鉴定利用促肾上腺皮质激素释放因子受体来调节肌肉质量或功能的化合物的方法

专利名称：鉴定利用促肾上腺皮质激素释放因子受体来调节肌肉质量或功能的化合物的方法
技术领域：
本发明涉及鉴定候选化合物的方法，所述化合物用于调节骨骼肌质量或功能，或调节促肾上腺皮质激素释放因子-2受体(CRF2R)的活性或表达。本发明也涉及治疗骨骼肌萎缩的方法，或使用CRF2R作为干涉目标来诱导骨骼肌肥大的方法，以及使用CRF2R和促肾上腺皮质激素释放因子-1受体(CRF1R)作为干涉目标来治疗肌营养不良的方法。
背景技术：
CRFR和配体到目前为止，已鉴定有两种促肾上腺皮质激素释放因子受体(CRF1R和CRF2R)，它们属于G-蛋白质偶联受体(GPCR)类。CRF1R或CRF2R的激动剂活化导致腺苷酸环化酶的Gαs活化。腺苷酸环化酶催化cAMP的形成，所述cAMP继而具有多重效果，包括蛋白质激酶A的活化、细胞内的钙释放和促细胞分裂剂活化的蛋白质激酶(MAP激酶)的活化。在其它研究中，在CRF受体的激动剂活化后，细胞内的三磷酸肌醇酯合成的加强表明了CRFR也可以偶联到Gαq。
CRF1R和CRF2R已能从人、大鼠、小鼠、鸡、牛、鲶鱼、蛙和绵羊的体内克隆。CRF1R和CRF2R分别具有独特的分布模式。在人体内，CRF2R受体的三种同工型，α、β和γ，已被克隆。αCRF2R和βCRF2R的同源物已在大鼠内得到鉴定。
CRFR的几种配体/激动剂是已知的。促肾上腺皮质激素释放因子(或激素，CRF或CRH)结合并活化CRF1R和CRF2R。CRF是躯体应激反应的主要调节剂。这种41-氨基酸肽负责全部的神经元、内分泌和免疫过程，作为下丘脑-垂体-肾上腺激素轴(HPA轴)的主要调节剂。另外，在CRF和两栖动物肽-蛙皮降压肽(sauvagine)以及telostian肽-硬骨鱼紧张肽(urotensin)之间具有基本序列同源性，这两者都作为CRF1R和CRF2R的激动剂。这三种肽具有与降血压剂和ACTH催分泌素相似的生物性质。另外，硬骨鱼紧张肽的哺乳动物同源物，urocortin(促肾上腺皮质激素释放肽类新成员)，已被特征化。
通过使用受体选择激动剂和拮抗剂可从药理上区分CRF受体与非CRFR。这些选择性激动剂和拮抗剂，以及切除CRFR的小鼠，已被用于确定哪一种CRF受体调节了特定的生物反应。
CRF1R的作用已相当明确。CRF1R基因已被切除(切除CRF1R)的小鼠显示了受损害的应激反应和减少的类似焦虑的行为。CRF1R是HPA轴的主要调节剂。具体地讲，促肾上腺皮质激素释放因子从下丘脑释放出来，并经过下丘脑-垂体的门静脉系统运输到脑垂体前叶，与位于脑垂体前叶内的细胞上的CRF1R相互作用。CRF1R的激动剂活化导致ACTH从脑垂体前叶的细胞释放进入体循环。所释放的ACTH结合位于肾上腺皮质内的细胞上的ACTH受体，导致包括皮质类固醇的肾上腺激素的释放。皮质类固醇调节许多效应，包括但不限于通过含有胸腺和脾萎缩的机制的免疫系统抑制。由此，CRF1R的活化间接地导致免疫系统经HPA轴活化的下调。
CRF2R的作用未被很好地发挥。CRF2R基因已被切除(切除CRF2R)的小鼠显示了在用urocortin刺激后削弱的食物摄取减少，缺少血管舒张，但有正常的应激反应。CRF2R的实验表明，CRF2R可产生CRFR激动剂的低血压/血管扩张效果，以及在用CRFR激动剂处理小鼠后观测到的食物摄取减少。
骨骼肌萎缩和肥大骨骼肌为塑性组织，易于适应在工作的生理要求或代谢需要的变化。肥大是指骨骼肌质量的增大，而骨骼肌萎缩是指骨骼肌质量的减少。急性骨骼肌萎缩可归因于许多因素，包括但不限于由于手术、卧床休息或骨折引起的废用；由于脊髓损伤、自身免疫疾病或传染病引起的神经切除/神经损害；对于其它不相关条件的糖皮质激素使用；由于感染或其它原因引起的败血病；由于疾病或饥饿引起的营养不良；和太空旅行。通过正常的生物过程产生骨骼肌萎缩，但是，在某些医疗情况下，这种正常的生物过程导致肌肉萎缩程度下降。例如，急性骨骼肌萎缩在经无法移动的病人的康复中有显著限制性，所述无法移动包括但不限于伴随整形程序的固定。在这些情况下，逆转骨骼肌萎缩所需要的康复时间通常长于修复初始损伤所需要的时间。这些急性废用性萎缩是年长者的特殊问题，他们可能已经患有严重的与年龄相关的肌肉功能和质量的缺陷，因为这些萎缩可导致永久残废和过早死亡。
骨骼肌萎缩也可来自慢性疾病，例如癌恶病质、慢性炎症、爱滋恶病质、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心力衰竭、遗传病，例如，肌肉萎缩症、神经变形病和老年性肌肉萎缩(与年龄相关的肌肉损耗)。在这些慢性疾病中，骨骼肌萎缩可导致活动能力的过早损失，从而增加与该疾病相关的发病率。
目前对于控制骨骼肌的萎缩或肥大的分子过程还了解甚少。尽管骨骼肌萎缩的初始触发因素不同于其它各种萎缩的起始情况，但是在受感染的骨骼肌纤维中发生几个共同的生化变化，所述生化变化包括蛋白质合成的减少和蛋白质降解的增加，以及由缓慢(高氧化性代谢/缓慢收缩的蛋白质同功酶)到快速(高糖酵解代谢/快速收缩的蛋白质同功酶)的纤维转换的收缩和代谢的酶蛋白质同功酶性质的改变。发生在骨骼肌内其它变化包括脉管系统的损失和细胞外基体的重建。快速和慢速的肌肉颤搐在适当条件下表现出萎缩，其相对的肌肉损耗取决于具体的萎缩刺激物或条件。重要的是，所有这些变化都是相互调节的，根据生理和代谢需要的改变而开始或结束。
萎缩和肥大发生的过程适用于全部哺乳类动物。多项研究表明在啮齿动物和人的肌肉萎缩中具有相同的基础分子、细胞和生理过程。因此，骨骼肌萎缩的啮齿动物模型已被成功地用于理解和预测人的萎缩响应。例如，在啮齿动物和人类中通过多种方式诱发的萎缩导致在肌肉解剖、切面面积、功能、纤维类型转换、收缩蛋白质的表达和组织学方面的相似变化。另外，几种试剂已表明可用来调节啮齿动物和人类的骨骼肌萎缩。这些试剂包括合成代谢类固醇、生长激素、类似胰岛素的生长因子I和β-肾上腺素能激动剂。总之，这些数据表明啮齿动物和人的骨骼肌萎缩来自共同机理。
尽管一些试剂已显示可用于调节骨骼肌萎缩，并据此被证明可用于人类，但是这些试剂具有人们所不希望的副作用，例如心肌肥大、瘤形成、多毛症、女性的雄性激素过多、发病率和死亡率增加、肝脏损害、血糖过低、肌肉骨骼疼痛、组织浮肿增加、心搏过速和水肿。目前，还没有针对急性或慢性骨骼肌萎缩的高效的和高度选择性的疗法。因此，需要寻找其它治疗试剂来调节骨骼肌萎缩。
肌营养不良肌营养不良包括一组遗传的渐进性肌肉障碍，在临床上通过骨骼肌衰弱的选择分布来区别。两种最常见的肌营养不良形式为杜兴(Duchenne)营养不良和贝克尔(Becker)营养不良，分别来自营养不良基因的遗传突变，该基因位于Xp21位置。其它营养不良包括但不限于肢带肌营养不良，它来自多个遗传位置的突变，包括p94钙蛋白酶、肌葡聚糖(adhalin)、γ-sarcoglycan(糖蛋白的-种)和β-sarcoglycan位置；颜面-肩胛-肱骨(Landouzy-Dejerine)肌营养不良、肌强直性营养不良和Emery-Dreifuss肌营养不良。杜兴肌营养不良几乎全部发生在男性身上，其症状包括鸭步态、趾行走、脊柱前凸、经常性跌倒以及站立困难和爬楼梯困难。这些症状开始于约3至7岁，大多数病人到10至12岁时将以轮椅代步，许多人在约20岁时由于呼吸道并发症而死亡。杜兴肌营养不良的目前疗法包括服用强的松(皮质类固醇药物)，该药物尽管不能治愈该病，但能减缓肌肉力量的下降和延迟残疾。皮质类固醇，例如强的松，据信可用于阻滞免疫细胞活化和浸润，皮质类固醇通过由疾病引起的肌肉纤维损害而沉淀。不幸的是，皮质类固醇治疗也导致骨骼肌萎缩，这抵消了阻滞这些病人的免疫反应的一些潜在优点。因此，需要鉴定治疗试剂，该试剂能减缓肌肉纤维损害，并延迟具有肌营养不良的病人的残疾发生，与目前的疗法相比，引起较小程度的骨骼肌萎缩。
