物，所述一个或多个分子含有第一和第二核酸序列，其中(a)第一核酸序列是得自或来源于ADP-核糖基化外毒素的修饰的、成熟A亚基肽编码区，和(b)第二核酸序列是得自或来源于ADP-核糖基化外毒素的成熟B亚基肽编码区。因为已基因改变了所述编码区以缺失在编码亚基肽中正常发现的4个氨基酸残基C-末端KDEL或RDEL基序，所以第一核酸序列含有提供“修饰的”A亚基肽的编码区。
在进一步的具体实施方式
中，提供包含一个或多个重组核酸分子的组合物，所述一个或多个分子含有第一和第二核酸序列，其中(a)第一核酸序列是得自或来源于ADP-核糖基化外毒素截短和修饰的A亚基肽编码区，和(b)第二核酸序列是得自或来源于ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基肽编码序列。
在特定优选的实施方式中，ADP-核糖基化外毒素肽亚基编码序列得自或来源于霍乱毒素(CT)。在其它特定优选实施方式中，ADP-核糖基化外毒素肽亚基编码序列得自或来源于大肠杆菌(E.coli)热不稳定肠毒素(LT)，例如LT1或LT2。
通常，各种肠毒素细菌种的基因组部分，特别是含有ADP-核糖基化外毒素编码序列的基因组部分是已知的，其序列例如在互联网是公众可获得的，例如在World Wide Web，和/或存储在储存库如GenBank数据库。例如，在Locus VIBCTXABB(登记号D30053)可以发现CT亚基A和B基因完整序列的GenBank入口，而在Locus AB0116677(登记号AB011677)可以发现LT亚基A和B基因完整序列的GenBank入口。也可以在本发明组合物和方法中利用这些毒素序列的活性变异体或片断。对于ADP-核糖基化外毒素的总的讨论，参见例如Krueger等(1995)Clin.Microbiol.Rev.834-47。而且，在本发明的一些方面，可以进一步基因修饰一个或两个毒素亚基肽编码区以除去其编码的亚基肽的毒性。例如，破坏ADP-核糖基化活性、胰蛋白酶切割位点突变或破坏结合活性的基因改变的毒素突变体是本领域已知的。参见，例如Burnette等(1994)“Recombinant microbial ADP-ribosylating toxins of Bordetellapertusis，Vibrio choleraE，and enterotoxigenic Escherichia colistructure，function and toxoid vaccine development，”在Bioprocess Technology，Burnette等eds.，185-203页；Rappuoli等(1995)Int.Archiv.Allergy Immunol.108327-333；和Rappuoli等(1996)Ad.Exp.Med.Biol.39755-60。用已知技术，通常在适合的载体(例如质粒骨架)中插入编码选定毒素亚基的序列，如下面实施例所述。
可以用已知方法获得和/或制备编码目的ADP-核糖基化外毒素亚基肽的一个或多个序列。例如，用标准分子生物学工具，可以得到基本上纯的制剂。即，用重组方法，如通过从表达毒素亚基的细胞筛选cDNA文库，或通过从已知包含该多核苷酸序列的载体得到毒素亚基编码序列，可以获得编码上述毒素亚基的多核苷酸序列。各种细菌株系的毒素亚基编码序列保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，而其它的毒素亚基编码序列可从国家和国际健康组织如疾病控制中心(the Centers ofDisease Control)(Atlanta，GA)得到。参见，例如Sambrook等，上文，用于获得和分离核酸分子的技术说明。也可以合成，而不是克隆产生多核苷酸序列。
然而，分离特定核酸分子的另一个方便方法是通过聚合酶链式反应(PCR)Mullis等(1987)Methods Enzymol.155335-350。这个技术利用DNA聚合酶，通常是热稳定DNA聚合酶复制期望的DNA区域。通过特异序列的寡核苷酸识别将要复制的DNA区域，该寡核苷酸与期望DNA的相反末端和相反链互补以引发复制反应。第一轮复制产物是用于随后复制的模板本身，因此重复连续的复制循环引起了由所用引物对限定的DNA片断的几何扩增。
一旦获得目的ADP-核糖基化外毒素亚基的相关序列，用标准克隆或分子生物学技术可以将其连接在一起以提供一个或多个邻接核酸分子。更具体地，获得选定毒素亚基联合的序列信息后，编码序列可以互相联合或与其它序列联合以形成杂交序列，或分别处理编码序列。在杂交序列中，亚基肽编码序列相互间可以通过任何方式定位，而且以任何排序方式包含在单分子中，例如，作为单拷贝，作为在分子中随机重复的多拷贝，或作为多串连重复包含在分子中，或另外的有序重复基序。
尽管可以用许多常规分子生物学技术构建该重组核酸分子，但是一个方便的方法需要利用穿梭或克隆载体中一个或多个单一限制性位点(或者插入在适合载体序列中插入一个或多个单一位点)和标准克隆技术定向亚基肽编码一个序列或多个序列到载体特定靶位点中。
作为替代方案，可以合成，而不是克隆产生杂交分子。设计具有期望特定氨基酸的合适密码子的核苷酸序列。一般地，人们选择表达序列的期望宿主的优选密码子。然后，可以从标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完整序列，并且装配为完整编码序列。参见，例如Edge(1981)Nature292756；Nambair等(1984)Science(1984)2231299；Jay等(1984)J.Biol.Chem.2596311。
一旦获得或构建相关的ADP-核糖基化外毒素肽编码序列，可以在含有控制序列的一个或多个适合载体内插入它们，该控制序列可操作地与插入的一个序列或多个序列连接，因此提供了允许毒素亚基肽在靶个体物种体内表达的表达盒子。
哺乳动物细胞表达的常用启动子包括SV40早期启动子，CMV启动子如CMV立即早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子，腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)，和其它适合有效的启动子系统。非病毒启动子，如鼠金属硫蛋白基因启动子也可以用于哺乳动物表达。也可以利用诱导型、阻抑型或其它控制型启动子。通常，也将存在转录终止和聚腺苷酸化序列，其位于每个翻译终止子的3’。优选地，也存在位于每个编码序列5’的翻译起始的最佳序列。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括来源于SV40的转录终止子/聚腺苷酸化信号，如Sambrook et al等，上文，及牛生长激素终止子序列。表达盒子内也可以设计含有剪接供体和受体位点的内含子。
此外，表达盒子中可以包含增强子元件以增加表达水平。适合的增强子例子包括SV40早期基因增强子(Dijkema等(1985)EMBO J.4761)，来源于鲁斯氏肉瘤病毒长末端重复(LTR)的增强子/启动子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA796777)，和来源于人或鼠CMV的元件(Boshart等(1985)Cell41521)，例如包含在CMV内含子A序列中的元件。
在一些特定的实施方式中，可以进一步包含辅助序列，该辅助序列提供了所连接的ADP-核糖基化外毒素亚基肽从哺乳动物细胞的分泌。该分泌前导序列是本领域技术人员已知的，而且包括，例如组织血纤维蛋白溶酶原激活物(tpa)前导信号序列。
在产生含有目的ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列的一个或多个适合的表达盒子(或核酸构建体，如质粒载体)后，在适合的转染载体，如DNA质粒载体或病毒载体中可以提供表达盒子用于随后施用于个体。在这方面，本发明的多核苷酸组合物可以用做独立的佐剂组合物，或与目的抗原共施用，例如作为多组分疫苗组合物的一部分。例如，在多组分疫苗组合物中，该核酸分子(含有目的ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列)可以与编码一个或多个抗原的其它核酸分子，例如含有编码流感HA或NA抗原序列的分子，或含有编码HIV抗原序列的分子联合，已知所述抗原对提供抗病原体的保护是重要的。作为替代方案，除了编码毒素亚基的多核苷酸外，多组分疫苗组合物还可以包含常规整体病毒的抗原、分裂的病毒、多糖、或纯化的亚基疫苗制剂，如本文下文所述。
抗原本文所述的组合物和方法在辅助免疫系统抗广泛种类共施用抗原方面是有用的，所述抗原，例如得自或来源于患病细胞或组织、人或动物病原体的抗原。对于本发明目的而言，佐剂或用于增强对特异抗原的免疫应答，例如当佐剂与疫苗组合物共施用时，免疫应答比施用同样量没有佐剂的疫苗组合物诱导的免疫应答更强；佐剂或用于定向抗共施用抗原的特定型或类的免疫应答。本发明佐剂组合物“有效量”的共施用是增强对共施用抗原免疫学反应的量，因此，例如，需要较低或较少剂量的抗原产生有效的免疫应答。
例如，当本发明的编码佐剂组合物的ADP-核糖基化外毒素亚基与目的抗原(例如，疫苗组合物)“共施用”时，本文所用术语“共施用”指佐剂组合物和抗原的同时或共同施用，例如，当两者出现在相同组合物中，或者在几乎相同时间但不同位点以单独组合物形式施用时，及佐剂组合物和抗原在不同时间以单独组合物形式递送，包括给不同位点递送。例如，在相同或不同位点递送抗原前或后可以递送佐剂组合物。佐剂和抗原递送的计时范围可以从约几分钟间隔到几小时间隔，到几天间隔。
对于本发明目的而言，术语“病原体”以广泛地意义应用，指疾病和病情的特定成因因子，并且包括提供诱导免疫应答的分子原的任何因子。因此，病原体包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、癌细胞等等。通常，病原体产生的一个或多个肽或碳水化合物抗原诱导免疫应答。鉴定适合抗原，获得和制备该分子，然后测定适合的剂量，测定适合的免疫原性及用该抗原治疗的方法是本领域已知的。参见，例如Plotkin等(1994)Vaccines，第二版，W.B.Saunders，Philadelphia，PA。因此，可以用于接种脊椎动物个体，特别是人和非人的哺乳动物的抗原源的非限制性例子包括病毒、细菌、真菌和其它的病原生物体。
适合的病毒抗原包括但不限于从肝炎家族病毒，包括肝炎A病毒(HAV)，肝炎B病毒(HBV)，肝炎C病毒(HBC)，δ肝炎病毒(HDV)，肝炎E病毒(HEV)和肝炎G病毒(HGV)得到或来源的病毒抗原。参见，例如国际公布号WO 89/04669；WO 90/11089；和WO 90/14436。HCV基因组编码多个病毒蛋白质，包括E1和E2。参见，例如Houghton等(1991)Hepatology14381-388。将发现含有编码这些蛋白质序列的基因组片段及其抗原片段在本发明的应用。类似地，HDV的δ-抗原的编码序列是已知的(参见，例如美国专利号5,378,814)。
以类似的方式，本发明可以利用疱疹病毒家族广泛种类的蛋白质作为抗原，包括来源于疱疹单纯病毒(HSV)类型1和类型2，如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；水痘带状疱疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)，包括CMV gB和CMV gH的蛋白质；和其它的人疱疹病毒，如HHV6和HHV7的抗原。(参见，例如.Chee等(1990)Cytomegaloviruses(J.K.McDougall，ed.，Springer-Verlag，125-169页；McGeoch等(1988)J.Gen.Virol.691531-1574；美国专利号5,171,568；Baer等(1984)Nature310207-211；和Davison等(1986)J.Gen.Virol.671759-1816)。
已知和报道了人免疫缺陷病毒(HIV)抗原，如许多HIV-1和HIV-2分离物，包括HIV各种遗传亚型成员的gp120分子(参见，例如Myers等，Los Alamos Database，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，New Mexico(1992)；和Modrow等(1987)J.Virol.61570-578)。将发现从任何这些分离物来源或获得的含有抗原的基因组片段在本发明中的应用。而且，将发现来源于或获自各种HIV分离物中任何一种的其它免疫原蛋白质在本文的应用，所述免疫原蛋白质包括含有一个或多个各种衣壳蛋白质如gp160和gp41的片段，gag抗原如p24gag和p55gag，及来源于HIV的pol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpu和LTR区域的蛋白质。
也将发现来源于或获自其它病毒的抗原在本文的应用，如非限制性的，小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒等)；杯状病毒科；披膜病毒科(例如风疹病毒、登革热病毒等)；黄病毒科；冠状病毒科；呼肠孤病毒科(例如，轮状病毒)；双节段RNA病毒科；弹状病毒科(例如，狂犬病病毒)；正粘病毒科(例如，甲、乙和丙型流感病毒等)；纤丝病毒科；副粘病毒科(例如，流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒等)；布尼亚病毒科；沙粒病毒科；逆转录病毒科(例如，HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(作为HTLV-III，LAV，ARV，hTLR等也是已知的))，包括但不限于来源于分离物HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN；HIV-1CM235，HIV-1US4HIV-2，其中的其它种类的抗原；猿免疫缺陷病毒(SIV)；乳头状瘤病毒、蜱传脑炎(the tick-bourne)病毒等等。关于这些和其它病毒的描述参见，例如Virology，第三版(W.K.Jokliked.1988)；Fundamental Virology，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.1991)。
在一些上下文中，获自或来源于病毒病原体的病毒抗原可以是优选的，这些病毒病原体通常通过粘膜表面进入身体，已知其引起或与人类疾病有关，所述病毒病原体例如，但不限于HIV(AIDS)、流感病毒(Flu)、单纯疱疹病毒(生殖器感染、单纯性疱疹、STDs)、轮状病毒(腹泻)、副流感病毒(呼吸感染)、脊髓灰质炎病毒(脊髓灰质炎)、呼吸道合胞体病毒(呼吸感染)、麻疹和流行性腮腺炎病毒(麻疹、腮腺炎)、风疹病毒(风疹)和鼻病毒(普通感冒)。
可以从已知与疾病相关的成因因子获得或衍生含有细菌和寄生抗原的基因组片段，包括但不限于，白喉(Diptheria)、百日咳、破伤风、结核病、细菌或真菌肺炎、中耳炎、淋病(Gonnorhea)、霍乱、伤寒、脑膜炎、单核细胞增多症、瘟疫、细菌性痢疾或沙门氏菌感染、军团病、莱姆病(Lyme Disease)、麻风病、疟疾、钩虫病、盘尾丝虫病、血吸虫病、Trypamasomialsis，Lesmaniasis、贾第鞭毛虫病、阿米巴病(Amoebiasis)、丝虫病、包柔螺旋体病(Borelia)和旋毛虫病。而且进一步抗原可以从非常规病毒，如库鲁病、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob病，CJD)、羊瘙痒病、可传递的水貂脑病和慢性消耗性疾病，或蛋白质感染粒子如与疯牛病有关的朊病毒的成因因子得到或来源。