与鉴定用于治疗骨骼肌萎缩或肌营养不良的化合物相关的一个问题是缺少良好的鉴定这些化合物的筛选方法。本申请人现已发现，CRF2R与骨骼肌质量或功能的调节有关，CRF2R激动剂能够阻滞骨骼肌萎缩和/或诱导骨骼肌肥大。通过提供使用CRF2R的筛选方法，CRF2R可用于鉴定能治疗肌肉萎缩的候选化合物，本发明解决了鉴定治疗肌肉萎缩的化合物的问题。通过提供筛选方法来鉴定可活化CRF1R和CRF2R的候选化合物，本发明也解决了寻找治疗肌营养不良的化合物的问题。
发明概述本发明涉及使用CRFR来鉴定候选化合物，该候选化合物潜在地可用于治疗骨骼肌萎缩和/或诱导骨骼肌肥大。尤其是，本发明提供了用于鉴定候选化合物来调节骨骼肌质量或功能的体外方法，该方法包括使试验化合物与表达CRF2R的细胞接触，或使试验化合物与分离的CRF2R接触，并确定该试验化合物是否可结合或活化CRF2R。本发明的另一个实施方案涉及从一组由一种或多种物质组成的候选化合物中鉴定候选治疗化合物的方法，该候选化合物已被确定为可结合或活化CRF2R，该方法包括给人类以外的动物施用该候选化合物，并测定该候选化合物是否可调节被测动物的骨骼肌质量或肌肉功能。本发明的又一个实施方案涉及鉴定候选化合物的方法，该候选化合物用于调节骨骼肌质量或功能，该方法包括以下任意顺序的步骤(i)使试验化合物与表达功能CRF2R的细胞接触，并确定由试验化合物引起的CRF2R的活化量；(ii)使试验化合物与表达功能性CRF1R的细胞接触，并确定由试验化合物引起的CRF1R的活化量；然后(iiii)比较CRF2R活化量和CRF1R活化量；和(iv)鉴定那些对于CRF2R和CRF1R具有相似活性或对于CRF2R具有选择性的试验化合物，该试验化合物作为候选化合物，用于调节骨骼肌质量或功能。
本发明还提供了鉴定候选化合物的方法，该候选化合物可延长或增大激动剂诱导的CRF2R活性或CRF2R信号转换途径的活性。这些方法包括以下任意顺序的或同时进行的步骤(i)使试验化合物与表达功能性CRF2R的细胞接触；(ii)以足够长的时间和充足的浓度用CRF2R激动剂处理该细胞，使得在对照细胞内的CRF2R脱敏；然后(iii)测定CRF2R的活化量，并鉴定可延长或增大CRFR或CRFR信号转换途径的活性的试验化合物，该试验化合物作为候选化合物，用于调节骨骼肌质量或功能。在一个特定实施方案中，本发明涉及从一组由一种或多种物质组成的候选化合物中鉴定候选治疗化合物，所述候选化合物被测定可延长或增大CRF2R或CRF2R信号转换途径的活性，该方法包括给人类以外的动物施用该候选化合物和CRF2R激动剂，并测定该候选化合物是否可调节测试动物的骨骼肌质量或功能。
本发明还提供了鉴定候选化合物的方法，该候选化合物可增加CRF2R表达，该方法包括将试验化合物与细胞或细胞溶解产物接触，该细胞溶解产物包含与CRF2R基因调节元件有操作性关联的报道基因，并检测该报道基因的表达。可增加报道基因表达的试验化合物被鉴定为用于增加CRF2R表达的候选化合物。在一个特定实施方案中，通过给人类以外的动物施用候选化合物，并测定该候选化合物是否调节测试动物的骨骼肌质量或功能，本发明涉及确定那些增加CRF2R表达的候选化合物是否可用于调节体内的骨骼肌质量或功能的方法。
本发明还提供了鉴定候选化合物的方法，该候选化合物可增加CRF表达，该方法包括使试验化合物与细胞或细胞溶解产物接触，该细胞溶解产物包含与CRF基因调节元件操作性关联的报道基因，并检测该报道基因的表达。可增加报道基因表达的试验化合物被鉴定为用于增加CRF表达的候选化合物。在一个特定实施方案中，通过给人类以外的动物施用候选化合物，并测定该候选化合物是否调节测试动物的骨骼肌质量或功能，本发明涉及确定那些可增加CRF表达的候选化合物是否可用于调节体内的骨骼肌质量或功能的方法。
本发明也涉及使用CRF2R激动剂、编码功能性CRF2R的表达载体、编码本质上为活性CRF2R的表达载体、或可增加CRF2R或CRF表达的化合物，来治疗骨骼肌萎缩。尤其是，本发明提供了治疗患者的骨骼肌萎缩的方法，该患者急需这种治疗，该方法包括给该患者施用安全有效量的CRF2R激动剂、编码功能性CRF2R的表达载体、编码本质上为活性CRF2R的表达载体、编码CRF或CRF类似物的表达载体、或可增加CRF2R或CRF的表达的化合物。在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗患者的骨骼肌萎缩的方法，该患者急需这种治疗，该方法包括给该患者施用安全有效量的CRF2R激动剂和安全有效量的化合物，该化合物可延长或增大激动剂诱导的CRF2R或CRF2R信号转换途径的活性。
本发明也涉及使用CRF2R激动剂来增加患者的骨骼肌质量或功能。尤其是，本发明提供了患者体内增加骨骼肌质量或功能的方法，其中这种增加是患者所希望的，该方法包括鉴定希望增加肌肉质量或功能的患者，并给该患者施用安全有效量的CRFR激动剂。
本发明还提供了药物组合物，该组合物包括安全有效量的CRF2R激动剂和可药用的载体。在一个特定实施方案中，该药物组合物包括对CRF2R有特异性的嵌合抗体或人体抗体。在另一个特定实施方案中，该药物组合物包括CRF或CRF类似物，优选urocortin II。
本发明也提供了用于CRF2R的抗体，尤其是为CRF2R激动剂的嵌合抗体或人体抗体。
本文参考了多种出版文献。这些出版文献以全文引入本文以供参考，以便更完整地描述本发明所涉及领域的技术状况。
序列列表描述表1中列出了各个CRFR核苷酸和蛋白质序列或在该序列表中包含的CRF类似物蛋白质序列，以及相应的Genbank或Derwent访问号码和由此克隆的动物种类。表1中同时列出了相关的核苷酸序列标识号，该核苷酸序列将相同的或几乎相同的氨基酸序列编码为在序列表中所示的序列。这些相关的序列主要在所示的5’或3’未翻译序列的量上不同。
表1


附图概述

图1说明了在小鼠的切除坐骨神经萎缩模型的腓肠内侧肌上，CRF1R/CRF2R激动剂-蛙皮降压肽(经皮下给药，每日2次)的抗萎缩效果。
图2说明了在小鼠的切除坐骨神经萎缩模型内的前胫骨肌上的蛙皮降压肽(通过微型渗透泵连续给药)抗萎缩效果。
图3A和3B说明了蛙皮降压肽(通过微型渗透泵连续给药)对于前胫骨肌(图3A)和腓肠内侧肌(图3B)的糖皮质素诱导的萎缩的抗萎缩效果。
图4A说明了蛙皮降压肽(经皮下给药，每天2次)对于前胫骨肌的固定诱导萎缩的抗萎缩效果和未固定(正常的)前胫骨肌的肥大诱导效果。图4B说明蛙皮降压肽对于腓肠内侧肌的固定诱导萎缩的抗萎缩效果和蛙皮降压肽对于未固定腓肠内侧肌的肥大诱导效果。
图5说明蛙皮降压肽和urocortin(通过微型渗透泵连续给药)对于在小鼠的切除坐骨神经诱导萎缩模型中的前胫骨肌的抗萎缩和肥大诱导效果。
图6A和6B说明了urocortin(经皮下给药，每天2次)对于前胫骨肌(图6A)和腓肠内侧肌(图6B)的废用性诱导萎缩的抗萎缩作用。
图7说明了蛙皮降压肽(经皮下给药，每天2次)在切除肾上腺的大鼠切除坐骨神经诱导的萎缩模型中对于前胫骨肌(图7A)、长指伸肌(EDL)(图7B)、比目鱼肌(图7C)、腓肠内侧肌(图7D)和跖肌(图7E)肌肉的切除神经诱导萎缩的效果。另外，蛙皮降压肽诱导未切除神经的EDL肌肉的肥大(图7B)。
图8说明了在小鼠切除坐骨神经萎缩模型中，蛙皮降压肽(通过微型渗透泵连续给药)对野生型小鼠的前胫骨肌有抗萎缩作用，但对切除CRF2R的小鼠没有作用。
图9A和B说明了在小鼠的腿固定废用萎缩模型中，蛙皮降压肽对EDL和比目鱼肌肌肉有抗萎缩效果，该效果是通过肌肉质量(图9A)或肌肉功能(图9B)测量的。
发明详述I.术语和定义下面列出本文所用术语的定义。
“激动剂”表示任意可活化受体的化合物，包括但不限于抗体。例如，CRFR激动剂包括但不限于CRF和CRF类似物。
“等位变体”表示给定的基因或基因产物的变体形式。本领域的普通技术人员可认识到，在群体中大量的基因存在有两种或多种等位形式，一些基因有许多等位形式。
“抗体”，在它不同的语法形式中，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有抗原结合位置的分子，该位置特定地结合抗原。“纯化抗体”是指已被部分或全部从蛋白质和与其天然联合的天然有机分子中分离出来的抗体。优选地，该制剂为以干重计的至少60％抗体、更优选至少75％抗体、更优选至少90％抗体，和最优选至少99％抗体。
“结合亲和性”是指配体与受体相互作用的倾向，与特定的CRF配体-CRFR的相互作用的解离常数成反比。该解离常数可通过标准的饱和、竞争性或动力学结合技术来直接测量，或通过包含功能分析和终点的药理技术间接测量。
“嵌合抗体”是指含有结构元件的抗体，该结构元件来自两个或多个不同的抗体分子，即来自不同的动物种类。嵌合抗体包括但不限于称之为“人化抗体”的抗体，该人化抗体包括但不限于通过已知的互补测定区域嫁接技术产生的嵌合抗体。
“CRF”是指与促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)相同的促肾上腺皮质激素释放因子。示例性的CRF肽包括r/h CRF和绵羊CRF，(参见美国专利4,415,558)等。
“CRF类似物”是指作为CRFR配体的物质。适合的CRF类似物可从多种脊椎类动物中得到，这些CRF类似物包括但不限于以下物质，例如蛙皮降压肽(参见，例如，美国专利4,605,642)、硬骨鱼紧张肽(参见，例如，美国专利4,908,352和4,533,654)、小鼠urocortin II(序列标识号43)、与人urocortin相关的肽(序列标识号44)(Reyes，T.M.等人，Proc.Nat’l AcadSci 982843-2848(2001))、urocortin(参见，例如，WO 97/00063)和记载于美国专利4,415,558、4,489,163、4,594,329、4,605,642、5,109,111、5,235,036、5,278,146、5,439,885、5,493,006、5663292、5,824,771、5,844,074和5,869,450中的CRF类似物，所有这些专利均引入本文以供参考。优选的CRF类似物为蛙皮降压肽、urocortin、与urocortin相关的肽、urocortin-II和硬骨鱼紧张肽。
“CRFR激动剂”是指能够激活CRF1R或CRF2R，或同时激活两者的化合物或分子。CRFR的活性可用下述方法测量。
“CRFR”是指CRF1R或CRF2R。
“CRF1R”是指来自任何动物种类的任意同工型CRF1R。CRF1R曾被称为CRF-RA、PC-CRF、CRF(参见Perrin，M.H.等人，Endocrinology 1333058-3061(1993)、Chen，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908967-8971(1993)、Chang，C-P.等人，Neuron111187-1195(1993)、Ki shimoto，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921108-1112(1995)和，Vita，N.等人，FEBS Lett.3351-5(1993))或被称为CRH受体。
CRF1R的定义包括但不限于那些编码该受体的cDNA或染色体组序列已被存入到序列数据库中的受体。这些序列包括下列访问号码X72304、E11431、L23332、I92584、T37068、T28968、Q81952、L23333、NM_004382、AF180301、T28970、L25438、L24096、I92586、Q81954、AH006791、NM_007762、X72305、AF054582、Y14036、AF229359、AF229361、AB055434和L41563。这些受体的核苷酸和蛋白质序列可从GenBank或Derwent得到，为了方便，本文在所附序列表中给出了代表性的序列。
“CRF2R”是指来自任意动物种类的任意同工型CRF2R。CRF2R也被称为HM-CRF、CRF-RB(参见Kishimoto，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921108-1112(1995)和Perrin，M.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 922969-2973(1995))。
CRF2R受体的定义包括但不限于那些编码该受体的DNA序列已被存入到序列数据库中的受体。这些序列包括下列访问号码U34587、E12752、NM_001883、T12247、T66508、AF011406、AF019381、U16253、T12244、T28972、U17858、NM_009953、Y14037和AF229360。这些受体的核苷酸和蛋白质序列可从GenBank或Derwent得到，为了方便，本文在所附的序列表中给出了代表性的序列。
术语“CRFR”也包括平截的和/或突变的蛋白质，其中配体结合或信号不需要的受体分子区域已被删除或修饰。例如，本领域的技术人员可认识到在主要的氨基酸序列中具有一个或多个保守变化的CRFR可适用于本发明。在本领域中已知，用类似结构或性质的不同的氨基酸取代一些氨基酸(保守取代)可导致沉默变化，即，没有显著功能改变的变化。保守取代在本领域中是众所周知的。例如，已知GPCR可容许用其它疏水氨基酸取代透膜α-螺旋中的氨基酸残基，并保持原来的功能，所述螺旋朝着脂质取向。由于平截和/或突变例如保守的氨基酸取代而不同于天然序列的CRF1R也被包括在CRF1R的定义中。由于平截和/或突变例如保守的氨基酸取代而不同于天然序列的CRF2R也被包括在CRF2R的定义中。
本领域的技术人员也能认识到，得自除了上述列出的动物之外的种类的CRFR，尤其是哺乳类动物，也适用于本发明。本领域的技术人员还能认识到，通过使用已知CRFR种类的序列的探针，cDNA或已知序列的染色体组序列同源物可通过已知的克隆方法从相同的或可替换的种类中得到。这些CRF1R也被包括在CRF1R的定义中，这些CRF2R也被包括在CRF2R的定义中。
另外，本领域的技术人员可认识到CRFR的功能性等位变体或功能性剪接变体可存在于特定的物种，这些变体可用于本发明。CRFR的剪接变体是已知的，例如美国专利5,888,811、5,786,203和5,728545，所有这些专利均引入本文以供参考。这些CRF1R变体也包括在CRF1R的定义中，这些CRF2R变体也包括在CRF2R的定义中。
CRF1R或CRF2R多肽或CRF1R或CRF2R多肽片段与非CRFR多肽的融合体被称为CRFR融合蛋白质。使用已知的方法，本领域的技术人员可以制得CRF1R或CRF2R的融合蛋白质，所述蛋白质尽管不同于天然的CRF1R和CRF2R，但是仍可用于本发明。例如，非-CRFR多肽可以是信号(或前导)多肽序列，该序列共同翻译或在后翻译指导蛋白质从它的合成部位转移到另一个部位(例如，酵母α-因子前导)。或者，可加入非CRFR多肽以便于CRFR(例如，聚-His或旗肽)的纯化或鉴定。CRF1R融合蛋白质也被包括在CRF1R的定义内，CRF2R融合蛋白质也被包括在CRF2R的定义内。
“CRF2R信号转换途径”是指任意信号途径(例如，cAMP、MAP激酶)或信号途径的组合，所述信号途径通过内源性配体或外源性配体与CRF2R的结合来调节。