特定的病原体可以包括结核分支杆菌、衣原体、淋病奈瑟氏球菌、志贺菌属、沙门菌、霍乱弧菌、梅毒密螺旋体、假单胞菌、百日咳博德特氏菌、布鲁氏菌、土拉热弗朗西丝氏菌(Franciscella tulorensis)、幽门螺杆菌，问号钩端螺旋、嗜肺军团菌、鼠疫杆菌、链球菌(A和B型)、肺炎球菌、脑膜炎球菌、血友病流感(Hemophilus influenza)(B型)、鼠弓形体、Complylobacteriosis、粘膜炎莫拉菌、腹股沟肉芽肿和放线菌病；真菌病原体包括念珠菌病和曲霉病；寄生病原体包括绦虫属、血吸虫、线虫、阿米巴病、贾第虫病、隐孢子虫属、血吸虫属、卡氏肺囊虫、毛滴虫病和旋毛虫病。因此，本发明也可以用于提供抗许多兽医疾病的免疫应答，如口蹄疫、冠状病毒、多杀巴斯德菌、螺杆菌属、寻常圆线虫、胸膜肺炎放线杆菌、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、肺炎克雷白菌、大肠杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和brochiseptica。
在一些实施方式中，目的抗原可以是过敏原。“过敏原”是能引起超敏感性状态的抗原，或在已用过敏原致敏的个体中能激发立即超敏感性反应。过敏原通常是具有过敏属性的蛋白质或与蛋白质结合的化学试剂；然而，过敏原也包括从各种人造或天然来源，如植物材料、金属、化妆品或去污剂中的组分、乳胶等等得到的有机或无机材料。用于本发明方法中的适合过敏原的分类包括，但不限于花粉、动物毛屑、草、霉、尘埃、抗生素、螫刺昆虫毒液，和各种环境的(包括化学试剂和金属)、药物和食品过敏原。普通树过敏原包括三叶杨、普通岑树、桦树、槭树、橡树、榆树、山胡桃木和美洲山核桃树的花粉；普通植物过敏原包括来自黑麦、豚草、英国车前草、酸模和藜的过敏原；植物接触过敏原包括来自毒栎、毒葛和荨麻的过敏原；普通草过敏原包括来自猫尾草、约翰逊、百慕大、牛毛草和莓系属的牧草过敏原；也可以从霉菌或真菌得到普通过敏原，例如链格孢属、镰刀菌属、单孢枝霉菌属、曲霉属、小多胞菌属、毛霉菌和嗜热放线菌纲；青霉素和四环素是普通的抗生素过敏原；从房屋或有机尘埃(来源通常是真菌)中，从昆虫如房屋螨类(dermatphagoides pterosinyssis)，或是动物来源的如羽毛，猫和狗的毛屑可以得到表皮过敏原；普通的食物过敏原包括牛奶和奶酪(奶制品)、蛋、小麦、坚果(例如花生)、海产食品(例如贝类)、豌豆、豆和谷蛋白过敏原；普通的环境过敏原包括金属(镍和金)、化学试剂(甲醛、三硝基苯酚和松脂)、乳剂、橡胶、纤维(棉花或羊毛)、粗帆布、染发剂、化妆品、去污剂和香味过敏原；普通的药物过敏原包括局部麻醉剂和水杨酸盐过敏原；抗生素过敏原包括青霉素和磺胺类药过敏原；和普通的昆虫过敏原包括蜜蜂、胡蜂和蚂蚁毒液、及蟑螂萼器过敏原。特定特征的过敏原包括，但不限于Der pI过敏原(Hoyne等(1994)Immunology83190-195)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等(1996)J.Clin.Invest.981676-1683)，桦树花粉过敏原Betv1(Bauer等(1997)Clin.Exp.Immunol.107536-541)和多抗原表位重组草过敏原rKBG8.3(Cao等(1997)Immunology9046-51)的主要和隐含的抗原表位。可购买得到这些和其它适合的过敏原，和/或根据已知技术易制备作为提取物的这些和其它适合的过敏原。
在一些其它实施方式中，目的抗原可以是肿瘤特异性抗原。对于本发明目的而言，肿瘤特异性抗原包括，但不限于各种MAGEs(黑色素瘤相关抗原E)，包括MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3(HLA-A1肽)、MAGE 4等的任何一种；各种酪氨酸酶(HLA-A2肽)；突变的ras；突变的p53；和p97黑色素瘤抗原中任何一种；其它肿瘤特异性抗原包括与晚期癌症相关Ras肽和p53肽、与宫颈癌相关的HPV 16/18和E6/E7抗原、与乳腺癌相关的MUC1-KLH抗原、与结肠直肠癌相关的CEA(癌胚抗原)，与黑色素肿瘤相关的gp100或MART1抗原、及与前列腺癌相关的PSA抗原。p53基因序列是已知的(参见，例如，Harris等(1986)Mol.Cell.Biol.64650-4656)，并且存储在GenBank中，登记号为M14694。因此，可以用本发明佐剂组合物进行治疗宫颈、乳腺、结肠直肠、前列腺、肺癌和黑色素瘤的免疫治疗方法。
可以用本领域技术人员已知的各种方法获得或产生本发明所用抗原。具体地，用标准纯化技术，可以直接从天然来源分离抗原。作为替代方案，可以用已知技术重组产生抗原。参见，例如Sambrook，Fritsch& Maniatis，Molecular CloningALaboratory Manual，Vols.I，II和III，第二版(1989)；DNA Cloning，Vols.I和II(D.N.Glover ed.1985)。也可以根据所述的氨基酸序列，通过化学多聚体合成，如固相肽合成来合成本文所用抗原。这些方法对本领域技术人员是已知的。参见，对于固相肽合成技术，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，SolidPhasePeptide Synthesis，第二版，Pierce Chemicai Co.，Rockford，IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield，The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，编者E.Gross和J.Meienhofer，Vol.2，Academic Press，New York，(1980)，3-254页；和对于经典溶液合成，M.Bodansky，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Berlin(1984)及E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，上文，Vol.1。
如果期望，可以用重组方法，例如通过从表达基因的细胞筛选cDNA和基因组文库，或通过从已知包含该多核苷酸序列的载体中取得基因，获得编码上述抗原的多核苷酸序列。而且，用标准技术，如苯酚提取和cDNA或基因组DNA PCR，可以直接从含有该多核苷酸序列的细胞和组织中分离期望的基因。参见，例如Sambrook等，上文，用于获得和分离DNA技术的描述。也可以合成，而不是克隆产生多核苷酸序列。
在这些组合物中，其中将通过编码目的抗原的核酸序列的方式提供抗原成分，选定抗原的编码序列可以与一个或两个ADP-核糖基化外毒素亚基肽的编码序列连接以提供带有所有三个编码序列的单一构建体，可以与毒素亚基的仅一个编码序列连接以提供，例如两个质粒组合物，或提供在来自于带有毒素亚基编码序列的单一构建体或多构建体的分离构建体中。在上述情况的每一种中，抗原可以可操作地被连接，并且在相同或不同控制元件，例如启动子和增强子的转录控制下。在这些构建体中，其中单一控制元件用于引导两个或多个编码序列的转录，可以利用内部核糖体进入序列(IRES)促进多序列的转录。
多核苷酸的施用可以通过任何合适的方法施用本文所述的多核苷酸(含有选定ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列的核酸分子)。在优选的实施方式中，如下文所述，通过包被含有目的ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列(并且，在一些实施方式中，是在相同或不同构建体中的目的抗原的编码序列)的一个或多个适合构建体(例如，一个或多个DNA质粒构建体)到核心载体粒子上，然后给个体或细胞施用包被的粒子。然而，也可以用病毒载体或用非病毒系统，例如裸核酸递送，递送本发明多核苷酸。
病毒载体大量基于病毒的系统已用于基因递送。例如，逆转录病毒是已知的，并且通常利用具有整合缺陷原病毒(辅助病毒)的包装系，该缺陷原病毒(辅助病毒)表达所有的病毒基因，但是由于包装信号，已知为pis序列的缺失，不能包装其自身基因组。因此，细胞系产生了空病毒外壳。可以由包装系得到生产系，生产系中除了辅助病毒外，还含有病毒载体，该病毒载体含有在病毒复制和包装中所需的顺式(in cis)序列，即已知的长末端重复(LTRs)。目的多核苷酸分子可以插入载体中，在逆转录病毒辅助病毒合成的病毒外壳中包装。然后可以分离重组病毒，及递送给个体重组病毒。(参见，例如，美国专利号5,219,740)。代表性的逆转录病毒载体包括但不限于，载体例如，如美国专利号5,219,740所述LHL，N2，LNSAL，LSHL和LHL2载体，本文整体并入这篇文献为参考文献，及这些载体的衍生物，如本文所述的修饰的N2载体。可以用本领域熟知技术构建逆转录病毒载体。参见，例如美国专利号5,219,740；Mann等(1983)Cell33153-159。
已研究开发了用于基因递送的基于腺病毒的系统，该系统适合递送本文所述的核酸分子。人腺病毒是通过受体介导的胞吞作用进入细胞的双链DNA病毒。这些病毒特别适于基因转移，因为它们容易生长和操作，而且它们显示了在体内和体外广泛的宿主范围。例如，腺病毒能感染造血的、淋巴样和骨髓来源的人细胞。而且，腺病毒感染静止和复制的靶细胞。不同于整合进宿主基因组的逆转录病毒，腺病毒持续存在于染色体外，因此使与插入诱变有关的风险最小化。病毒容易高效价产生，而且是稳定的，因此可以纯化和贮藏。即使是在有能力复制的形式中，腺病毒仅仅引起低水平的发病率，并且与人恶性瘤无关。因此，已开发研究出利用这些优点的腺病毒载体。腺病毒载体的描述和它们的应用参见，例如Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57267-274；Bett等(1993)J.Virol.675911-5921；Mittereder等(1994)Human GeneTherapy5717-729；Seth等(1994)J.Virol.68933-940；Barr等(1994)Gene Therapy151-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques6616-629；Rich等(1993)Human Gene Therapy4461-476。
腺相关病毒载体(AAV)也可用于施用本文所述的多核苷酸。在这方面，AAV载体可以来源于任何AAV血清型，包括但不限于AAV-1，AAV-2，AAV-3，AAV-4，AAV-5，AAV-7等。AAV载体可以有一个或多个整体或部分缺失的AAV野生型基因，优选rep和/或cap基因，但保留一个或多个功能的侧翼末端反向重复(ITR)序列。通常认为功能ITR序列对AAV病毒粒子的拯救、复制和包装是必需的。因此，AAV载体包含至少在病毒复制和包装中所需的那些顺式(in cis)序列(例如，功能ITR)。只要ITR序列提供功能拯救、复制和包装，其不必是野生的核苷酸序列，而且可以通过核苷酸的插入，缺失和置换改变。
用已知技术构建AAV表达载体，其至少提供了在指导转录时可操作地连接的组分，控制元件包括转录起始区、目的DNA和转录终止区。选择在哺乳动物细胞中起作用的控制元件。由此产生的含有可操作地连接组分的构建体与功能AAV ITR序列连接(5’和3’)。可以用本领域熟知技术设计适合的AAV构建体。参见，例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO 92/01070(1992年1月23日公开)和WO93/03769(1993年3月4日公开)；Lebkowski等(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等(1990)Vaccines 90(Cold SpringHarbor Laboratory出版社)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion inBiotechnology3533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics inMicrobiol.and Immunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)Human GeneTherapy5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy1165-169；和Zhou等(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
常规药物制剂可以用本领域技术人员易得的所有标准制药剂型化学和方法学完成包含本发明多核苷酸分子，有或无抗原组合物添加的制剂剂型。例如，含有一个或多个适合载体的组合物可以与一个或多个药学上可接受的赋形剂或载体联合以提供液体制剂。
可以在赋形剂或载体中存在辅助物质，如湿润或乳化剂、pH缓冲物质等等。这些赋形剂、载体和辅助物质是普通的药学试剂，其本身在接受组合物的个体中不会诱导免疫应答，并且可以予以施用，而无过度的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，如水、盐水、聚乙烯二醇、透明质酸、甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可以包含在其中，例如矿酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；和有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。尽管不是必需，但也优选制剂含有起稳定剂作用的，特别是对如果将要包含在疫苗组合物中的肽、蛋白质或其它类似抗原分子起稳定剂作用的药学上可接受的赋形剂。作为适合载体对肽也起稳定剂作用的例子非限制性包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等的药学梯度。其它适合载体再一次非限制性包括淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量的聚乙二醇(PEGs)，及其联合。在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)可得到药学可接受赋形剂、载体和辅助物质的详细讨论，本文并入其为参考文献。
组合物中也可以包含一些核酸摄取和/或表达的促进因子(“转染促进剂”)，例如，促进因子如丁呱卡因(bupivacaine)、心脏毒素和蔗糖，和转染促进载体如常规用于递送核酸分子的脂质体或脂质制剂。阴离子和中性脂质体是广泛可得到的，用于递送核酸分子是熟知的(参见，例如LiposomesA Practical Approach，(1990)RPC New Ed.，IRL Press)。阳离子脂质制剂也是熟知的用于核酸分子递送的载体。适合的脂质制剂包括可购得的商品名为LipofectinTM的DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲铵)，和DOTAP(1，2-二油酰氧-3-(三甲铵)丙烷)，参见，例如Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413-7416；Malone等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866077-6081；美国专利号5,283,185和5,527,928，和国际公布号WO 90/11092，WO 91/15501和WO 95/26356。这些阳离子脂质可以优选与中性脂质，例如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)联合使用。可以添加到上述脂质或脂质体中的进一步的转染促进组合物包括精胺衍生物(参见，例如国际公布号WO 93/18759)和细胞膜通透化合物如GALA、短杆菌肽S和阳离子胆汁盐(参见，例如国际公布号WO 93/19768)。
作为替代方案，本发明核酸分子可被包被、吸附或连接粒子载体。适合的粒子载体包括来源于聚甲基甲基丙烯酸酯多聚体的粒子载体，和来源于聚丙交酯和聚(丙交酯-co-聚乙交酯)的PLG微粒，参见，例如Jeffery等(1993)Pharm.Res.10362-368。也可以利用其它的粒子系统和多聚体，例如，多聚体如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺及这些分子的共轭物。