“功能CRFR”是指可在体内或体外结合CRF或CRF类似物并由于配体结合而激活的CRFR。
“融合基因”是指可操作相连以便编码一个杂化蛋白的两个或多个DNA编码序列。“融合蛋白质”是指融合基因的蛋白质产物。
“抑制”是指部分或全部地阻断特定过程或活化。例如，化合物抑制了骨骼肌萎缩，只要它全部或部分地阻止肌肉萎缩。
本发明所使用的两个DNA序列为“可操作地连接”，只要在这两个DNA序列之间的连接性质不会(1)导致诱发移码突变，(2)干扰启动子区域指导转录编码序列的能力，或(3)干扰翻译为蛋白质的相应RNA的转录能力。例如，编码序列和调节序列为可操作地连接，只要它们以某个方式进行共价连接，以使得编码序列的转录受到调节序列的影响或控制。因此，启动子区域与编码序列为可操作地连接，只要该启动子区域能够影响DNA序列的转录，使得所得的转录能被转化为所需的蛋白质或多肽。
“一致百分率”是指两个序列具有共同的核苷酸或氨基酸的百分率，计算如下。为了计算特定序列(查询)的一致百分率，将查询序列的相关部分与对照序列相比较，使用BestFit比较计算机程序，Wisconsin Package，Version 10.1，得自the Genetics Computer Group，Inc.。这个程序使用Smith和Waterman算法，Advances inApplied Mathematics，第2期482-489(1981)。一致百分率使用如下的默认参数进行BestFit程序计算计分矩阵为blosum62.cmp，间隙生成罚分为8，间隙延伸罚分为2。当将一个序列和对照序列比较时，该查询序列的相关部分为来自CRFR序列的部分。例如，当查询CRFR/纯化标记融合蛋白质时，只有该序列的CRFR多肽部分被排列以计算一致百分率得分。
“多肽”是指任意氨基酸链，不考虑长度或后翻译改性(例如，磷酸化或糖基化)。
“启动子”是指从基因或编码区域控制转录起始和转录速度的DNA序列。
“预防治疗”是指对患者的预防处理，以便能全部或部分阻滞骨骼肌萎缩的发生，该患者目前未表现出骨骼肌萎缩信号。本领域的技术人员可认识到，某些个体易于产生骨骼肌萎缩，如本文发明背景部分所讨论的。另外，本领域的技术人员可认识到，如果导致骨骼肌萎缩的生化变化被适当地调节，则在有潜伏危险的个体中萎缩的发生会被阻止或减少。例如，用皮质类固醇开始治疗的肌营养不良的病人易于形成骨骼肌萎缩，说明对这些病人进行预防性治疗是适当的。
“调节”，在它的所有语法形式中，是指增加、降低或保持，例如，调节骨骼肌质量或功能是指增加、降低或保持骨骼肌质量或功能水平。
“骨骼肌质量或功能的调节”包括调节骨骼肌质量、骨骼肌功能或两者。
“调节元件”是指能够控制可操作地连接的DNA序列的转录水平的DNA序列。调节元件的定义还包括启动子和增强子。例如，CRFR基因调节元件为能够控制CRFR基因的转录水平的DNA序列。
“报道基因”是指其产物可被检测，优选可被定量检测的编码序列，其中该报道基因与可响应所要测量的信号的异种启动子或增强子元件可操作地连接。本文中的启动子或增强子元件称为“响应元件”。
“选择性激动剂”是指与其它受体相比，该激动剂对于某一(或某些)受体具有显著较大的活性，但不是指它对于其它受体完全没有活性。
“骨骼肌肥大”是指骨骼肌质量的增加或骨骼肌功能的增加或两者的增加。
“骨骼肌萎缩”与“肌肉损耗”意思相同，是指骨骼肌质量减少或骨骼肌功能减少或两者的减少。
“剪接变体”是指由于使用可替换外显子而产生的mRNA或蛋白质。本领域的技术人员可认识到，根据细胞类型，或者甚至在单一的细胞类型中，mRNA可以以不同的形式表达为剪接变体，由此，所翻译的蛋白质将根据所表达的mRNA而有所不同。
物质的“有效治疗量”是指能对受治疗的病人产生所希望的医学效果的量，例如，降低骨骼肌萎缩、增加骨骼肌质量或增加骨骼肌功能，并具有可接受的有益效果风险率；可用于人或人类以外的哺乳动物。
“治疗学治疗”是指对希望增加其肌肉质量或肌肉功能的患者的治疗。例如，治疗目前具有骨骼肌萎缩信号的患者，以便部分或全部地逆转已发生的骨骼肌萎缩，或全部或部分阻滞骨骼肌萎缩的进一步发生，这种治疗就是对该患者的治疗学治疗。术语“治疗学治疗”也包括，例如，治疗没有骨骼肌萎缩信号的患者以使其骨骼肌肥大，例如，治疗家畜类动物以增加肌肉质量。
术语“治疗”是指预防性治疗或治疗学治疗。
除非另有说明，本发明所使用的所有技术和科学术语与在蛋白质化学、药理学、分子生物学领域的普通技术人员所理解的意思相同。本发明所述的方法、物质和实施例不是限制性的。与本发明所述类似或等效的其它方法和物质可用于实际或试验本发明。
II.CRFR存调节骨髂肌质量中的作用基于现有技术和下面的公开内容，本领域的技术人员可认识本发明的实用性。本发明所述的结果表明，施用可活化CRF1R和CRF2R(非选择性CRFR激动剂)的CRF受体激动剂阻滞了和/或抑制了在骨骼肌萎缩模型中由于切除神经、废用或地塞米松治疗而引起的骨骼肌萎缩诱导效应。另外，数据表明CRFR激动剂没有显示切除CRF2R小鼠的抗萎缩效果。同样地，在通过由于切除肾上腺(外科肾上腺切除术)而使其CRF1R调节的HPA轴已被阻断的大鼠中，用非选择性CRFR激动剂对这些动物的治疗显示了抗萎缩效果，说明CRF2R调节了抗萎缩效果。另外，结果表明，施用非选择性CRFR激动剂显示了肥大诱导效应。总之，这些数据表明CRF2R在骨骼肌萎缩过程中的调节作用。使用药物试剂-蛙皮降压肽(BachemBiosciences，Inc.King of Prussia，PA)和urocortin(Bachem Biosciences，Inc.)研究了CRFR在体内的具体作用，所述药物试剂为在骨骼肌萎缩的不同模型中的CRFR选择性激动剂，下面将具体描述。这些试剂已在科学文献中进行了完好的特征说明和描述。
图1至7和图9显示了实验结果，表明施用CRFR选择性激动剂可导致骨骼肌萎缩在统计上的显著抑制。图8显示CRFR激动剂、蛙皮降压肽的抗萎缩效果通过CRF2R来调节。CRFR激动剂与磷酸二酯酶抑制剂、茶碱的组合每日施用两次，可在骨骼肌萎缩的动物模型中产生骨骼肌萎缩抑制。加入茶碱以加强CRFR激动剂的作用持续时间和作用大小，从而产生这些化合物的增强效力。在这些萎缩模型中单独施用茶碱没有任何效果，这说明CRFR激动剂与茶碱的抗萎缩效果是CRFR激动剂所产生的。另外，在没有茶碱的情况下，通过微型渗透泵连续施用CRFR激动剂也会产生骨骼肌萎缩抑制和/或骨骼肌肥大。使用ANCOVA(DouglasC.Montgomery，Design and Analysis of Experiments，John Wiley和Sons，New York(第二版，1984))来确定结果的统计学重要性。在图1至9中所使用的缩写g-克；SEM-标准平均值误差。
具体地讲，图1显示了在小鼠的切除坐骨神经萎缩模型中蛙皮降压肽抑制了腓肠内侧肌的固定神经诱导的萎缩。图例A-生理盐水(对照物)；B-蛙皮降压肽(0.01mg/kg)+茶碱；C-蛙皮降压肽(0.03mg/kg)+茶碱；D-蛙皮降压肽(0.1mg/kg)+茶碱；E-蛙皮降压肽(1.0mg/kg)+茶碱；*-p≤0.05与盐水相比。在切除右坐骨神经后，雄性小鼠以上述剂量在肩胛部每日两次经皮下注入蛙皮降压肽，或注入载体对照物(生理盐水)，连续9天。蛙皮降压肽与30mg/kg茶碱共同给药。在第九日，摘除腓肠内侧肌，称重，以确定萎缩程度。
图2显示在小鼠切除坐骨神经萎缩模型中蛙皮降压肽抑制了前胫骨肌的切除神经诱导的萎缩。图例A-水(对照物)；B-蛙皮降压肽(0.1mg/kg/d)；C-蛙皮降压肽(0.3mg/kg/d)；D-蛙皮降压肽(1.0mg/kg/d)；*-p≤0.05与水相比较。在切除右坐骨神经后，对雄性小鼠使用蛙皮降压肽或载体对照物(生理盐水)，利用Alzet微型渗透泵以5μl/小时的速度连续注入，直至实验结束(没有附加的茶碱)。每日所输入的的蛙皮降压肽剂量如上所述。在切除坐骨神经时植入微型泵。在第九日，摘除前胫骨肌，称重，确定萎缩程度。
图3表明在该小鼠糖皮质素诱导的萎缩模型中，蛙皮降压肽抑制了前胫骨(图3A)和腓肠内侧肌(图3B)的糖皮质素诱导的肌肉萎缩。图例A-只有水，在饮用水中没有地塞米松(没有萎缩的对照物)；B-水+地塞米松(萎缩的对照物)；C-蛙皮降压肽(0.1mg/kg/d)+地塞米松；D-蛙皮降压肽(0.3mg/kg/d)+地塞米松；E-蛙皮降压肽(1.0mg/kg/d)+地塞米松；*-p≤0.05与水相比较；#-p≤0.05与水+地塞米松相比较。在加入糖皮质素-地塞米松至饮用水后(1.2mg/kg/d)后，利用Alzet微型渗透泵以5μl/小时的速度连续注入，对雄性小鼠使用上述试剂或载体对照物(生理盐水)，直至实验结束(没有附加茶碱)。每日施用的蛙皮降压肽剂量如上所述。在开始加入地塞米松时进行微型泵移植。在开始施用一定剂量的蛙皮降压肽9天后，摘除腓肠内侧肌和前胫骨肌，称重，测定萎缩程度。
图4表明蛙皮降压肽抑制了前胫骨肌(图4A)和腓肠内侧肌(图4B)的废用诱导的萎缩。另外，也可观察到，利用蛙皮降压肽治疗非固定腿的腓肠内侧肌和前胫骨肌在统计上显著肥大。图例A-生理盐水(对照物)；B-茶碱；C-蛙皮降压肽(0.03mg/kg)+茶碱；D-蛙皮降压肽(0.1mg/kg)+茶碱；E-蛙皮降压肽(0.3mg/kg)+茶碱；*-p≤0.05与盐水比较。在固定右后腿后，雄性小鼠在中肩胛部经皮下注入蛙皮降压肽或载体对照物(生理盐水)，每日两次，连续10天，按照已说明的剂量注入。蛙皮降压肽与磷酸二酯酶抑制剂茶碱(30mg/kg)共同注入到腹膜内，每日两次。在第十天，摘除腓肠内侧肌和前胫骨肌，称重，确定萎缩程度。
图5表明在小鼠切除坐骨神经萎缩模型中，蛙皮降压肽和urocortin抑制了前胫骨肌的切除神经诱导的萎缩。另外，利用urocortin治疗时，可观察到没有切除神经的腿的肥大。图例A-水(对照物)；B-蛙皮降压肽(1mg/kg/d)；C-urocortin(1.0mg/kg/d)；*-p≤0.05与水相比较。在切除右坐骨神经后，利用Alzet微型渗透泵以5μl/小时的速度连续注入，对雄性小鼠使用上述试剂或载体对照物(生理盐水)，直至实验结束(没有附加茶碱)。每日施用的试剂剂量如上所述。在切除坐骨神经的同时进行微型泵移植。在第九天，摘除前胫骨肌，称重，确定萎缩程度。
图6表明在小鼠的腿固定废用萎缩模型中，urocortin抑制了废用诱导的前胫骨(图6A)和腓肠内侧肌(图6B)肌肉萎缩。图例A-生理盐水(对照物)；B-urocortin(0.3mg/kg)+茶碱；*-p≤0.05与盐水比较。在固定右后腿后，在雄性小鼠中肩胛部经皮下注入urocortin或载体对照物(生理盐水)，每日两次，连续10天，按照已说明的剂量注入。Urocortin以图6A和6B中所示的剂量施用。Urocortin与磷酸二酯酶抑制剂茶碱(30mg/kg)共同注入到腹膜内，每日两次。在第十天，摘除腓肠内侧肌和前胫骨肌，称重，确定萎缩程度。
图7表明蛙皮降压肽抑制了切除神经诱导的前胫骨(图7A)、EDL(图7B)、比目鱼肌(图7C)、腓肠内侧肌(图7D)和跖肌(图7E)肌肉的萎缩。另外，蛙皮降压肽导致没有切除神经的EDL肌肉(图7B)在统计上的显著肥大。图例A-生理盐水(对照物)；B-蛙皮降压肽(0.003mg/kg)+茶碱；C-蛙皮降压肽(0.01mg/kg)+茶碱；D-蛙皮降压肽(0.03mg/kg)+茶碱；#-p≤0.05与相应的对照物比较。在切除右坐骨神经后，在切除肾上腺的雄性大鼠(切除肾上腺的大鼠用于消除HPA轴经过CRF1R激动剂活化的骨骼肌萎缩诱导效应)的中肩胛部经皮下注入蛙皮降压肽或载体对照物(生理盐水)，每日两次，连续9天，剂量如上所述。蛙皮降压肽与30mg/kg茶碱共同注入。在第九天，摘除前胫骨、长指伸肌(EDL)、比目鱼肌、腓肠内侧肌和跖肌肌肉，称重，确定萎缩程度。
图8表明在切除小鼠坐骨神经萎缩模型中，蛙皮降压肽抑制了观察到的野生型的但没有切除CRF2R的小鼠的萎缩。图例A-C-野生型小鼠；D-F-切除CRF2R型小鼠。A和D-水(对照物)；B和E-蛙皮降压肽(0.3mg/kg/d)；C和F-蛙皮降压肽(1.0mg/kg/d)；*-p≤0.05与盐水比较。在切除右坐骨神经后，利用Alzet微型渗透泵以5μl/小时的速度连续注入，对雌性野生型和切除CRF2R型小鼠施用蛙皮降压肽或载体对照物，每日给药剂量如上所述。在第九天，摘除前胫骨肌，称重，确定萎缩程度。
图9表明通过在小鼠腿的固定废用型萎缩模型中的绝对力测量(图9B)来评估，蛙皮降压肽抑制了EDL和比目鱼肌肌肉质量(图9A)的废用诱导损耗，并抑制了肌肉功能的损失。图例A-没有固定的肌肉对照物；B-固定的肌肉、盐水对照物；C-固定的肌肉、蛙皮降压肽(0.3mg/kg)+茶碱(30mg/kg)；*-p≤0.05与盐水比较。在固定右后腿后，在雄性小鼠的中肩胛部经皮下注入urocortin或载体对照物(生理盐水)，每日两次，连续10天，注入剂量如上所述。蛙皮降压肽与30mg/kg茶碱共同使用。在第十天，摘除EDL和比目鱼肌肌肉，测量绝对力和质量，确定萎缩程度。
III.CRFR、CRF或CRF类似物、或表达CRFR的细胞系的制备CRF1R、CRF2R、CRF和CRF类似物可制备用于多种用途，包括但不限于抗体的产生、用作在本发明的筛选鉴定中的试剂和用作治疗骨骼肌萎缩的药物试剂。对于本领域的技术人员显而易见的是，在本发明的某些实施方案中，纯化多肽将是最有用的，而在其它实施方案中，表达多肽的细胞系是最有用的。例如，在保持CRFR的结构和功能性质是很重要的情况下，例如在鉴定活化CRFR的候选化合物的筛选方法中，希望使用表达功能CRFR的细胞。
因为CRF和CRF类似物为短链多肽，有经验的技术人员将认识到，使用本领域已知的技术通过直接合成，而不是通过重组方法，可以最方便地制得这些多肽。另外，这些分子中有许多可以商购。
当CRFR的原料是表达多肽的细胞系时，该细胞可以，例如，内源性地表达CRFR，被刺激以增加内源性的CRFR表达，或从遗传工程上改造来表达CRFR。测定细胞系是否表达相关多肽的方法是本领域已知的，例如，利用适当的抗体来检测多肽、使用DNA探针来检测编码蛋白质的mRNA(例如，RNA印迹或PCR技术)，或测量所选择的试剂对相关多肽的结合(例如，放射性同位素示踪的选择性激动剂)。
利用重组DNA技术制备CRF1R、CRF2R或表达这些多肽的细胞系是尤其希望的。这些重组方法是本领域众所周知的。为了表达重组CRF1R或CRF2R，制备表达载体，该表达载体包括在一个或多个调节元件的控制下编码相关多肽的核酸。编码得自几个物种的CRF1R和CRF2R的染色体组或cDNA序列已被描述，且易于从GenBank数据库(网址为<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>)或Derwent数据库(网址为<http://www.derwent.co.uk/geneseq/index.html>)以及本申请的附加序列表得到。CRF1R和CRF2R序列标识号和相应的序列标识号列于表1。利用这些可公开获得的序列信息，分离编码CRF1R或CRF2R的核酸分子的一种方式是通过使用本领域众所周知的方法，例如，通过在适当数据库中的序列的PCR放大，利用天然的或人工合成的DNA探针来筛选染色体组DNA或cDNA库。另一种方法是利用对相关受体有特异性的低聚核苷酸引物，直接从由特定组织(例如骨骼肌)分离出来的mRNA中来PCR放大cDNA。这些分离的mRNA可商购获得。本领域的技术人员也可认识到通过使用相应于已知的CRFR受体序列的部分的核酸探针，来自其它物种的同源cDNA或染色体组序列可用已知的方法得到。尤其适用于本发明的方法为来自下列物种的CRFR受体，这些物种包括但不限于人、小鼠、大鼠、猪、猴、黑猩猩、狨猴、狗、牛、羊、猫、鸡和火鸡。通过本领域众所周知的方法，分离的编码相关CRFR的核酸分子被连接到适合的表达载体。所制得的表达载体在一个宿主细胞中被表达，表达该受体的宿主细胞直接用于筛选鉴定，或者该受体从表达该受体的宿主细胞中分离出来，所分离的受体用于筛选鉴定。