因此，所形成的组合物通常将包含一个或多个多核苷酸分子(例如，质粒载体)，该多核苷酸分子含有选定ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列，其量足以辅助抗共施用抗原的免疫学反应。本领域技术人员容易确定适合的有效量。该量将在通过常规试验测定的相对宽范围内。例如，用0.1μg这样少量的DNA可以获得适合的佐剂效果，而在其它施用中，可以使用达0.2mg的DNA。通常期望含有目的ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列的多核苷酸的有效剂量范围将在约1μg到1000μg内，但是，发现这个剂量以上和以下也是有效的。因此，组合物可以包含从约0.1％到约99.9％的多核苷酸分子。
常规药物制剂的施用可以通过在整个疗程中连续或间断的一个剂量完成上述药物制剂的施用，即，一旦适合地制备了本发明的组合物，可以用各种已知的途径和技术给个体体内施用它。例如，液体制剂可以作为可注射的溶液、悬浮液或乳液提供，用常规注射针和注射器，通过不经肠道的、皮下、皮内、肌肉内、静脉内注射，或液体喷射注射系统施用。也可以给皮肤或粘膜组织局部施用液体制剂，或提供为适于呼吸器官或肺施用的极细分割的喷雾。其它施用方式包括口服施用、栓剂和主动或被动经皮递送技术。
作为替代方案，可以离体施用组合物，例如转化细胞递送和重新植入受体是已知的(例如，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔和直接微注射入核)。然而，通过常规注射针和注射器用于含有粒子组合物的液体组合物和液体悬浮液的递送是最经常的递送。测定最有效施用方法和剂量的方法是本领域技术人员已知的，而且将随着递送载体、治疗组合物、靶细胞和被治疗的个体而变化。由主治医师选的剂量水平和方式可以进行单一或多次施用。应该理解单多核苷酸载体构建体可以带有一个以上亚基编码区和/或抗原编码区。可选的方案，如本文所述，也可以递送给个体表达来源于任何病原体的一个或多个毒素亚基肽和/或抗原的每个单独载体(例如，病毒载体、质粒或其任何联合)。
而且，也希望本发明方法递送的多核苷酸可以与其它适合的组合物和治疗联合。例如，为了进一步增强个体的免疫应答，本文所述的组合物和方法可以与辅助物质(例如，其它佐剂)，如药理学因子、细胞因子或类似物的递送联合。可以在本文所述多核苷酸分子施用同时，前或后施用辅助物质，例如蛋白质或其它大分子。用本领域技术人员已知的方法，核酸分子组合物也可以给个体直接施用，或可选方法，离体递送给来自个体的细胞。
包被的粒子在一个实施方式中，用载体粒子递送含有选定ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列的多核苷酸构建体，和其它辅助成分(如一个或多个抗原编码序列)。用于施用该核酸制剂的粒子介导的递送方法是本领域已知的。因此，一旦制备和适合地纯化出上述质粒载体构建体，其就可以用各种已知技术包被到载体粒子(例如，核心载体)上。载体粒子选自在粒子大小范围内有适合密度的材料，该粒子大小通常用来自于适合的粒子递送装置的细胞内递送。当然，最佳载体粒子大小将取决于靶细胞的直径。
对于本发明的目的，可以用钨、金、铂和铱核心载体粒子。优选钨和金粒子。容易得到平均直径大小为0.5到2.0μm的钨粒子。尽管该粒子对粒子递送方法有用的最佳密度，而且允许DNA高效包被，但是钨对一些细胞型有潜在的毒性。因此，也将发现金粒子和微晶体金(例如，金粉A1570，可购自Engelhard Corp.，East Newark，NJ)在本发明中的应用。金粒子具有一致的大小(1-3μm大小的粒子可购自Alpha Chemicals或包括0.95μm大小的粒子可购自Degussa，South Plainfield，NJ)和减少的毒性。
用于在金或钨粒子上包被或沉淀DNA或RNA的许多方法是已知的，而且已描述了这些方法。大多数这样的方法通常混合预先测定量的金或钨与质粒DNA、CaCl2和亚精胺。在包被过程期间持续涡旋由此得到的溶液以确保反应混合物的均匀性。核酸沉淀后，包被的粒子可以转移到适合的膜上，使用前允许干燥，包被在样品组件或盒子表面，或装载到递送盒子中以用于适合粒子递送装置。
肽抗原也可以包被在相同或相似的核心载体粒子上。例如，通过以经验确定比率简单混合两组分，通过本领域技术人员熟悉的硫酸铵沉淀或其它溶剂沉淀方法，或通过肽与载体粒子的化学偶合，肽可以与载体粒子连接。以前描述过L-半胱氨酸残基与金的偶合(Brown等，ChemicalSociety Reviews9271-311(1980))。其它的方法将包括，例如，在纯乙醇、水、或醇/水混合物中溶解肽，该溶液加到一定量的载体粒子中，然后在空气或氮气流中干燥混合物，同时涡旋。可替代的方案，通过真空离心，抗原可以干燥于载体粒子上。一旦包被的粒子被干燥，其就可以在适合的溶剂(例如乙酸乙酯或丙酮)中重悬浮、粉碎(例如，通过超声)以提供基本均匀的悬浮液。然后用抗原包被的核心载体粒子可以与带有ADP-核糖基化外毒素亚基肽构建体的核心载体粒子结合，并且在单粒子注射步骤中施用，或与毒素亚基组合物分开施用。
包被粒子的施用在包被的核心载体粒子形成后，用粒子介导递送技术，递送给个体单独或与，如抗原制剂联合的本发明核酸制剂包被的核心载体粒子。
适合于粒子介导递送技术的各种粒子递送装置是本领域已知的，而且它们都适于用在本发明的实践中。目前的装置设计利用爆发的、电或气发射以驱使包被的核心载体粒子朝向靶细胞。包被的粒子本身可释放地与可移动的载片连接，或可移去地与气流通过的表面连接，从表面抬高粒子，朝向靶细胞加速它们。在美国专利号5,204,253中描述了气发射装置的例子。在美国专利号4,945,050中描述了爆发型装置。在美国专利号5,120,657中描述了电发射型粒子加速装置的一个例子。在美国专利号5,149,655中描述了适于本文的另一个电发射装置。本文，整体并入所有这些专利的公开为参考文献。
以与剂量剂型一致的方式及将有效引起期望佐剂效果/免疫应答的量给待治疗个体施用包被的粒子。所递送组合物的量，在核酸分子的情况下，通常是每剂量0.001到1000μg，更通常是0.01到10.0μg的核酸分子，而且在在肽或蛋白质分子的情况下是1μg到5μg，更通常是1到50μg肽，取决于待治疗个体。根据免疫个体的年龄和总体情况，选择的特定核苷酸序列或肽，及其它因素，必需的精确的量将变化。依据阅读本发明的说明书，本领域技术人员可以容易地确定适合的有效量。
粒子组合物作为替代方案，带有选定ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列的多核苷酸，和一个或多个选定抗原部分可以形成粒子组合物。更具体地，可以用本领域技术人员容易获得的所有标准制药剂型化学和方法学制备包含一个或多个多核苷酸分子的粒子制剂。例如，一个或多个载体构建体和/或抗原成分可以与一个或多个药学可接受赋形剂或载体混合以提供疫苗组合物。辅助物质，如湿润或乳化剂、pH缓冲物质等可以在赋形剂或载体中存在。这些赋形剂、载体和辅助物质是普通的药学试剂，其本身在接受组合物的个体中不会诱导免疫应答，并且可以予以施用，而无过度的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，如水、盐水、聚乙烯二醇、透明质酸、甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可以包含在其中，例如矿酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；和有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。尽管不是必需，但也优选核酸组合物含有起稳定剂作用的，特别是对肽、蛋白质或其它类似抗原或辅助物质起稳定剂作用的药学上可接受的载体。适合载体对肽也起稳定剂作用的例子非限制性包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等的药学梯度。其它适合载体再一次非限制性包括淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量的聚乙二醇(PEGs)、及其联合。在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)可得到药学可接受赋形剂、载体和其它辅助物质的详细讨论，本文并入其为参考文献。
所形成的组合物将包含编码毒素亚基肽的多核苷酸，其含量足以提供抗共施用抗原的期望佐剂效果，如上所述。本领域技术人员可以容易测定适合有效的含量。该含量将在相对宽的范围内，通常在约0.001μg到25mg或更多的目的核酸构建体范围内，而且可以通过常规试验测定特定合适的含量。组合物可以含有约0.1％到约99.9％的核酸分子。如果组合物中包含抗原成分，或方法用于提供粒子抗原组合物，那么抗原如上所述抗原将以适合的含量存在。然后用标准技术，如通过简单蒸发(空气干燥)、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥(冻干法)、喷雾-冷冻干燥、喷雾包被、沉淀、超临界液体粒子形成等制备组合物成为粒子。如果期望，得到的粒子可以用在共有国际公布号WO 97/48485中所述技术浓缩。
单独的单位剂量或多剂量容器，其中在使用前可以包装粒子，可以包括装有适合量粒子的密封容器，所述粒子含有适合核酸构建体和/或选定抗原(例如，提供多成分疫苗组合物)。粒子组合物可以作为无菌制剂包装，因此可以设计密封容器以保持制剂在本发明方法中使用前是无菌的。如果期望，可以改造容器以适于在粒子递送装置中直接应用。这样的容器可以为胶囊、箔袋、小袋、盒子等形式。本文描述了适合的粒子递送装置(例如，无针注射器)。
进一步，可以标记装有粒子的容器以识别组合物和提供相关的剂量信息。此外，可以用政府机构，例如食品和药品管理机构规定形式的公示标记容器，其中公示表明联邦法律机构许可包含在其中的人用佐剂、抗原(或疫苗组合物)的制造、使用或销售。
然后可以用经皮递送技术施用粒子组合物。优选地，通过粉末注射方法，例如，通过如在共有国际公布号WO 94/24263，WO 96/04947，WO96/12513，和WO 96/20022所述无针注射器系统递送粒子组合物，在本文并入所有这些文献为参考文献。通常使用具有近似大小的粒子，通常范围是0.1到250μm，优选范围是约10-70μm的粒子进行该无针注射器系统的粒子递送。也可以从粒子递送装置递送大于约250μm的粒子，作为粒子大小的上限点将引起皮肤细胞的不适当的损坏。递送粒子穿透靶表面的实际距离取决于粒子大小(例如，假设接近球形粒子几何学的标称粒子直径)、粒子密度、粒子撞击表面的起始速率、和靶细胞组织的密度和运动学的粘性。在这方面，用于无针注射的最佳粒子密度通常范围在约0.1到25g/cm3之间，优选在约0.9到1.5g/cm3之间，注射速率通常在约100和3,000m/sec之间的范围，或更大。用合适的气压，可以通过喷嘴以接近驱动气体流动超声速度的速率加速有10-70μm平均直径的粒子。
通过上述粒子递送装置，可以递送含有本文所述粉末分子治疗有效量的组合物给任何适合的靶组织。例如，可以递送组合物给肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾脏、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨骼软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼睛、腺和结缔组织。对于核酸分子，优选递送给分子表达的末端分化细胞；然而，也可以递送分子给非分化或部分分化的细胞，如血液干细胞和皮肤成纤维细胞。
如果期望，可以提供预先加载状况的这些无针注射器系统，其含有适合剂量的粒子，该粒子含有目的ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列。可以在密封的容器中包装加载的注射器，可以如上所述进一步标记。
因此，本方法可以用于获得大小范围为约10μm到250μm，优选约10μm到约150μm，最优选约20μm到60μm的核酸粒子；而且粒子密度范围约从0.1到约25g/cm3，约0.5g/cm3到约3.0g/cm3或更大的体积密度。
类似地，可以获得大小范围为约0.1μm到250μm，优选约0.1μm到约150μm，最优选约20μm到60μm；粒子密度范围约从0.1g/cm3到约25g/cm3，优选约0.5到约3.0g/cm3，最优选约0.8g/cm3到约1.5g/cm3体积密度的选定抗原粒子。
增强免疫应答在本发明另一个实施方式中，提供了用于增强抗目的共施用抗原免疫应答的方法。本质上，该方法需要(a)给个体施用目的抗原，(b)提供本发明佐剂组合物，其中所述组合物包含一个或多个含有选定ADP-核糖基化外毒素亚基肽编码序列的核酸分子，和(c)给个体共施用佐剂组合物，因此毒素亚基肽从它们各自编码序列表达，其量足以诱导增强的抗共施用抗原免疫应答。如上文所详述，编码序列可操作地与相同或不同调节序列连接以提供一个或多个表达盒子。然后在适合载体，例如质粒载体构建体或病毒载体中提供这些表达盒子。
在一方面，该方法需要用本领域已知的标准基因递送技术给个体施用多核苷酸组合物。参见，例如美国专利号5,399,346，5,580,859，5,589,466。通常，多核苷酸疫苗组合物与药学可接受赋形剂或载体混合以提供液体制剂(如上文所述)，然后作为可注射溶液、悬浮液或乳剂用于利用常规注射针和注射器，或液体喷射注射系统通过不经肠道的、皮下、皮内、肌肉内、静脉内注射施用。优选给个体的皮肤或粘膜组织施用组合物，也可以给皮肤或粘膜组织局部施用液体制剂，或提供为适于呼吸器官或肺施用的极细分割的喷雾。其它施用方式包括口服施用、栓剂和主动或被动经皮递送技术。作为替代方案，多核苷酸组合物可以离体递送给来自个体的细胞，随后细胞重新植入个体。一旦引入个体，就表达核酸序列以在原位提供ADP-核糖基化外毒素亚基肽，其量足以增强接种个体抗共施用抗原的免疫应答。这个增强的免疫应答以提高的体液(抗体)应答，提高的细胞(CTL)应答为特征，或以提高的抗共施用抗原的体液和细胞应答为特征。
在一些优选实施方式中，增强的免疫应答是以增加的抗共施用抗原的Th1样(细胞的)免疫应答，而不是Th2样应答为特征。在这方面，可以通过下面的一个或多个证明增加的Th1样免疫应答是符合要求的增加的产生干扰素γ的CD4+辅助细胞T淋巴细胞和/或CD8+CTLs效价；增加的抗原特异性CTL活性；增加的通常与细胞免疫有关(例如，IgG2a)亚类抗原特异性抗体效价。
优选以粒子形式递送本发明多核苷酸佐剂组合物。例如，用上文详细描述的粒子递送装置可以施用组合物。在一些实施方式中，用本领域已知的各种技术可以在核心载体粒子上包被多核苷酸组合物并利用粒子介导方法递送。载体粒子选自在粒子大小范围内适合密度的材料，该粒子大小通常用来自于粒子递送装置的细胞内递送。当然，最佳载体粒子大小将取决于靶细胞的直径。
可选地，通过给个体共施用额外或辅助成分，可以修改这些方法。例如可以施用次级疫苗组合物，其中次级组合物可以包含核酸疫苗，或次级疫苗组合物可以包含常规疫苗，如整体病毒、分裂病毒或亚基疫苗。次级疫苗组合物可以与多核苷酸ADP-核糖基外毒素亚基肽组合物混合以形成单独组合物，或次级疫苗组合物可以或共同、顺序地给相同或不同位点单独施用，或通过一段明显的时间分开次级疫苗组合物，如施用最初组合物后一些天的加强步骤中施用。
如上述，可以用常规注射器或用粒子介导递送系统，通过注射施用次级疫苗组合物和/或其它辅助成分，也是如上所述。通常是皮下、表皮、皮内、粘膜内(例如，鼻、直肠和/或阴道)、腹膜内、静脉内、口或肌肉内施用。其它施用方式包括局部、口和肺施用、栓剂和经皮应用。剂量治疗可以是单剂量程序表或多剂量程序表。
实施例下面是实施本方面特定实施方式的实施例。提供实施例仅是为了示例目的，并不意味着以任何方式限定本发明的范围。
尽管已努力确保所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但是一些实验误差和偏差当然应该是允许的。