可用于本发明目的的宿主表达载体系统包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或包含CRFR核苷酸序列的粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；利用包含CRFR核苷酸序列重组酵母表达载体转化的酵母(例如，植酵母、毕赤氏酵母属(Pichia))；用包含CRFR核苷酸序列重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)感染的或用包含CRFR核苷酸序列重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包括重组表达结构并同时包含CRFR核苷酸序列的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、HEK293、NIH3T3)，该重组表达结构包含衍生自哺乳动物细胞(例如，金属硫蛋白启动子)的基因组的或衍生自哺乳动物病毒(例如，反转录病毒LTR)的启动子。
该宿主细胞用于产生相关的多肽。因为CRFR为膜结合分子，所以它从宿主细胞膜中被纯化，或者，CRFR以固定在细胞膜内的方式被利用，即，利用整个细胞或细胞的膜片段。通过本领域的技术人员众所周知的方法，使用适当的洗涤剂和脂微胶粒从这些表达系统中纯化或富集CRFR。
在细菌系统中，许多表达载体可被有利地挑选，这取决于被表达的基因产物的用途。例如，当生产大量的这些蛋白质以产生CRFR抗体时，希望使用可指导高含量蛋白质产物的表达的载体。通过许多方法，这些方法包括选择性纯化技术，例如融合蛋白质选择柱和抗体柱，以及非选择性纯化技术，本领域的技术人员可制得这些载体结构并纯化蛋白质。
在昆虫蛋白质表达系统中，杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)被用作在秋粘虫细胞中表达外源基因的载体。在这种情况下，CRFR核苷酸序列被克隆到病毒的非必需区，并处于AcNPV启动子的控制之下。重组病毒用于感染细胞，其中所插入的基因被表达，并通过本领域的技术人员熟知的许多技术中的一种来纯化蛋白质。
在哺乳动物宿主细胞内，可以利用许多基于病毒的表达系统。这些表达系统的利用通常需要在载体中产生特定起始信号以有效翻译插入的核苷酸序列。如果使用了一部分不含有内源性起始信号的CRFR基因，这种特定起始信号的产生是尤其重要的。通过本领域的技术人员所知的许多技术中的一种，可在具有插入的核苷酸序列的编码区域的框架内放置起始信号，以及加入转录和翻译加强元件，和纯化重组蛋白质。对于哺乳动物宿主细胞，选择适当的细胞类型也是很重要的，以便能对重组蛋白质进行必要的翻译后修饰。这些修饰，例如，卵裂、磷酸化、糖基化等，需要选择含有改性酶的适当宿主细胞。这些宿主细胞包括但不限于CHO、HEK293、NIH3T3、COS等，它们是本领域的技术人员已知的。
对于重组蛋白质长期的高表达，稳定的表达是优选的。例如，稳定表达CRFR的细胞系可被改造。本领域的技术人员，根据已知的方法，例如电穿孔、磷酸钙转染或脂质体调节的转染，可以制得能稳定表达CRFR的细胞系。这通常通过使用表达载体转染细胞来完成，该表达载体含有适当的表达对照元件(例如，启动子序列、增强子序列、转录终止序列、聚腺苷酰作用部位、翻译起始部位等)、可选择的标记物、相关的基因。可选择的标记物可以包含在与相关基因相同的载体内，或在单独的载体上，该标记物与包含载体的CRFR序列被共同转染。在表达载体内的可选择的标记物可能不利于选择，使得细胞稳定地把载体结合到它们的染色体内，并生长形成转化灶，该转化灶可被克隆并扩大进入细胞系。或者，该表达载体可允许利用标记物的物理性质来选择表达可选择的标记物的细胞，即，绿色荧光蛋白质(GFP)的表达允许使用荧光活化的细胞分选(FACS)分析来选择表达标记物的细胞。
本领域的技术人员能选择适当的细胞类型进行转染，以便选择已成功结合相关基因的细胞。例如，当可选择的标记物为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶，或腺嘌呤转磷酸核糖基酶时，适当的细胞类型分别是tk-、hgprt-或aprt-细胞。或者，可使用正常细胞，只要可选择的标记物为dhfr、gpt、neo或hygro，它们分别将耐性赋予氨甲喋呤、霉酚酸、G-418或潮霉素。这些重组细胞系可用于鉴定影响CRFR活性的候选化合物。
IV.CRFR抗体的制备选择性识别CRFR的一个或多个表位的抗体也包括在本发明内。这些抗体包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人体抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、使用Fab表达库产生的分子、在基因转录小鼠内产生的人体抗体(多克隆或单克隆)以及任意一种上述物质的表位结合片段。对于治疗用途，优选嵌合抗体或人体抗体，最优选人体抗体。
抗体可与本发明所述的化合物筛选方案结合使用，用于评估试验化合物，例如，固定CRFR多肽，或者这些抗体可与基因治疗技术结合使用，来评价，例如，CRFR在细胞或直接在已引入这些基因的病人组织内的表达。另外，本发明的抗体可用于治疗骨骼肌萎缩。对CRFR有选择性的抗体可用本发明的方法筛选以鉴定作为CRFR激动剂的抗体的子集。另外，与对CRF或CRF类似物有特异性的抗体相对产生的抗独特型抗体可用作CRFR激动剂，类似的抗CRFR的抗体可以通过本发明的方法以它们的性质进行筛选来活化CRFR。
为生产抗体，利用本领域众所周知的方法，通过注入CRFR、CRF或CRF类似物、抗CRF抗体、抗CRF类似物抗体、或其免疫片段，使多种宿主动物免疫。为了制备抗独特型抗体，免疫原为抗CRF抗体或抗CRF类似物抗体。抗独特型抗体的制备记载于，例如，美国专利4,699,880，该专利引入本文以供参考。适合的宿主包括但不限于兔、小鼠、山羊、绵羊和马。免疫技术是本领域所熟知的。多克隆抗体可从免疫动物的血清中纯化，或者，单克隆抗体可通过本领域众所周知的方法来产生。这些技术包括但不限于众所周知的Kohler和Milstein的杂交瘤技术、人体B-细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤细胞技术。单克隆抗体可以是任意的免疫球蛋白类，包括包含κ或λ轻链的IgG、IgE、IgM、IgA和IgD。
由于在人体内非人体抗体的免疫原性，当用于人类病人的治疗学治疗时，嵌合抗体优选为非人体抗体。制备和使用嵌合抗体的技术是本领域已知的，记载于例如，美国专利5,807,715、4,816,397、4,816,567、5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762、6,180,370和5,824,307，所有这些专利均引入本文以供参考。