实施例1编码CT的A和B亚基表达载体的研究用霍乱弧菌基因组DNA作为聚合酶链式反应(PCR)模板以产生含有霍乱毒素(CT)A和B亚基编码序列的DNA片段。为了产生A亚基编码片段(CTA)的PCR，用下面两个寡脱氧核糖核苷酸引物引物15’-GGA GCT AGC AAT GAT GAT AAG TTA TAT CGG-3’(SEQID NO7)；和引物25’-CCT GGA TCC TCA TAA TTC ATC CTT AAT TCT-3’(SEQID NO8)。
为了有利于插入表达载体，引物1和2的5’-末端含有附加序列(CTA编码序列同源区以外)，该序列分别包含NheI和BamHI的识别位点。设计引物1和2以引起起始于核苷酸位置164，终止于核苷酸位置886的A亚基编码序列PCR片段(GenBank登记号#D30053)的产生。这个区域包含成熟亚基A肽完整编码序列，但不包含在前体亚基A肽氨基末端发现的编码细菌信号肽的序列。
为了产生B亚基编码片段(CTB)的PCR，用下面两个寡脱氧核糖核苷酸引物引物35’-GGA GCT AGC ACA CCT CAA AAT ATT ACT GAT-3’(SEQID NO9)；和引物45’-CCT GGA TCC TTA ATT TGC CAT ACT AAT TGC-3’(SEQID NO10)。
为了有利于插入表达载体，引物3和4的5’-末端含有附加序列(CTB编码序列同源区域以外)，该序列分别包含NheI和BamHI的识别位点。设计引物3和4以引起起始于核苷酸位置946，终止于核苷酸位置1257的B亚基编码序列PCR片段(GenBank登记号#D30053)的产生。这个区域包含成熟亚基B肽完整编码序列，但不包含在前体亚基B肽氨基末端发现的编码细菌信号肽的序列。
除了上述两个PCR反应外，进行第三个PCR反应以产生修饰形式的CT亚基A编码序列，其中除去了其C-末端四个氨基酸KDEL基序。这个反应包括应用引物1(SEQ ID NO7)和下面引物引物55’-CCT GGA TCC TCA AAT TCT ATT ATG TGT ATC-3’(SEQID NO11)。
用Pfu Turbo DNA聚合酶(购自Strategene，La Jolla，CA)和生产商提供的PCR反应缓冲液进行所有PCR反应。PCR条件如下95℃，2分钟；30个循环(95℃，1分钟；55℃，2分钟15秒；72℃，1分钟。)，72℃，5分钟，和4℃放置。
PCR反应完成后，用NheI和BamHI酶消化新合成片段以产生粘性末端，在NheI和BamHI切割的pWRG7054表达载体中插入每个片段，产生下面的克隆pPJV2002、pPJV2003和pPJV2006，它们分别编码CTA、CTB和修饰的CTA(减去KDEL)。亲本克隆载体pWRG7054含有人巨细胞病毒立即早期启动子和相关内含子A序列。此外，在pWRG7054中包含人组织血纤蛋白溶酶原激活物信号肽的编码序列以允许从哺乳动物细胞分泌任何蛋白质，其编码序列插入适合可读框的NheI位点。(参见，例如，Chapman等(1991)Nuc.Acids Res.193979-3986，和Burke等(1986)J.Biol.Chem.26112574-12578)。
在图1，2，和3中分别描述了质粒pPJV2002、pPJV2003和pPJV2006的限制图谱和全序列。
实施例2编码大肠杆菌热不稳定肠毒素A和B亚基表达载体的研究用大肠杆菌株系EO78H11(美国典型培养物保藏中心，ATCC，#35401)基因组DNA作为聚合酶链式反应(PCR)的模板以产生含有热不稳定肠毒素(LT)A和B亚基编码序列的DNA片段。为了产生A亚基编码片段的PCR，用下面两个寡脱氧核糖核苷酸引物引物65’-GGA GCT AGC AAT GGC GAC AAA TTA TAC CGT-3’(SEQID NO12)；和引物75’-CCT GGA TCC TCA TAA TTC ATC CCG AAT TCT-3’(SEQID NO13)。
为了有利于插入表达载体，引物6和7的5’-末端含有额外序列(LTA编码序列同源区域以外)，该序列分别包含NheI和BamHI的识别位点。设计引物6和7以引起起始于核苷酸位置145，终止于核苷酸位置867的A亚基编码序列PCR片段(GenBank登记号#AB011677)的产生。这个区域包含成熟亚基A肽完整编码序列，但不包含在前体亚基A肽氨基末端发现的编码细菌信号肽的序列。
为了产生B亚基编码片段(CTB)的PCR，用下面两个寡脱氧核糖核苷酸引物引物85’-GGA GCT AGC GCT CCC CAG TCT ATT ACA GAA-3’(SEQID NO14)；和引物95’-CCT GGA TCC CTA GTT TTC CAT ACT GAT TGC-3’(SEQID NO15)。
为了有利于插入表达载体，引物8和9的5’-末端含有额外序列(LTB编码序列同源区域以外)，该序列分别包含NheI和BamHI的识别位点。设计引物8和9以引起起始于核苷酸位置927，终止于核苷酸位置1238的B亚基编码序列PCR片段的产生，在GenBank数据库发现这个片段(登记号#AB011677)。这个区域包含成熟亚基B肽完整编码序列，但不包含在前体亚基B肽氨基末端发现的编码细菌信号肽的序列。
除了上述两个PCR反应外，进行第三个PCR反应以产生修饰形式的LT亚基A编码序列，其中除去了其C-末端四个氨基酸RDEL基序。这个反应包括应用引物6(SEQ ID NO12)和下面引物
引物105’-CCT GGA TCC TCA AAT TCT GTT ATA TAT GTC-3’(SEQID NO16)。
用Pfu Turbo DNA聚合酶(购自Strategene，La Jolla，CA)和生产商提供的PCR反应缓冲液进行所有PCR反应。PCR条件如下95℃，2分钟；30个循环(95℃，1分钟；55℃，2分钟15秒；72℃，1分钟。)，72℃，5分钟，和4℃放置。
PCR反应完成后，用NheI和BamHI酶消化新合成片段以产生粘性末端，在NheI和BamHI切割的pWRG7054表达载体中插入每个片段，产生克隆pPJV2004，pPJV2005和pPJV2007，它们分别编码LTA、LTB和修饰的LTA(减去RDEL)。
在图4、5和6中分别显示了质粒pPJV2004、pPJV2005和pPJV2007的限制图谱和全序列。
实施例3对利用编码CTA和/或CTB质粒载体DNA疫苗的抗原特异性抗体应答的增加利用编码甲型流感病毒M2蛋白质的DNA疫苗载体检测pPJV2002，pPJV2003和pPJV2006佐剂载体在上下文粒子介导的DNA接种中的佐剂效果。通过在显微可见金粒子上沉淀有/无各种pPJV2002、pPJV2003和pPJV2006佐剂载体混合的M2 DNA疫苗载体，用PowderJectXR-1粒子递送装置(PowderJect Vaccines，Inc.Madison，WI)加速包被的金粒子进入小鼠表皮，进行粒子介导的DNA接种。
更具体地，用流感病毒株系A/Kagoshima/10/95(H3N2)的RNA片段#7(其编码M2蛋白质)作为设计PCR引物的模型以有利于A/Sydney/5/97(H3N2)成熟M2编码序列的克隆。因为A/Sydney的RNA片段#7序列还没有确定，所以用A/Kagoshima序列设计引物。预测M2序列中高度保守以有利于应用从不同病毒株系设计的引物。
因为M2是从剪接RNA翻译的，所以认为剪除了片段7 RNA编码区的核苷酸位置27到714是必要的。因此，产生和设计一套PCR引物以产生完整M2编码序列，但是确保从由此得到的M2编码序列克隆中完全除去内含子序列。用于产生全长M2编码序列克隆的PCR引物如下引物115’-CCC AAG CTT CCA CCA TGA GCC TTC TAA CCG AGG TCGAAA CAC CTA TCA GAA ACG AAT GGG AGT GC-3’(SEQ ID NO17)；和引物125’-CCC GGA TCC TTA CTC CAG CTC TAT GCT G-3’(SEQID NO18)。
引物11(SEQ ID NO17)5’-末端含有附加序列，其包含HindIII的识别位点和有助于mRNA翻译起始的Kozak共有序列。引物12(SEQ IDNO18)5’-末端也含有附加序列，其包含BamHI的识别位点。
从在含胚鸡蛋中生长的A/Sydney/5/97(H3N2)样品分离病毒RNA。所用的病毒RNA分离方法标准技术是本领域技术人员已知的。用从Stratagene(La Jolla，CA)得到的RT-PCR试剂盒，在反转录酶/聚合酶链式反应(RT-PCR)中使用该病毒的RNA。通过加5.9μl无RNA酶的水到反应试管中完成RT反应的步骤。向试管加入试剂盒中的1.0μl 10XMMLV-RT缓冲液和1.0μl dNTP混合物。还加入1μl A/Sydney/5/97 RNA和0.6μl(0.6μg)引物11(SEQ ID NO17)。加热反应到65℃，5分钟以变性RNA，随后加入0.5μl试剂盒中的反转录酶。在37℃，温育反应15分钟以完成反转录步骤。
通过向新反应试管中添加下面成分完成PCR反应步骤40μl水；试剂盒中的5μl 10X超级(ultra)HF缓冲液；试剂盒中的1.0μl dNTP混合物；1.0μl引物11(SEQ ID NO17)(1.0μg)；1.0μl引物12(SEQID NO18)(1.0μg)；1μl上述反转录酶反应混合物；和试剂盒中的1μlTurbo PFU聚合酶。用下面的温育方案进行PCR反应95℃，1分钟；接着30个循环(95℃，30秒；46℃，30秒；68℃，3分钟)，随后68℃，10分钟。在2％琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，显示了约300bp预期大小的单DNA带。
从凝胶上分离约300bp带，用HindIII和BamHI消化以产生必需的粘性末端用于插入pWRG7077疫苗表达载体(Schmaljohn等(1997)J.Virol.719563-9569)。用HindIII部分消化，用BamHI进行完全消化pWRG7077 DNA以利于M2编码插入的插入。要求载体部分HindIII消化是因为在该质粒卡那霉素抗性标记中存在第二个HindIII位点。由此得到的M2 DNA疫苗载体称为为pM2-FL。pM2-FL载体含有人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期启动子及其相关的内含子A序列以驱动M2编码序列的转录。该载体也包含牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。
然后在2微米金粒子上沉淀pM2-FL质粒为单一载体，或加佐剂载体样品成为混合载体(即，M2质粒载与pPJV2002、pPJV2003，和/或pPJV2006佐剂载体混合)。具体地，在含有400μl 50mM亚精胺小离心管中，质粒DNA(单一M2载体或添加有一个或多个佐剂载体的M2载体)与2微米金粒子(Degussa，Lot 65-0)混合。DNA和金的比率在2.5微克DNA/每毫克金到4.0微克DNA/每毫克金之间变化，而且一批含有26mg金。当旋转混合器上的离心管不断搅拌期间，通过加1/10体积10％CaCl2，DNA在金粒子上沉淀。用纯乙醇洗DNA-金复合物3次，然后将其注射到管式旋转器包被机器(tube turner coating machine)(PowderJect Vaccines，Inc.，Madison WI)的TEFZEL管(McMaster-Carr)中，其用金/DNA复合物包被管内部。美国专利号5,733,600描述了这种管式旋转器机器(tubeturner machine)。也参见PCT专利申请号PCT/US95/00780和美国专利号5,780,100；5,865,796和5,584,807。完成包被过程后，将离心管切成适于装载到粒子递送装置的0.5英寸“筒”。
产生下面DNA-金制剂用于小鼠DNA疫苗佐剂试验。
制剂#1单独的pM2-FL DNA载体，2.5微克DNA/每毫克金，0.5毫克金/每筒；制剂#2在一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金)上沉淀的pM2-FL DNA载体，在第二批金(1.75微克每种DNA佐剂载体/每毫克金)上其沉淀的pPJV2002和pPJV2003 DNA载体，相等地混合两批金，0.5毫克金/每筒；制剂#3在一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金，pPJV2002和pPJV2003各1微克/每毫克金)上共沉淀所有pM2-FL DNA载体、pPJV2002和pPJV2003 DNA载体，0.5毫克金/每筒；
制剂#4在单独一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金，pPJV2006和pPJV2003各1微克/每毫克金)上共沉淀所有pM2-FL DNA载体、pPJV2006和pPJV2003 DNA载体，0.5毫克金/每筒；制剂#5在单独一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金，pPJV2002 DNA各1微克/每毫克金)上共沉淀pM2-FL DNA载体和pPJV2002，0.5毫克金/每筒；和制剂#6在单独一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金，pPJV2003 DNA\1微克/每毫克金)上共沉淀pM2-FL DNA载体和pPJV2003，0.5毫克金/每筒。
然后，给如下6组鼠施用这些DNA疫苗。每个实验组包含7只动物，每只动物接受单独制剂的两次免疫，两次免疫间有4周休息期。每次免疫由给腹部表皮一前一后两次递送组成(每次递送一个筒)。用PowderJectXR-1粒子递送装置(PowderJect Vaccines Inc.，Madi son，WI)，在400p.s.i.氦压力，。初次免疫后4周(刚好在加强免疫前)和二次或加强免疫后2周收集血清样品。
用ELISA测定法测定每个血清样品的M2特异性抗体应答，其中用由下面序列组成的M2合成肽预先包被96孔板SLLTEVETPIRNEWECR(SEQ IDNO19)。用M2肽包被ELISA板，4℃过夜，在磷酸盐缓冲液(PBS)中肽浓度1μg/ml。第二天，用5％PBS中脱脂奶粉，室温封闭板1小时。然后用冲洗缓冲液(10mMTris缓冲盐溶液，0.1％Brij-35)洗板三次。然后向孔中加稀释的血清样品，在室温下，温育板2小时。然后用冲洗缓冲液洗板三次。加入100μl的第二抗体，室温下，温育板1小时。第二抗体由羊抗-鼠IgG(H+L)生物素标记的抗体(Southern Biotechnology)组成，其在1％BSA/PBS/0.1％Tween-20中以1∶8000比率稀释。然后洗板三次，加入在PBS/0.1％Tween-20中以1∶8000稀释的链霉抗生物素蛋白素-辣根过氧化物酶共轭物(Southern Biotechnology)，室温下，温育板1小时。另外洗3次后，加入100μl TMB底物(Bio Rad，Hercules，CA)，室温下，进行显色30分钟。通过加入1N H2SO4终止显色，在450nm读板。通过鉴定血清最高稀释度检测终点稀释效价，该最高稀释度仍旧产生吸光度值，其是用非免疫对照样品获得的背景吸光度值的两倍。
在下表1中所示是每组中个体动物的终点抗体效价和每个实验组的几何平均效价。
表1


*(已死亡)如所观察，与仅用M2载体(制剂#1)免疫的对照动物比较，用含有一个或多个CT编码佐剂载体(制剂#2-6)免疫的所有实验组在加强免疫后都显示了增加的几何平均效价。
实施例4用编码CT-A和CT-B亚基肽佐剂质粒载体，对编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)DNA疫苗的抗原特异性细胞应答的增加如下构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)载体质粒。为了产生HbsAg编码序列，用NcoI切割pAM6构建体(得自美国典型培养物保藏中心“ATCC”得到)，用绿豆核酸酶处理以除去X-抗原起始密码子。然后用BamHI切割由此产生的DNA，用T4 DNA聚合酶处理成平末端DNA，产生HBsAg表达盒子。HBsAg表达盒子以1.2kB片段存在。用HindIII和BglII切割含有全长人CMV(Towne株系)立即早期启动子(带有增强子)的质粒构建体pPJV7077(Schmaljohn等(1997)J.Virol.719563-9569)，然后用T4 DNA聚合酶和小牛碱性磷酸酶处理以产生平端DNA，HBsAg表达盒子连接到质粒中产生pWRG7 128构建体。
在上面实施例3所述过程后，在金粒子上沉淀pWRG7128质粒，再一次用2微克DNA/每毫克金。混合表达CTA和CTB亚基基因(分别是pPJV2002和pPJV2003)的佐剂质粒载体在一起，在金粒子上沉淀，每个质粒以1微克DNA/每毫克金存在，这样总量也是2微克DNA/每毫克金。以1∶1混合用pWRG7128包被的金粒子和用pPJV2002及pPJV2003包被的金粒子，然后装载到如上提到的TEFZEL管中。对于免疫，用PowderJectXR-1粒子递送装置，用上述实施例3相同的递送条件递送表示1μg DNA(0.5μg pWRG7128质粒和pPJV2002及pPJV2003质粒各0.25μg)的0.5英寸长的管进入Balb/c小鼠表皮。对于对照，用仅由pWRG7128包被的金粒子(每次递送1微克DNA/0.5毫克金)免疫小鼠。在第4周，免疫和加强免疫小鼠(每个实验组4只)，然后，在后加强免疫2周时处死小鼠。通过ELISA的血清抗体水平评估免疫应答。此外，用ELISPOT测定法定量CD8-特异的IFN-γ分泌来检测细胞免疫应答。
用ELISA测定法检测每只鼠血清样品HBsAg特异的抗体。对于ELISA，用纯化HBsAg(BioDesign)，以每孔0.1μg，在PBS(磷酸缓冲盐，BioWhittaker)中包被Falcon Pro Bind微量滴定板，4℃过夜。室温下(RT)，用5％奶粉/PBS封闭板1小时，然后用冲洗缓冲液(10mM Tris缓冲盐溶液，0.1％Brij-35)，洗3次，向板中加入在稀释缓冲液(2％奶粉/PBS/0.05％Tween 20)中稀释的血清样品，在室温(RT)温育2小时。洗板3次，向板中加入在稀释缓冲液中以1∶8000稀释的生物素酰化的羊抗鼠抗体(Southern Biotechnology)，室温温育1小时。温育后，洗板3次，之后，加入PBS中1∶8000稀释的链霉抗生物素蛋白素-辣根过氧化物酶共轭物(Southern Biotechnology)，在室温下，进一步温育板1小时。另外洗3次后，洗板3次，然后加入TMB底物溶液(BioRad)，30分钟后，用1N H2SO4停止反应。在450nm读光密度，通过样品和已知效价的标准比较计算终点效价。
对于细胞免疫测定法，在与已知Balb/C小鼠中CD8抗原表位对应的肽存在情况下，体外培养免疫动物脾脏脾细胞的单细胞悬浮液。在DMSO(10mg/ml)中溶解肽，在培养中稀释到10ug/ml。肽序列是IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO20)。
对于IFN-γELISPOT测定法，用50μl的15μg/ml抗-IFN-γ抗血清(Pharmingen)在无菌0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中包被微孔多筛选膜过滤板，4℃过夜。用无菌PBS洗板6次，然后用含有10％胎牛血清(FBS)的组织培养基在室温下封闭1-2小时。除去培养基，按照每孔1×106细胞总数，向孔中分配脾脏细胞。对于少于1×106免疫动物细胞的孔，加入首次用于实验的(naive)动物细胞达到1×106总数。在上述肽存在情况下，细胞在组织培养的培养箱中温育过夜。然后用PBS洗板2次，用蒸馏水洗1次。随后用PBS洗3次。向板中(PBS中1μg/ml溶液50μl)加入生物素酰化的抗IFN-γ单克隆抗体(Pharmingen)，室温温育2小时。用PBS洗板6次，之后，加入50μl链霉抗生物素蛋白素碱性磷酸酶共轭物(PBS中1∶1000，Pharmingen)，室温，温育2小时。用PBS洗板6次，加入碱性磷酸酶显色底物(BioRad)，进行这个反应直到暗斑出现。通过用水洗3次终止反应。空气干燥板，在显微镜下计数斑。
对于IFN-γELISA测定法，在肽存在的情况下，在圆底96孔组织培养板中过夜培养细胞。取上清液的样品用于IFN-γ水平测定。用100μl0.5ug/ml抗小鼠IFN-γ抗体(Pharmingen)在碳酸氢盐缓冲液中，pH 9.6包被高结合的板(Costar)。用含有10％FBS的组织培养基，室温下封闭板1小时，然后用TBS冲洗缓冲液洗3次。在组织培养基中稀释获自培养细胞的上清液样品，加载到板上，室温温育2小时。用冲洗缓冲液洗板3次，向板中加第二抗体(PBS中0.5μg/ml生物素酰化的大鼠抗-小鼠INF-γ，Pharmingen)，室温温育1小时。洗板3次，加入链霉抗生物素蛋白素-辣根过氧化物酶共轭物(PBS中12000，SouthernBiotechnology)室温1小时。洗板3次，加入TMB底物溶液(BioRad)，用1N H2SO4终止反应。在450nm读光密度。
在下表2中报告了ELISA结果。
表2

如所观察到的，发现单独用pWRG7128免疫的对照小鼠的抗体水平比用pWRG7128和CT佐剂载体(pPJV2002和pPJV2003)免疫小鼠的抗体水平高。对照动物平均终点效价是55,000，而用佐剂制剂免疫动物的平均效价是23,000。然而，接受佐剂制剂的组实际接受了作为对照pWRG7128量的1/2，这解释了抗体效价降低的原因。
在两组小鼠中测定的细胞免疫应答表明了通过CT佐剂载体，细胞应答显著增强。更具体地，在下面表3中描述了CD8特异性IFN-γELISA测定法的结果。
表3

在该IFN-γELISA测定中，每孔的细胞数表示从平板每孔的免疫动物恢复的细胞数。每孔总细胞数是常数(例如，1×106)，而且用首次用于实验的动物细胞补充。数值是在450nm测定的OD读数。发现用CT佐剂制剂处理的小鼠细胞在ELISA中有较高OD值，表明这些细胞分泌较大量的IFN-γ以对抗原应答。在IFN-γELISA中，首次用于实验的小鼠没有产生可测量的OD值。
下表4描述了CD8特异性IFN-γELISPOT测定法的结果。
表4

在该IFN-γELISPOT测定中，数字是重复孔的平均值，与每1×106细胞的阳性细胞数对应。在该ELISPOT测定中，首次用于实验的小鼠细胞没有产生任何斑点。此外，在用CT佐剂制剂处理的动物中发现了较大量的ELISPOTs，表明比单独接受抗原(pWRG7128)的动物优越的应答。
上述数据表明本发明新的佐剂组合物具有增强对共施用抗原细胞免疫应答的有效能力，在这种情况下，从DNA疫苗表达HbsAg。
实施例5用gp120抗原载体和CTA/CTB佐剂载体同时递送，对HIV-1gp120抗原体液和细胞免疫应答的增加如下文构建编码HIV-1 gp120的质粒载体。用Bluescript(Stratagene，La Jolla，CA)质粒骨架、人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子(Fuller等(1994)Aids Res.Hum Retroviruses101433)和SV40病毒晚期聚腺苷酸化位点开始构建载体。HCMV启动子包含在619个碱基对(bp)AccII片段内，从立即早期转录起始位点向上游延伸522个碱基对，向下游延伸96个碱基对。SV40病毒晚期聚腺苷酸化序列包含在来自于pSV2dhfr(以前得自Bethesda Research Laboratories，catalogue#5369 SS)约800个碱基对的BamHI-BglII内。最初，构建编码HIV-1gp160，称为“pC-Env”的质粒。该质粒含有来自于LAV-1BRU(ATCC登记号53069，GenBank登记号K02013)的2565碱基对的KpnI-XhoI片段，其在编码成熟gp160氨基末端氨基酸位置#4的序列开始。紧邻下游放置env编码序列片段，并在框架中与疱疹单纯病毒糖蛋白D(gD)信号肽的160bp合成片段融合，没有成熟gD氨基末端氨基酸，如先前所述(Fuller等(1994)Aids Res.Hum Retroviruses101433)。
如下文，然后构建编码HIV-1 gp120，这里称为“pCIA-Env/T”的质粒。pCIA-Env/T质粒编码HIV-1 gp160截短的形式，除了在核苷酸位置8188的HindIII位点截短env编码序列外，其与pC-Env构建体相同。这就产生了截短gp160翻译产物，具有位于gp120/gp41加工位点下游128个氨基酸残基的截短点。
如下文，构建编码HIV-1 rev，这里称为“pC-rev”的第二个质粒载体。该载体含有LAV-1BRU原病毒(核苷酸位置678-1085、5821-6379和8188-8944)的三个不连续区，直接置于如上所述hCMV启动子和SV40病毒晚期聚腺苷酸化序列间。这三个不连续区分别含有主要5’剪接供体，rev基因的第一内含子，和rev基因的第二内含子。
称为“pWRG7054”的第三个质粒载体构建体在研究中用做空载体对照。pWRG7054构建体含有SIV nef编码区，hCMV立即早期启动子和内含子A区，TPA前导序列和牛生长激素聚腺苷酸化序列。在下文实施例6中描述了pWRG7054质粒的构建。
产生下面DNA-金制剂用于小鼠DNA疫苗佐剂试验。
制剂#1空载体对照(pWRG7054，无gp120插入)，2.5微克DNA/每毫克金，0.5毫克金/每筒；制剂#2在单独一批金(pWRG7054 DNA和pCIA-EnvT DNA各1.25微克/每毫克金，0.12微克pC-rev/每毫克金)上共沉淀所有空载体对照(pWRG7054)、gp120(pCIA-EnvT)DNA载体，和rev(pC-rev)DNA载体(允许HIV-1 gp120分子表达)，0.5毫克金/每筒；制剂#3在单独一批金(1.25微克pWRG7054/每毫克金、pPJV2002和pPJV2003 DNA各1微克/每毫克金)上共沉淀所有空载体对照(pWRG7054)、CTA(pPJV2002)和CTB(pPJV2003)DNA载体，0.5毫克金/每筒；
制剂#4在单独一批金(1.25微克pCIA-EnvT DNA/每毫克金、0.125微克pC-rev DNA/每毫克金、pPJV2002和pPJV2003 DNA各1微克/每毫克金)上共沉淀所有gp120(pCIA-EnvT)DNA载体、HIV-1 rev(pC-rev)DNA载体、CTA(pPJV2002)和CTB(pPJV2003)DNA载体，0.5毫克金/每筒；和制剂#5在单独一批金gp120(1.25微克pCIA-EnvT DNA/每毫克金、0.125微克pC-rev DNA/每毫克金，pPJV2006和pPJV2003 DNA各1微克/每毫克金)上共沉淀所有(pCIA-EnvT)DNA载体、HIV-1 rev(pC-rev)DNA载体、CTA-KDEL(pPJV2006)和CTB(pPJV2003)DNA载体，0.5毫克金/每筒。
在上文实施例3所述过程后，在金粒子上沉淀pWRG7054、pCIA-EnvT、pC-rev、pPJV2002、pPJV2003和pPJV2006质粒载体，也用2微克DNA/每毫克金。再一次用上文实施例3所述的过程，装载包被的金粒子到TEFZEL管中。对于免疫，用粒子递送装置，在上述实施例3所述相同的递送条件(400p.s.i.氦)下，用两个0.5英寸长的管递送总载重1.0mg的金进入5-6周龄雌性Balb/c小鼠表皮。
5个实验组(每种DNA疫苗制剂各是一个试验组)中每个实验组由4只动物组成，每个动物用它们各自制剂进行初次和加强免疫，时间在第0和5周。用PowderJectXR-1粒子递送装置(PowderJect Vaccines Inc.，Madi son，WI)，每次免疫由两次一前一后给腹部表皮的递送构成(每次递送一个筒)。
用ELISA测定法，在第5周和6.5周(分别是初次免疫后和加强免疫后)收集的样品检测对HIV gp120抗原的血清抗体应答。对于ELISA，在50μl-PBS中，用0.3μg/孔的重组HIV gp120(Intracel)包被Costar高结合EIA板，4℃过夜温育。洗板3次，室温下，用2％PBS中BSA封闭2小鼠。向包被板中加入系列血清稀释液，37℃温育1小时。板后，板与共轭结合羊抗-鼠IgG(H+L)(BioRad)的1∶1500稀释度的碱性磷酸酶温育，随后用对硝基苯磷酸(PNPP)显色，在405nm读OD值。
在图7中描述了ELISA结果，如所观察到的，接受佐剂载体(含有pPJV2002和pPJV2003载体的制剂#4，或含有pPJV2006和pPJV2003载体的制剂#5)与gp120载体联合的组与接受gp120载体，而无佐剂的组(制剂#2，pCIA-EnvT)比较，gp120特异性免疫应答约增加20倍。
收集加强免疫后血清样品后，处死动物，收集每只鼠的脾脏。通过碾碎脾脏分离脾细胞，将细胞通过70μm细胞过滤器，用ACK裂解缓冲液(BioWhittaker)裂解红血细胞。用RPMI-5％FCS洗脾细胞3次，在添加抗生素、丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI-10％FCS中重悬浮到1×107细胞/ml的浓度。
用原位ELISA测定脾细胞分泌的抗原特异IFN-γ的量。在50μl0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中，用10μg/ml抗-小鼠IFN-γ捕获单克隆抗体(mAb)(Pharmingen，San Diego，CA)包被Costar高结合板。4℃，温育过夜后，用PBS-0.05％Tween-20洗孔5次，用200μl完全R10培养基，室温封闭2小时。向每孔加入1×106脾细胞，在仅有培养基(阴性对照)，或有1μg/ml HIV gp120肽的培养基中刺激，该肽有下面的序列RIQRGPGRAFVITGK(SEQ ID NO21)。在5％CO2中，在37℃温育24小时后，用去离子(DI)水洗板2次以裂解细胞，然后用PBS-0.05％Tween 20洗3次，室温下与每孔50μl的1μg/ml生物素酰化抗-小鼠IFN-γ检测mAb(Pharmingen)温育1小时。然后洗板5次，与每孔50μl的1∶8000稀释度的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)溶液(Southern Biotechnology)温育1小时。再一次洗板5次，通过加TMB底物(BioRad，Hercules，CA)，室温进行30分钟完成比色计显色。通过加1N硫酸终止反应。用光学板读数器读取450nm的吸光度。
在图8中描述了该研究的结果。该图表示在接受上述制剂(制剂#1-5)的5个不同疫苗实验组中，抗原特异性IFN-γ生产的相对水平。重要地，接受gp120载体(pCIA-EnvT)与CT佐剂载体(即含有pPJV2002和pPJV2003载体的制剂#4，含有pPJV2006和pPJV2003载体的制剂#5)联合的两个免疫组显示了比接受gp120，而无佐剂的组(含有空载体对照和pCIA-EnvT的制剂#2)显著高的IFN-γ生产水平(分别是P＜0.000001和P＝0.0068)。这些数据证明在动物模型中该CT载体佐剂联合具有显著增加对HIV抗原的抗原特异性细胞免疫的能力。
除了IFN-γ生产水平增加外，如用ELISPOT方法所测定，分泌IFN-γ的HIV-gp120肽-特异性脾细胞也显著增加。用IFN-γ捕获抗体包被用于T辅助细胞IFN-γ原位ELISA的硝酸纤维素板(微孔)，如上所述，冲洗，封闭。以1×106细胞/孔的加载细胞数向预包被孔中加入脾细胞，在仅有培养基(阴性对照)或含有1μg/ml肽的培养基中刺激，该肽含有免疫优势HIV-gp120 CTL抗原表位，和具有下面的序列RGPGRAFVTI(SEQID NO22)。在5％CO2中，在37℃，温育板24小时，用去离子水洗2次，用PBS洗3次，在室温下，与每孔50μl的1μg/ml生物素酰化抗-小鼠IFN-γ检测mAb(Pharmingen)温育1小时。然后洗板5次，与每孔50μl的1∶1000稀释度的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(ALP)溶液(Mabtech)温育1小时。再一次洗板5次，通过添加ALP膜底物(BioRad，Hercules，CA)，直到斑点形成(室温，2-30分钟)完成比色计显色。通过用去离子水洗终止反应，空气干燥板，过夜。在40X显微镜下斑点。仅仅计数有模糊边界的大斑点计数为斑点形成细胞(SFC)。