完全的人体抗体是尤其优选的，用于治疗学治疗人类病人，因为它们比人类之外的抗体或嵌合抗体有较少的免疫原性。这些抗体可使用转基因小鼠制备，所述转基因小鼠基本不能表达内源性免疫球蛋白的重链和轻链基因，但可以表达人的重链和轻链基因。转基因小鼠在正常方式下是免疫的，具有选择的抗原，例如，所有或部分CRF2R。针对抗原的单克隆抗体可通过常规的杂交瘤技术从这些免疫的转基因小鼠中得到。该技术已详细记载于美国专利5,874,299、5,877,397、5,569,825、5,661,016、5,770,429和6,075,181中，所有这些专利均引入本文以供参考。作为直接由培养杂交瘤细胞得到人免疫球蛋白的可替换物，杂交瘤细胞可用作随后的表达或遗传操作的重排重链和轻链位置的来源。可直接从这些产生抗体的细胞中分离基因，因为可得到高含量的适合mRNA。恢复的重排位置可按需处理。例如，该恒定区可被消除，或与不同的同工型区交换，或者可连接可变区用于编码单链Fv区域。这些技术记载于WO 96/33735和WO96/34096，所有这些专利均引入本文以供参考。
V.试验化合物的选择根据本发明的鉴定可被筛选的化合物包括但不限于已知的化合物库，包括天然产物，例如植物或动物提取物、合成化学制剂、生物活性物质，包括蛋白质、肽，例如可溶解的肽，包括但不限于随机肽库的组分、和由D-或L-构型氨基酸组成的组合化学衍生的分子库、磷酸肽(包括但不限于随机的或部分简并的定向磷酸肽库的组分)、抗体(包括但不限于多克隆的、单克隆、嵌合的、人的、抗独特型或单链的抗体，和Fab、F(ab’)2和Fab表达库片段，及其结合表位的片段)、有机的和无机的分子。
除了测试化合物的较多传统来源外，计算机模拟和查询技术容许利用来自CRFR的配体结合部位或已鉴定的CRFR激动剂的结构信息来合理搜索测试化合物。对于测试化合物的这些合理搜索可降低为鉴定候选治疗化合物必须筛选的试验化合物的数目。CRFR为GPCR，因此了解CRFR蛋白质序列有助于产生结合部位模型，用于筛选可能的配体。这个过程可通过本领域熟知的方式来完成。简而言之，最强的方法包括产生CRFR序列与模板(衍生自细菌视紫质或视紫质晶体结构或其它GPCR模型)的序列对比、氨基酸结构的转化和通过分子力学和表观鉴定来改进模型。如果不能得到强序列对比，那么通过建立疏水螺旋模型也可产生模型。由已知的视紫质结构的总体设计开始旋转和翻译相对其它螺旋的各个螺旋，可将这些螺旋拟合到一起。指向残余物-残余物接触的突变数据也可用于定位彼此相对的螺旋，以便实现这些接触。在这个过程中，通过利用稳定配体结合的相互作用，将已知的配体对接至在螺旋内的结合部位空穴也有助于定位该螺旋。利用分子力学的完善作用和使用标准同源模拟技术对细胞内的和细胞外的环式建模，可以完成该模型。关于GPCR结构和模拟的一般信息参见Schoneberg，T.等人，Molecular and Cellular Endocrinology，151181-193(1999)、Flower，D.，Biochimica et Biophysica Acta，1422207-234(1999)和Sexton，P.M.，Current Opinion in Drug Discovery and Development，2(5)440-448(1999)。
一旦该模型完成后，可结合利用现有的几个计算机程序之一来缩小按照本发明的筛选方法要筛选的化合物的数目。这些程序中最常用的是DOCK程序(UCSFMolecular Design Institute，533Parnassus Ave，U-64，Box 0446，SanFrancisco，California 94143-0446)。在它的几个改进程序中，可以筛选商用的和/或专利的化合物的数据库，用于对结合部位进行空间拟合和粗糙的静电力互补。经常发现在DOCK中得分良好的分子易于成为配体。可使用的另一个程序是FLEXX(Tripos Inc.，1699 South Hanley Rd.，St.Louis，Missouri，63144-2913(www.tripos.com))。这个程序比DOCK程序运行缓慢得多，通常局限用于搜索较小的化合物数据库。在FLEXX程序内的计分方案更详细，通常比DOCK给出更好的结合性估计值。FLEXX程序最好用于确认DOCK程序的建议，或检查由已知的配体或模板组合生成的化合物库。
VI.鉴别可调节骨骼肌质量或功能的候选化合物的筛选鉴定CRF2R在调节骨骼肌萎缩中起作用，这个发现有助于用多种方法来筛选一个或多个试验化合物以鉴定候选化合物，所述候选化合物最后可用于预防性或治疗学治疗骨骼肌萎缩。根据化合物结合CRF2R、活化CRF2R、延长或增大CRF2R或CFR2R信号转换途径的激动剂诱导活化或增加CRF2R或CRF基因的表达的性质，本发明提供了筛选试验化合物的方法。
因为CRF2R和CRF1R为同源蛋白质，期望一定比例的CRF2R激动剂也能用作CRF1R激动剂。正如上述讨论的，CRF1R的活化导致HPA轴的活化和皮质类固醇的伴随生成。在希望增加肌肉质量或功能的大多数情况下，不希望活化HPA轴。因此，除了筛选能活化CRF2R的试验化合物，本发明也提供了使用CRF2R和CRF1R来筛选CRF2R的选择性激动剂。当选择用于治疗急性或慢性肌肉萎缩的候选化合物时，所述肌肉萎缩与肌营养不良无关，优选候选化合物对CRF2R有选择性。优选地，该候选化合物具有10倍的CRF2R比CRF1R的选择性(即，针对CRF2R的活性比针对CRF1R的活性高10倍以上)、更优选地为100倍的选择性、最优选地为1000倍或更大的选择性。因为已公开的研究表明了皮质类固醇疗法在治疗肌营养不良方面的优点，所以当用于肌营养不良时，保留一定程度的CRF1R激动性的CRF2R激动剂可能是有益的。因此，为了治疗肌营养不良，优选具有较低选择性的化合物，其在同样的浓度范围内可以活化CRF2R和CRF1R。优选地，该候选化合物有100倍的CRF2R对CRF1R的选择性、更优选地10倍选择性，和最优选地对CRF2R对CRF1R没有选择性(即，候选化合物的活性对于CRF2R和CRF1R是基本相似的)。同样地，在这种情况下，化合物更优选对CRF2R为完全激动剂，而对CRF1R为部分激动剂。因此这样的候选化合物对于氢化可的松增加的最大程度和对肌肉萎缩的可能效果具有内在局限性，尽管通过增加剂量可增强CRF2R调节的抗萎缩效果。显而易见，本领域的技术人员可使用本领域已知的方法来确定候选化合物是否为CRF1R或CRF2R的完全或部分激动剂。
为了筛选通过CRF2R最终用于调节人的骨骼肌质量或功能的化合物，优选地使用带有与序列标识号10有80％以上相同的氨基酸序列的CRF2R开始体外筛选，更优选地与序列标识号10有90％以上相同。更优选地，试验化合物可针对人、小鼠或大鼠的CRF2R来筛选，最优选的为人类CRF2R。为了筛选通过CRF2R最后用于调节人类之外的物种的骨骼肌质量或功能的化合物，优选使用来自需要治疗的物种的CRF2R。
为了筛选确定试验化合物或候选化合物对于CRF1R的活化量，以确定，如果有的话，候选化合物具有的CRF2R比CRF1R的选择性，优选使用具有与序列标识号2有80％以上相同的氨基酸序列的CRF1R开始筛选，更优选地与序列标识号2有90％以上相同。更优选地，该试验化合物将针对人、小鼠或大鼠的CRF1R筛选，其中最优选人类CRF1R。为了筛选最后用于调节非人类物种的骨骼肌质量或功能的化合物，优选使用来自需要治疗的物种的CRF1R。