在图9中描述了ELISPOT测定的结果，该图表示在5个不同疫苗实验组(分别接受制剂#1-5)中产生IFN-γ脾脏细胞的相对水平。重要地，接受gp120载体(pCIA-EnvT)与CT佐剂载体(即含有pPJV2002和pPJV2003载体的制剂#4，含有pPJV2006和pPJV2003载体的制剂#5)联合的两个免疫组显示了比接受gp120，而无佐剂的组(含有空载体对照和pCIA-EnvT的制剂#2)显著高的生产IFN-γ的细胞数(分别是P＜0.000001和P＝0.0032)。这些数据证明在动物模型中该CT佐剂联合具有显著增加对共施用HIV gp120抗原的抗原特异性细胞免疫的能力。此外，在这些研究中所观察到增加的IFN-γ生产表明CT佐剂载体与本发明联合应用在免疫动物中提供了强Th1样免疫应答。
实施例6
用编码HBcAg和HBsAg载体和CTA/CTB佐剂载体的同时递送，对乙型肝炎核心和表面抗原的抗体应答的增强如下文，构建含有乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)编码序列的载体质粒。从HBV克隆pAM6(ATCC登记号45020)得到HBsAg和HbsAg编码序列。为了产生HBsAg编码序列，用NcoI切割pAM6构建体，用绿豆核酸酶处理以除去X-抗原起始密码子。然后用BamHI切割由此产生的DNA，用T4 DNA聚合酶处理成平末端DNA，产生HBsAg表达盒子。HBsAg表达盒子以1.2kB片段存在。用HindIII和BglII切割含有全长人CMV(Towne株系)立即早期启动子(带有增强子)的质粒构建体pPJV7077(Schmaljohn等(1997)J.Virol.719563-9569)，然后用T4 DNA聚合酶和小牛碱性磷酸酶处理以产生平末端DNA，HBsAg表达盒子连接到质粒中产生pWRG7128构建体。
为了产生HBcAg编码序列，切割pAM6构建体产生HBcAg表达盒子，之后，通过位点定向诱变截短HBcAg序列以除去核心抗原粒子的C-末端精氨酸富集区(其缺失不影响粒子形成)。然后克隆截短的HBcAg序列到含有人延长因子启动子(“hELF”，Mizushima等(1990)Nucl.AcidsRes.185322)的质粒构建体中以提供HBcAg载体构建体。
分别从JW4303载体构建体(Harriet Robinson博士，University ofMassachusetts惠赠)获得包含(a)CMV启动子/增强子，内含子A-5’非翻译区，和人组织血纤蛋白溶酶原激活物(hTPA)信号肽(“CMV-IA-TPA”)；或(b)牛生长激素polyA序列(bGHpA)的表达盒子，并入插入到质粒骨架中。用NheI切割由此产生的构建体，用聚合酶补平，然后用BamHI切割以产生含有pUC19复制原点，氨苄青霉素抗性基因和bGHpA序列的载体片段。用SalI第二次切割质粒骨架，用聚合酶补平，用BamHI切割以释放含有CMV-IA-TPA载体片段的载体片段。连接两个载体片段以产生命名为pWRG7054的构建体。
用NheI切割pWRG7054构建体，用聚合酶补平，用BamHI切割以产生载体片段。用NcoI切割HBcAg载体构建体，用聚合酶补平，用BamHI切割以产生插入片段。然后连接两个片段以产生命名为pWRG7063的构建体。
用EcoRI切割PEL-Bos，用牛小肠磷酸酶去磷酸化以产生载体片段用HindIII切割pWRG7063质粒，用聚合酶补平，用EcoRI切割以产生包含hTPA信号肽、HBcAg抗原序列和bGHpA区的插入片段。连接两个片段以提供命名为pWRG7145的构建体。
用EcoRI切割pWRG7128构建体，用牛小肠磷酸酶去磷酸化以产生含有hCMV启动子转录控制的HbsAg编码区的载体片段。用MfeI和EcoRI切割pWRG7145构建体以产生包含hELF启动子/内含子、hTPA信号肽序列、HBcAG抗原序列和bGHpA区域的插入片段。然后连接这些片段以提供含有HBcAg和HBsAg编码序列的pPJV7193质粒构建体。
然后产生下面的DNA-金制剂用于猪DNA疫苗佐剂试验制剂#1对照、单独的HBcAg/HBsAg载体(pWRG7193)、2微克DNA/每毫克金、0.5毫克金/每筒；和制剂#2在单独一批金(1.0微克pWRG7193 DNA/每毫克金，pPJV2006和pPJV2003 DNA各0.5微克/每毫克金)上共沉淀所有HBcAg/HBsAg载体(pWRG7193)、CTA-KDEL(pPJV2006)和CTB(pPJV2003)DNA载体，0.5毫克金/每筒。
在上文实施例3所述过程后，再一次，在金粒子上以2微克DNA/每毫克金的最终浓度沉淀单独或与pPJV2006和pPJV2003佐剂载体一起沉淀pWRG7193质粒。用上文实施例3所述方法，加载包被的金粒子到TEFZEL管中。两个试验组(每个由5头家猪组成)分别接受用制剂#1和制剂#2的两次免疫，其中两次免疫的间隔是6周，用PowderJectXR-1粒子递送装置，每次免疫包括递送给腹股沟区的两个一前一后500p.s.i.射击，其中每次射击用一个筒。因此，在对照组(制剂#1)中，每次免疫由总共1毫克金和2微克DNA疫苗载体pWRG7193的递送构成。类似地，在佐剂实验组(制剂#2)中，每次免疫包括总共1毫克金，2微克DNA疫苗载体pWRG7193，和佐剂载体pPJV2006和pPJV2003各1微克的递送。在加强免疫(第6周)和加强免疫后2周(第8周)时，收集血液样品。
如下文，进行对核心抗原特异的抗体应答检测在PBS中，以100ng/ml乙型肝炎核心抗原(Biodesign)包被ELISA板。包被后，在4℃过夜。室温，在PBS中，用5％脱脂奶粉封闭板1小时。然后用含有0.05％Tween-20的PBS洗板3次。在2％脱脂奶粉/PBS/0.01％Tween-20中连续稀释猪血清样品，加到ELISA板中。室温，温育2小时后，用PBS/0.05％Tween-20洗板3次。第二抗体由与辣根过氧化物酶共轭结合的羊抗猪IgG构成(Kirkegaard and Perry)，在2％脱脂奶粉/PBS/0.01％Tween-20中以1∶2000稀释，加入板中，室温温育1小时。然后用PBS/0.05％ Tween-20洗板5次，加入100μl-TMB底物。进行显色15分钟，通过加入100μl1N H2SO4终止显色。在450nm读板。图10和11分别表示在第6和8周时，两组猪中每一组在4个不同血清稀释度时的几何平均吸光度值。这些数据证明在应用CT佐剂载体pPJV2006和pPJV2003后，对乙型肝炎核心抗原的抗体效价的显著增加。
除了对乙型肝炎核心抗原增加的体液应答外，在佐剂实验组中也观察到了对乙型肝炎表面抗原特异的抗体应答可检测的增加。在每个动物血清样品中，用商购测定试剂盒(AUSAB，Abbott Laboratories)定量表面抗原特异性抗体。该试剂盒允许用标准板以毫国际单位(mIU/ml)进行抗体应答定量。在对照组(制剂#1)和佐剂实验组(制剂#2)中，几何平均表面抗原抗体效价分别是285和662mIU/ml，证明了该佐剂质粒(pPJV2006和pPJV2003)具有增加对分离载体编码抗原的免疫应答的能力。
实施例7对利用编码CT或LT亚基质粒载体的DNA疫苗的细胞Th1样免疫应答的增加用编码甲型流感病毒M2蛋白质的pM2-FL DNA疫苗载体检测pPJV2002、pPJV2003、pPJV2004、pPJV2005、pPJV2006和pPJV2007佐剂载体在粒子介导的DNA接种上下文中的佐剂效果。通过在显微可见金粒子上沉淀有/无各种佐剂载体混合的M2 DNA疫苗载体，用PowderJectXR-1粒子递送装置(PowderJect Vaccines，Inc.Madison，WI)加速包被的金粒子进入小鼠表皮，进行粒子介导的DNA接种。在上述实施例3中描述了pM2-FL DNA质粒载体的构建。
如上述，在2微米金粒子上沉淀pM2-FL质粒为单一载体，或加佐剂载体样品成为混合载体。具体地，在含有亚精胺小离心管中，质粒DNA(单一pM2-FL载体或添加有一个或多个佐剂载体的pM2-FL载体)与2微米金粒子(Degussa)混合。在实施例3的方法后，进行沉淀，然后也如实施例3所述，包被的金粒子包被到TEFZEL管内表面。然后将管切成适于装载到粒子递送装置的0.5英寸“筒”。
产生下面DNA-金制剂用于小鼠DNA疫苗佐剂试验。
制剂#1pM2-FL DNA载体与pWRG7054空质粒载体在同一批金上沉淀前混合，2.1微克总DNA/每毫克金(0.1微克pM2-FL和2.0微克pWRG7054)，0.5毫克金/每筒；制剂#2pM2-FL DNA载体与CTA和CTB(pPJV2002和pPJV2003)DNA载体在同一批金上沉淀前混合，2.1微克总DNA/每毫克金(每种DNA佐剂载体各1.0微克/每毫克金，0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制剂#3在一批金上共沉淀所有混合有CTA-KDEL和CTB(pPJV2006和pPJV2003)DNA载体的pM2-FL DNA载体，2.1微克总DNA/每毫克金(每种DNA佐剂载体各1.0微克/每毫克金，0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制剂#4在一批金上混合和共沉淀所有混合有CTA-KDEL(pPJV2006)DNA载体和添加有pWRG7054空质粒载体的pM2-FLDNA载体，2.1微克总DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2006、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制剂#5混合有CTA(pPJV2002)DNA载体和添加有pWRG7054空质粒载体的pM2-FL DNA载体，在一批金上混合和共沉淀所有DNAs，2.1微克总DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2002、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制剂#6混合有CTB(pPJV2003)DNA载体和添加有pWRG7054空质粒载体的pM2-FL DNA载体，在一批金上混合和共沉淀所有DNAs，2.1微克总DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2003、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制剂#7pM2-FL DNA载体与LTA和LTB(pPJV2004和pPJV2005)DNA载体在一批金上共沉淀之前混合，2.1微克总DNA/每毫克金(每种DNA佐剂载体各1.0微克/每毫克金，0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制剂#8在一批金上共沉淀所有混合有LTA-RDEL和LTB(pPJV2007和pPJV2005)DNA载体的pM2-FL DNA载体，2.1微克总DNA/每毫克金(每种DNA佐剂载体各1.0微克/每毫克金，0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制剂#9在一批金上混合和共沉淀所有混合有LTA-RDEL(pPJV2007)DNA载体和添加有pWRG7054空质粒载体的pM2-FL DNA载体，2.1微克总DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2007、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制剂#10混合有LTA(pPJV2004)DNA载体和添加有pWRG7054空质粒载体的pM2-FL DNA载体，在一批金上混合和共沉淀所有DNAs，2.1微克总DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2004、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；和制剂#11混合有LTB(pPJV2005)DNA载体和添加有pWRG7054空质粒载体的pM2-FL DNA载体，在一批金上混合和共沉淀所有DNAs，2.1微克总DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2005、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒。
然后，如下所述给11组小鼠施用这些DNA疫苗制剂。每个实验组包含8只动物，每只动物用其各自制剂进行两次免疫，两次免疫间有4周休息期。用PowderJectXR-1粒子递送装置(PowderJect Vaccines Inc.，Madison，WI)，在400p.s.i.氦压力，每次免疫由两次一前一后递送给腹部表皮的递送构成(每次一筒)。在第二次或加强免疫后两周收集血清样品。
除了利用对IgG1或IgG2a特异性的第二抗体共轭物外，用上文实施例3用于总IgG效价检测的ELISA测定法检测个体血清样品对IgG和IgG2a亚类的M2特异性抗体应答。从Southern BiotechnologyAssociates，Inc.(目录#1070-08，浓度0.5mg/ml)获得羊抗-鼠IgG1-生物素共轭结合的抗体，以1/8000稀释度使用。从相同的来源(目录#1080-08，浓度0.5mg/ml)获得羊抗-鼠Ig2 a-生物素共轭结合的抗体，而且也是以1/8000稀释度使用。分段测定每个实验组的M2抗原特异性IgG1和IgG2a的几何平均抗体效价，计算IgG1比IgG2的比率。在下面表5中报告了这些数据。
表5

如参考表5所观察的，添加到M2 DNA疫苗制剂中A或B亚基，或A和B亚基的各种联合引起IgG1-比-IgG2a比率的显著降低，而该比率在缺乏佐剂(制剂#1)的情况下是M2 DNA疫苗(pM2-FL)诱导的。LTA加LTB，和LTA-RDEL加LTB载体联合(分别是制剂#7和#8)应用产生了最大比率的降低。在两个制剂中，本发明多核苷酸佐剂的应用引起了M2抗原特异性IgG2a效价高于IgG1许多，该特征是小鼠中Th1样免疫应答的明显特点。
在图12中绘制接受制剂#1，#2和#7实验组结果为IgG1-比-IgG2a比率的对数。从该图可以看出，用CTA加CTB佐剂载体辅助pM2-FL DNA疫苗组合物(制剂#2)与没有佐剂的pM2-FL疫苗组合物(制剂#1)比较，引起了2个数量级IgG1-比-IgG2a比率的降低。此外，当用LTA加LTB佐剂载体辅助pM2-FL DNA疫苗(制剂#7)，观测到这个比率进一步降低了2个数量级。
实施例8向编码CT或LT的佐剂载体添加信号肽编码序列修饰含有CTA、CTB、LTA和LTB毒素亚基的载体构建体(分别是pPJV2002、pPJV2003、pPJV2004和pPJV2005)以除去tpa信号肽编码序列，构建用于下面实验的编码乙型肝炎表面和核心抗原的双DNA疫苗载体。
用于载体构建/修饰的标准PCR条件如下1.5mM MgCl2(PromegaCorp.，Madison，WI)的1x PCR核心缓冲液；每种引物各0.400μM；每种dNTP(USB Inc.，Cleveland，OH)各200μM；2.5μg Taq聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)；1.0ng模板DNA；加水到100μl；和矿物油(Aldrich Chemical Inc.，Milwaukee WI)覆盖。编程PTC-200热循环仪(MJ Research Inc.，Waltham，MA)以运行下面的程序95℃，4分钟；30个循环(95℃，1分钟；55℃，1分钟15秒；72℃，1分钟。)，72℃，10分钟；和4℃放置。在用限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)切割前，用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia CA)从PCR反应中移出扩增产物。克隆后测序所有PCR产物以确保扩增的忠实性。
更具体地，如下文，构建编码乙型肝炎表面和核心抗原的双DNA疫苗载体。用一系列标准分子生物学技术修饰含有表面抗原编码序列的pWRG7128构建体(实施例4)以提供双(表面/核心抗原)构建体。开始，修饰pWRG7128构建体以除去牛生长激素腺苷酸化区域，并用兔β-珠蛋白腺苷酸化区域置换该区区域。含有CMV启动子的第一插入片段和含有第二个兔β-珠蛋白腺苷酸化区域的第二插入片段连接入修饰的pWRG7128构建体中，其中CMV启动子带有外显子1和外显子2序列，在直接位于插入CMV启动子的上游的Sph1和Pst1位点间插入通过复性systentic寡核苷酸构建的衔接子。
用下面引物对质粒mpSmpCC(GlaxoSmithKline，UK)进行PCR5’-GCC GCT AGC ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GA-3’(SEQ ID NO23)和5’-CCA GGA TCC TTA ACA TTG AGA TTC C-3’(SEQ ID NO24)以产生乙肝-adw2核心抗原编码序列。用Nhe1和BamH1切割这个PCR产物以产生插入片段，然后修饰该片段以包含下游Bgl2位点，插入克隆载体。用Pst1和EcoR1切割克隆载体以产生核心抗原插入片段；用Pst1和Mfe1切割修饰的pWRG7128质粒以产生载体片段，连接核心抗原插入片段到载体片段中，产生双表面/核心抗原质粒构建体。
通过用限制性酶仅仅切除tpa信号肽编码序列修饰含有CTA、CTB、LTA和TB毒素亚基的载体构建体(分别是pPJV2002、pPJV2003、pPJV2004和pPJV2005)以除去tpa信号肽编码序列以分别产生下面构建体CTA w/oTPA、CTB w/o TPA、LTA w/o TPA和LTB w/o TPA。
双表面/核心抗原质粒与不相关质粒DNA(用于无佐剂的对照)，或与毒素亚基载体构建体混合，并在2微米金粒子上沉淀。更具体地，含亚精胺小离心管中混合外加两个佐剂载体(提供CTA/CTB或LTA/LTB联合)的质粒DNA(双表面/核心抗原质粒载体)与2微米金粒子(Degussa)。在实施例3的方法后进行沉淀，也如实施例3所述，然后包被的金粒子包被在TEFZEL管内表面上。然后将管切成适于装载到粒子递送装置的0.5英寸的筒。
因此，产生下面DNA-金制剂用于小鼠DNA疫苗佐剂试验制剂#1(“无佐剂”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μg不相关DNA质粒载体；制剂#2(“CT”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，0.5μgpPJV2002(CTA)DNA质粒载体，0.5μg pPJV2003(CTB)DNA质粒载体；制剂#3(“CT w/o TPA”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，0.5μg CTA w/o TPA DNA质粒载体，0.5μg CTB w/o TPA DNA质粒载体；制剂#4(“CTA”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μgpPJV2002(CTA)DNA质粒载体；
制剂#5(“CTA w/o TPA”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μg CTA w/o TPA DNA质粒载体；制剂#6(“CTB”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μgpPJV2003(CTB)DNA质粒载体；制剂#7(“CTB w/o TPA”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μg CTB w/o TPA DNA质粒载体；制剂#8(“LT”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，0.5μgpPJV2004(LTA)DNA质粒载体，0.5μg pPJV2005(LTB)DNA质粒载体；制剂#9(“LT w/o TPA”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，0.5μg LTA w/o TPA DNA质粒载体，0.5μg LTB w/o TPA DNA质粒载体；制剂#10(“LTA”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μgpPJV2004(LTA)DNA质粒载体；制剂#11(“LTA w/o TPA”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μg LTA w/o TPA DNA质粒载体；制剂#12(“LTB”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μgpPJV2005(LTB)DNA质粒载体；和制剂#13(“LTB w/o TPA”)1μg双表面/核心抗原DNA质粒载体，1μg LTB w/o TPA DNA质粒载体。
在第一个研究中，用PowderJectXR-1粒子递送装置(PowderJectVaccines Inc.，Madison，WI)，给5组小鼠施用各种上述DNA疫苗制剂。每个实验组包含5个动物，每个动物用各自的制剂接受两次免疫，在两次免疫间有4周休息期。检测的制剂如下制剂#1(无佐剂)；制剂#2(CT)；制剂#3(CT w/o TPA)；制剂#8(LT)；和制剂#9(LT w/o TPA)。第二次免疫后2周处死所有动物，收集脾脏用于IFN-γ和IL-4 ELISPOT测定中。对于细胞免疫测定，在与小鼠已知T细胞抗原表位(来源于表面或核心抗原)对应的肽存在的情况下，在体外培养免疫动物脾脏脾细胞的单细胞悬浮液。在DMSO(10mg/ml)中溶解肽和在培养中稀释到10ug/ml。
对于ELISPOT测定法，用50μl适合抗血清(15μg/ml抗IFN-γ或IL-4抗血清，Pharmingen)在无菌0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中包被微孔多筛选膜过滤板，4℃过夜。用无菌PBS洗板6次，然后用含有10％胎牛血清(FBS)的组织培养基在室温下封闭1-2小时。除去培养基，按照每孔1×106细胞总数，向孔中分配脾脏细胞。对于少于1×106免疫动物细胞的孔，加入首次用于实验的动物细胞达到1×106总数。在上述肽存在情况下，细胞在组织培养的培养箱中温育过夜。然后用PBS洗板2次，用蒸馏水洗1次。随后用PBS洗3次。向板中(PBS中1μg/ml溶液50μl)加入生物素酰化的抗IFN-γ或抗IL-4单克隆抗体(Pharmingen)，室温温育2小时。用PBS洗板6次，之后，加入50μl链霉抗生物素蛋白素碱性磷酸酶共轭物(PBS中1∶1000，Pharmingen)，室温温育2小时。用PBS洗板6次，加入碱性磷酸酶显色底物(BioRad)，进行这个反应直到暗斑出现。通过用水洗3次终止反应。空气干燥板，在显微镜下计数斑。
通过测定对双表面/核心抗原构建体编码的乙肝表面和核心抗原(“sAg”and“cAg”)的IFN-γ和IL-4 ELISPOT应答评估分泌或非分泌毒素亚基编码序列的佐剂效果，如图13A-13D所报告比较这些结果。如所观察到的，在IFN-γ对表面和核心抗原的应答及IL-4对表面抗原的应答方面，分泌的(含有信号序列)CT和LT佐剂载体(分别是制剂#2和#8)产生了显著的增加(P≤0.05)(参见图13A、13B和13C)。关于IL-4对核心抗原的应答，LT载体(制剂#8和#9)佐剂效果的缺乏与LT毒素比CT毒素为更多Th1佐剂的观察结果是一致的。最重要地，缺乏信号序列的CT和LT载体(分别是制剂#3和#9)显示了较弱的佐剂效果，特别是在IFN-γELISPOT数据中所看到的对表面和核心抗原(参见，图13A和13C)，其中由于缺失信号肽序列，佐剂活性在统计学上显著降低。
最后，在分泌的(制剂#2和#8)和非分泌的(制剂#3和#9)间佐剂效果的清楚可观测到的差异帮助证明了可观测到的佐剂效果不是因为佐剂载体内的CpG基序，因为有信号和无信号的载体在细菌DNA(CpG)含量没有任何不同，但是它们在增加表面抗原特异性IFN-γ应答的能力方面却显示了显著差异。
在第二个研究中，用PowderJectXR-1粒子递送装置(PowderJectVaccines Inc.，Madison，WI)给8组小鼠施用上述DNA疫苗制剂。每个实验组包含5个动物，每个动物用各自的制剂接受两次免疫，在两次免疫间有4周休息期。检测的制剂如下制剂#1(无佐剂)；制剂#2(CT)；制剂#4(CTA)；制剂#5(CTA w/o TPA)；制剂#6(CTB)；制剂#7(CTB w/oTPA)；制剂#8(LT)；制剂#10(LTA)；制剂#11(LTA w/o TPA)；制剂#12(LTB)和制剂#13(LTB w/o TPA)第二次免疫后2周处死所有动物，收集脾脏用于IFN-γ和IL-4 ELISPOT测定中，如上所述。
作为第二次研究的结果(数据未示)，再一次观察到了在各种佐剂质粒中，没有可能由CpG含量引起的可辨别的佐剂效果。尽管对大部分各种毒素亚基佐剂载体没有观察到统计学相关的佐剂效果，但是LT亚基载体(制剂#10-13)确实显示了对表面抗原(sAg)的IFN-γ和IL-4应答的佐剂效果，而该应答受分泌信号序列存在/缺乏的影响。
实施例9在病毒攻击研究中，编码CTA/CTB或LTA/LTB亚基肽的佐剂质粒载体为了评测本发明佐剂质粒载体在疱疹单纯病毒类型2(HSV-2)病毒攻击模型中提供保护效果的能力，进行下面的研究。构建编码HSV-2抗原的DNA疫苗，然后将其与本发明佐剂质粒载体的各种联合进行混合以提供疫苗组合物。免疫后，用HSV-2病毒攻击免疫动物，并且测定各种疫苗组合物的保护效果。
在DNA抗原质粒构建方面，用标准PCR技术构建质粒。用于载体构建的标准PCR条件如下1.5mM MgCl2(Promega Corp.，Madison，WI)的1x PCR核心缓冲液；每种引物各0.400μM；每种dNTP(USB Inc.，Cleveland，OH)各200μM；2.5μg Taq聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)；1.0ng模板DNA；加水到100μl；和矿物油(Aldrich Chemical Inc.，Milwaukee WI)覆盖。编程PTC-200热循环仪(MJ Research Inc.，Waltham，MA)以运行下面的程序95℃，4分钟；30个循环(95℃，1分钟；55℃，1分钟15秒；72℃，1分钟。)，72℃，10分钟，和4℃放置。在用限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)切割前，用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia CA)从PCR反应中移出扩增产物。克隆后测序所有PCR产物以确保扩增的忠实性。
更具体地，如下所述，构建编码HSV-2早期ICP27抗原的DNA疫苗质粒载体。HSV是有约150-160kbp基因组的双链DNA病毒。病毒基因组在20面体核衣壳内包装，该核衣壳包被在膜中。膜(或包膜)包含至少10个病毒编码的糖蛋白，最丰富的糖蛋白是gB、gC、gD和gE。病毒基因组也编码70多个其它蛋白质，包括一组约5个ICP抗原。与仅在病毒生命循环晚期产生的包膜糖蛋白相比，这些早期蛋白质是在病毒复制循环的早期合成的。对于HSV的分子结构和组织的述评参见，例如Roizman和Sears(1996)“Herpes simplex viruses and their replication”in Fields Virology，第三版Fields等eds.，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，PA。从HSV-2基因组，例如HSV-2基因组的范围从约核苷酸114589到134980的基因组区，或HSV-2基因组的核苷酸110931到139697范围的EcoRI片段，容易得到HSV-2 ICP27抗原。从公开的来源可得到HSV-2基因组序列，例如存储在GenBank中登记号NC_001798的序列为了构建用在本研究中的ICP27载体，用下面引物5’-GCC ACT CTCTTC CGA CAC-3’(SEQ ID NO25)和5’-CAA GAA CAT CAC ACG GAA C-3’(SEQ ID NO26)从HSV-2基因组对ICP27编码区进行PCR，以获得与ICP27编码区对应的，含有HSV-2核苷酸序列114523-116179(GenBank)的核苷酸片段。然后克隆ICP27片段到pTarget载体(Promega Corp.，Madison，WI)的多克隆区。
混合含有CTA、CTB、LTA和LTB毒素亚基(分别是pPJV2002、pPJV2003、pPJV2004和pPJV2005)的佐剂质粒载体构建体以提供CTA/CTB(pPJV2002+pPJV2003)和LTA/LTB(pPJV2004+pPJV2005)佐剂。ICP27抗原质粒与毒素亚基载体构建体对混合，并且在2微米金粒子上沉淀。更具体地，在含有亚精胺的小离心管中，混合外加有两个佐剂载体(提供CTA/CTB或LTA/LTB联合)的质粒DNA(ICP27抗原质粒载体)与2微米金粒子(Degussa)。在实施例3的方法后，进行沉淀，然后也如实施例3所述，包被的金粒子包被在TEFZEL管内表面。然后将管切成适于装载到粒子递送装置的0.5英寸筒。
因此，产生下面DNA-金制剂用于HSV-2攻击研究制剂#1(无佐剂)2μg ICP27抗原DNA质粒载体；制剂#2(“高CT”)900ng ICP27抗原DNA质粒载体，50ngpPJV2002(CTA)，50ngpPJV2003(CTB)；制剂#3(“低CT”)500ng ICP27抗原DNA质粒载体，250ng pPJV2002(CTA)，250ng pPJV2003(CTB)；制剂#4(“高LT”)900ng ICP27抗原DNA质粒载体，50ngpPJV2004(LTA)，50ng pPJV2005(LTB)；和制剂#5(“低LT”)500ng ICP27抗原DNA质粒载体，250ngpPJV2004(LTA)，250ng pPJV2005(LTB)。
在该研究中，用PowderJectXR-1粒子递送装置(PowderJectVaccines Inc.，Madison，WI)，给5个不同组小鼠施用上述DNA疫苗制剂。每个实验组包含12个动物，每个动物用各自的制剂接受两次免疫(应用于腹部的单射击)，在两次免疫间有4周休息期。设置6组小鼠作为阴性(首次用于实验)对照，不接受任何接种。第二次免疫后2周，每组取出4只小鼠用于IFN-γELISPOT测定(数据未示出)。
第二次免疫后2周，用1×106PFU，MS株系的HSV-2病毒通过鼻内滴注攻击所有剩下的小鼠(8只/每组)。在图14中说明了描述攻击结果的存活图。如可观察到的，100％首次用于实验的动物在攻击后4天内死亡。在图上用(●)曲线描绘首次用于实验的动物。此外，100％单独接受ICP27抗原质粒载体(制剂#1)的动物在攻击后7天内死亡。在图上用()曲线描绘接受制剂#1的动物。明显的对比，25％(2/8)接受低剂量CT佐剂的ICP27质粒(制剂#3)的动物获得免受病毒攻击的保护，38％(3/8)接受高剂量CT佐剂的ICP27质粒(制剂#2)的动物获得免受病毒攻击的保护。在图上用(■)曲线描绘接受制剂#3的动物。在图上用(◆)曲线描绘接受制剂#2的动物。最后，低剂量LT佐剂(制剂#5)和高剂量LT-佐剂(制剂#4)的ICP27疫苗在免疫动物中提供了完全(100％)的保护。在图上用(▲)曲线描绘接受制剂#5的动物。在图上用(○)曲线描绘接受制剂#4的动物。
因此，已经说明了新的多核苷酸佐剂分子、包含这些佐剂分子的组合物、及常规核酸免疫技术。尽管已详细描述了本发明优选的实施方式，但是可以进行不偏离所附权利要求限定的本发明精神和范围的明显变化，这是可以理解的。
序列表<110>宝德杰克特疫苗有限公司<120>核酸佐剂<130>P03GB051797<150>US 09/724,315<151>2000-11-27<160>22<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5500<212>DNA<213>pPJV2002质粒<400>1gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt120tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat180aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt240ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg300ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga360tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc420tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac480actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg540gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca600acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg660gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg720acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg780gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag840ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg900gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct960
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权利要求
1.一种含有第一和第二核酸序列的组合物，其中所述第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素截短的A亚基编码区，所述第二核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素截短的B亚基编码区，条件是每个所述截短的亚基编码区具有5’缺失，并且编码不具氨基末端细菌信号肽的亚基肽。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一和第二核酸序列存在于单一核酸构建体中。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述核酸构建体是质粒载体。
4.如权利要求2所述的组合物，其中第一和第二核酸序列可操作地连接于转录控制元件。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述转录控制元件是异源启动子。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一和第二核酸序列存在于分离的核酸构建体中。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述分离的核酸构建体是质粒载体。
8.如权利要求1所述的组合物，其中截短的亚基编码区是获自或来源于相同的细菌ADP-核糖基化外毒素。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述的细菌ADP-核糖基化外毒素是霍乱毒素(CT)。
10.如权利要求8所述的组合物，其中所述细菌ADP-核糖基化外毒素是大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)。
11.如权利要求1所述的组合物，其中至少一个截短的亚基编码区已被基因修饰以除去其编码的亚基肽的毒性。
12.如权利要求11所述的组合物，其中截短的A亚基编码区已被基因修饰以破坏或失活其编码的亚基肽中ADP-核糖基转移酶的活性。
13.如权利要求1所述的组合物，其中截短的A亚基编码区已被进一步基因修饰以缺失其编码的亚基肽中C-末端KDEL或RDEL基序。
14.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含目的抗原。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述抗原来源于细菌、病毒或寄生病原体。
16.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含编码目的抗原的第三核酸序列。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述抗原来源于细菌、病毒或寄生病原体。
18.如权利要求16所述的组合物，其中所述第三核酸序列存在于不含有所述第一或第二核酸序列的核酸构建体中。
19.如权利要求18所述的组合物，其中含有第三核酸序列的核酸构建体是质粒载体。
20.如权利要求16所述的组合物，其中所述第三核酸序列存在于也含有至少一个所述第一或所述第二核酸序列的核酸构建体中。
21.如权利要求20所述的组合物，其中含有第三核酸序列的核酸构建体是质粒载体。
22.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是粒子形式。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述粒子组合物适于通过粒子递送装置经皮递送。
24.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含药学可接受的载体或赋形剂。
25.如权利要求1所述的组合物，其中第一和第二核酸序列包被于核心载体粒子上。
26.如权利要求25所述的组合物，其中核心载体粒子具有约0.1到约10μm的平均直径。
27.如权利要求25所述的组合物，其中核心载体粒子包括金属。
28.如权利要求27所述的组合物，其中金属是金。
29.一种粒子递送装置，其中用权利要求23所述粒子疫苗组合物装载所述装置。
30.如权利要求1所述的组合物，其进一步含有转染促进剂。
31.如权利要求30所述的组合物，其中转染促进剂是脂质体。
32.一种含有第一和第二核酸序列的组合物，其中所述第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的修饰的A亚基编码区，所述第二核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的B亚基编码区，条件是所述修饰的A亚基编码区和B亚基编码区分别编码成熟亚基肽，并且进一步条件是修饰的A亚基编码区已被基因修饰以缺失其编码的亚基肽中C-末端KDEL或RDEL基序。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述第一和第二核酸序列存在于单一核酸构建体中。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述核酸构建体是质粒载体。
35.如权利要求33所述的组合物，其中第一和第二核酸序列可操作地连接于转录控制元件。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述转录控制元件是异源启动子。
37.如权利要求32所述的组合物，其中所述第一和第二核酸序列存在于分离的核酸构建体中。
38.如权利要求37所述的组合物，其中所述分离的核酸构建体是质粒载体。
39.如权利要求32所述的组合物，其中B和修饰的A亚基编码区是获自或来源于相同细菌ADP-核糖基化外毒素。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述细菌ADP-核糖基化外毒素是霍乱毒素(CT)。
41.如权利要求39所述的组合物，其中所述细菌ADP-核糖基化外毒素是大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)。
42.如权利要求32所述的组合物，其中至少一个B或修饰的A亚基编码区已被基因修饰以除去其编码的亚基肽的毒性。
43.如权利要求42所述的组合物，其中修饰的A亚基编码区已被基因修饰以破坏或失活其编码的亚基肽中ADP-核糖基转移酶的活性。
44.如权利要求32所述的组合物，其中通过5’缺失已分别截短修饰的A亚基编码区和B亚基编码区，因此，所述每个截短的亚基编码区编码不具有氨基末端细菌信号肽的亚基肽。
45.如权利要求32所述的组合物，其进一步包含目的抗原。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述抗原来源于细菌、病毒或寄生病原体。
47.如权利要求32所述的组合物，其进一步包含编码目的抗原的第三核酸序列。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述抗原来源于细菌、病毒或寄生病原体。
49.如权利要求47所述的组合物，其中所述第三核酸序列存在于不含有所述第一或第二核酸序列的核酸构建体中。
50.如权利要求49所述的组合物，其中含有第三核酸序列的核酸构建体是质粒载体。
51.如权利要求47所述的组合物，其中所述第三核酸序列存在于也包含至少一个所述第一或所述第二核酸序列的核酸构建体中。
52.如权利要求51所述的组合物，其中含有第三核酸序列的核酸构建体是质粒载体。
53.如权利要求32所述的组合物，其中所述组合物是粒子形式。
54.如权利要求53所述的组合物，其中所述粒子组合物适于通过粒子递送装置的经皮递送。
55.如权利要求32所述的组合物，其进一步包含药学可接受的载体或赋形剂。
56.如权利要求55所述的组合物，其中第一和第二核酸序列包被于在核心载体粒子上。
57.如权利要求56所述的组合物，其中核心载体粒子具有约0.1到约10μm的平均直径。
58.如权利要求56所述的组合物，其中核心载体粒子包括金属。
59.如权利要求58所述的组合物，其中金属是金。
60.一种粒子递送装置，其中用权利要求54所述粒子疫苗组合物装载所述装置。
61.如权利要求32所述的组合物，其进一步含有转染促进剂。
62.如权利要求61所述的组合物，其中转染促进剂是脂质体。
63.含有第一和第二核酸序列的组合物在药剂制造中的用途，其中每个所述序列包含细菌ADP-核糖基化外毒素亚基的编码区，所述药剂用于提高脊椎动物个体对所述个体中目的抗原的免疫应答，通过给所述个体施用目的抗原和组合物，因此表达由第一和第二核酸序列编码的毒素亚基，其量足以诱导提高的对抗原的免疫应答，其中所述第一核酸序列含有获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区，所述第二核酸序列含有获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区，条件是每个所述截短的亚基编码区具有5’缺失，并且编码不具氨基末端细菌信号肽的亚基肽。
64.根据权利要求63所述的用途，其中给个体相同位点施用目的抗原和组合物。
65.根据权利要求63所述的用途，其中同时施用目的抗原和组合物。
66.根据权利要求65所述的用途，其中目的抗原与组合物联合以提供单疫苗组合物。
67.根据权利要求63所述的用途，其中目的抗原来源于细菌、病毒或寄生病原体。
68.根据权利要求67所述的用途，其中给个体施用第三核酸序列，并且第三核酸序列编码所述目的抗原。
69.根据权利要求63所述的用途，其中以粒子形式给个体施用第一和第二核酸序列。
70.根据权利要求69所述的用途，其中含有第一和第二核酸序列的组合物包被于核心载体粒子上，并且用粒子介导的递送技术施用给个体。
71.根据权利要求63所述的用途，其中个体是人。
72.含有第一和第二核酸序列的组合物在制造药剂中的用途，其中每个所述序列包含细菌ADP-核糖基化外毒素亚基的编码区，所述药剂用于提高脊椎动物个体对所述个体中目的抗原的免疫应答，通过给所述个体施用目的抗原和组合物，因此，表达由第一和第二核酸序列编码的毒素亚基，其量足以诱导提高的对抗原的免疫应答，其中所述第一核酸序列含有获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的修饰的A亚基编码区，所述第二核酸序列含有获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的B亚基编码区，条件是所述修饰的A亚基编码区和B亚基编码区分别编码成熟亚基肽，并且进一步条件是修饰的A亚基编码区已被基因修饰以缺失由其编码的亚基肽的C-末端KDEL或RDEL基序。
73.根据权利要求72所述的用途，其中给个体相同位点施用目的抗原和组合物。
74.根据权利要求72所述的用途，其中同时施用目的抗原和组合物。
75.根据权利要求74所述的用途，其中目的抗原与组合物联合以提供单疫苗组合物。
76.根据权利要求72所述的用途，其中目的抗原来源于细菌、病毒或寄生病原体。
77.根据权利要求76所述的用途，其中给个体施用第三核酸序列，并且第三核酸序列编码所述目的抗原。
78.根据权利要求72所述的用途，其中以粒子形式给个体施用第一和第二核酸序列。
79.根据权利要求78所述的用途，其中含有第一和第二核酸序列的组合物包被于核心载体粒子上，并且用粒子介导的递送技术施用给个体。
80.根据权利要求72所述的用途，其中个体是人。
81.用于提高对个体中目的抗原的免疫应答的方法，该方法包括(a)给个体施用目的抗原；(b)提供含有第一和第二核酸序列的佐剂组合物，其中所述第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区，所述第二核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区，条件是每个所述截短的亚基编码区具有5’缺失，并且编码不具氨基末端细菌信号肽的亚基肽；(c)给个体施用所述佐剂组合物，藉此通过引入到所述个体，表达第一和第二核酸序列，以提供足够量的亚基肽来诱导提高的对目的抗原的免疫应答。
82.用于提高对个体中目的抗原的免疫应答的方法，该方法包括(a)给个体施用目的抗原；(b)提供含有第一和第二核酸序列的佐剂组合物，其中所述第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的修饰的A亚基编码区，所述第二核酸序列是获自或来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的B亚基编码区，条件是所述修饰的A亚基编码区和所述B亚基编码区分别编码成熟亚基肽，并且进一步的条件是修饰A的亚基编码区已经被基因修饰以缺失由其编码的亚基肽的C-末端KDEL或RDEL基序；和(c)给个体施用所述佐剂组合物，藉此通过引入到所述个体，表达第一和第二核酸序列，以提供足够量的亚基肽来诱导提高的对目的抗原的免疫应答。
全文摘要
本发明描述了重组核酸分子。该分子有两个核酸序列，其中第一核酸序列是获自或来源于细菌ADP－核糖基化外毒素截短的A亚基编码区，第二核酸序列是截短的B亚基编码序列。也描述了含有这些分子的载体和组合物。也描述了利用这些重组核酸分子和组合物增加对目的抗原免疫应答的方法。
文档编号A61K39/00GK1537013SQ01819570
公开日2004年10月13日 申请日期2001年11月26日 优先权日2000年11月27日
发明者约尔·R·海恩斯, 约书亚·E·阿林顿, E 阿林顿, 约尔 R 海恩斯 申请人:宝德杰克特疫苗有限公司