本发明的方法可修改以进行高产量应用，但是，在该方法中，少至一种的试验化合物的使用也包括在术语“筛选”中。由本发明的方法所测定的，结合CRF2R、活化CRF2R、延长或增大激动剂诱导的CRF2R或CRF2R信号转换途径的活性，或增加CRF2R或CRF基因表达的试验化合物在本文中称为“候选化合物”。这些候选化合物可用于调节骨骼肌质量或功能。但是，更典型地，第一级体外筛选提供了一种用于选择较窄范围内的化合物即候选化合物的方式，该候选化合物有利于在其它的筛选层次上进行进一步的研究。有经验的技术人员可认识到，利用本发明来从一组由一个或多个试验化合物中鉴定化合物的子集，进行下一步研究。本领域的技术人员也可认识到，本发明的鉴定方法可用于排列相对于其它候选化合物的特定候选化合物的可能有用性。例如，以1000nM(但不是以10nM)活化CRF2R的候选化合物比以10nM活化CRF2R的候选化合物的作用小。使用这些信息，有经验的技术人员可选择在第一级筛选中鉴定的候选化合物的子集，进行下一步的研究。仅通过实施例的方法，以小于200nM的浓度活化CRF2R的化合物可以进一步在骨骼肌萎缩的动物模型中试验，反之，超过上述阈值的化合物不会进行进一步试验。有经验的技术人员也可认识到，根据如何选择一组试验化合物和如何选择正确的化合物，仅有一部分试验化合物被鉴定为候选化合物，这个比例可能是非常小的。
以下所述的鉴定系统可用于配制包括CRF2R或表达CRF2R的细胞的工具包，该工具包可打包用于多种容器，例如管形瓶、管子、微量滴定的孔板、瓶子等。其它试剂可被包括在独立的容器中，与工具包一起提供，例如，阳性对照样品、阴性对照样品、缓冲液和细胞培养介质。
在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选一个或多个试验化合物的方法，以鉴定结合CRF2R的候选化合物。测定化合物与受体结合的方法是本领域熟知的。典型地，鉴定方法包括如下步骤用标记的化合物来培养CRF2R源，该化合物已知与受体结合，在存在或不存在试验化合物的情况下，测定结合的标记化合物的量。CRF2R的来源可以是表达CRF2R的细胞，或某一形式的分离的CRF2R，如本发明所述。标记化合物可以是标记的CRF或任意CRF类似物，使得它可以被测量，优选定量测量(例如，125I标记的、铕标记的、荧光素标记的、GFP标记的、35S-甲硫氨酸标记的)。这些标记方法是本领域所熟知的。结合CRFR的试验化合物使结合到受体的标记配体减少，从而与对照样品相比减少了信号水平(没有试验化合物的情况)。这种技术的修改已被公开，其中在有和没有G-蛋白质解偶联剂的情况下的受体结合可将激动剂从拮抗剂中区分开(例如，在有或没有鸟嘌呤核苷酸类似物，即，GpppNHp下的结合)。参见Keen，M.，Radioligand BindingMethods for Membrane Preparations and Intact cells inReceptor Signal Transduction Protocols，R.A.J.Challis，(ed)，Humana Press Inc.，Totoway N.J.(1997)。
因为希望鉴别可特定结合CRF2R(与CRF1R相比)的化合物，因此应使用仅表达CRF2R的细胞或细胞膜来实施上述鉴定，或者该鉴定可利用CRF2R的重组源进行。表达两种形式的CRFR的细胞可使用同源重组来修饰，以使CRF1R基因失活或者失效。或者，如果CRFR源包含多种CRFR类型，由不相关的受体产生的背景信号必须从在鉴定中得到的信号中消除。可通过许多方法测定背景响应，包括通过使用反义、抗体或选择性拮抗剂来消除不相关的CRFR的信号。已知的CRFR拮抗剂包括antalarmin(CRF1R选择性)、抗蛙皮降压肽-30(CRF2R选择性)和astressin(对CRF1R或CRF2R没有选择性)。
在另一个实施方案中，本发明提供了筛选试验化合物的方法以鉴定可活化CRF2R和/或CRF1R的候选化合物。典型地，鉴定方法基于细胞；但是，不含细胞的鉴定方法也是已知的，它们能区别上述的激动剂和拮抗剂结合。基于细胞的鉴定方法包括以下步骤将表达CRF1R或CRF2R的细胞与试验化合物或对照化合物接触，通过测量CRFR信号转换途径的组分的表达或活性来测量CRFR的活性。
正如在上文的背景部分所述的，CRFR似乎通过几种不同的途径来偶联，这些途径包括Gαs、Gαq或Gαi，这取决于细胞类型。据认为，CRFR的激动剂活化使得受体通过这些途径中的任意一种发出信号，只要必需的途径组分存在于特定的细胞类型中。因此，为了CRFR活化筛选，鉴定方法可使用信号转换途径中的任意一种作为示值读数，即使在体内治疗用的相关细胞类型通过不同的途径将CRFR与骨骼肌萎缩偶联。本领域的普通技术人员可认识到，不依赖测量受体活化的途径，筛选鉴定方法对于鉴定有用的CRFR激动剂是有效的。测量这些信号途径的活性的分析方法是本领域已知的。
例如，在与试验化合物接触后，可制备和分析细胞的溶解产物来诱导cAMP。cAMP被诱导以响应Gαs活化。因为Gαs被除了CRFR之外的受体活化，且因为试验化合物可通过CRFR或通过其它机制来发挥作用，两种对照的比较物可相关用于测定试验化合物是否通过CRFR的活化来增加cAMP的量。一个对照比较了与试验化合物接触的细胞的cAMP量和与对照化合物接触的细胞的cAMP量(即，溶解试验化合物的载体)。如果试验化合物相对于对照化合物增加了cAMP量，这表明该试验化合物通过某种机制在增加cAMP。其它对照比较了表达CRFR的细胞系和基本相同但不表达CRFR的细胞系的cAMP量，这两个细胞系已用试验化合物处理。如果相对于不表达CRFR的细胞系，试验化合物提高了表达CRFR的细胞系中的cAMP量，这说明试验化合物通过CRFR活化提高了cAMP量。
在本发明的具体实施方案中，使用包含与多个报道基因中的任何一个相连的cAMP响应元件的DNA结构来测量cAMP诱导，所述报道基因可被引入到表达CRFR的细胞中。这些报道基因包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、荧光素酶、葡糖苷酸合成酶、生长激素、荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质)或碱性磷酸酶。在将细胞与试验化合物接触后，可量化报道基因表达的量以确定试验化合物增加cAMP量的能力，并由此确定试验化合物活化CRFR的能力。
适用于本鉴定的细胞与上述的用于CRFR结合鉴定方法中的细胞相同，除了在活化鉴定中使用的细胞优选地表达功能性受体，该受体对CRF或一个或多个CRF类似物在统计上给出大量的响应。除了使用表达全长的CRFR的细胞之外，细胞可被改造以表达包含受体的配体结合域的CRFR，该受体偶联或物理上被修饰以包含报道元件或与信号蛋白质结合。例如，野生型物种的CRFR或CRFR片段可被融合G-蛋白质，依靠与融合蛋白质的CRFR部分结合的激动剂，导致融合的G-蛋白质的活化。(Siefert，R.等人.，Trends Pharmacol.Sci.20383-389(1999))。根据示值读数，细胞也应优选具有一些性质，以最大化通过CRF或CRF类似物的诱导响应，例如，用于检测CRE报道基因的强诱导；(a)低天然含量的cAMP；(b)能够与CRFR相互作用的G蛋白质；(c)高含量的腺苷酰环化酶；(d)高含量的蛋白质激酶A；(e)低含量的磷酸二酯酶；和(f)结合高含量的cAMP响应元件的蛋白质将是有利的。为了增加对CRF或CRF类似物的响应，宿主细胞可被改造以表达更大量的有利因子或更少量的不利因子。另外，可消除CRE报道诱导的可选择途径以减少基本量。
在一些情况下，在与激动剂延长接触后，偶联G蛋白质的受体响应下降或没有反应。本发明的另一个实施方案提供了鉴定化合物的方法，该化合物可延长或增大CRF2R或CRF2R信号转换途径的激动剂诱导的活性，以响应CRF2R激动剂。这些化合物可用于，例如，结合CRF2R激动剂来治疗骨骼肌萎缩。典型地，该方法使用基于细胞的鉴定方法，该方法包括以任意顺序或同时进行的以下步骤(i)将细胞与试验化合物接触；(ii)用一定浓度的CRF2R激动剂处理表达功能性CRF2R的细胞，经足够长的激动剂-受体接触的时间来使该受体脱敏；然后(iii)测定CRF2R的活化量。本领域的技术人员可认识到几种机制有助于受体脱敏，包括但不限于受体磷酸化、受体内在化或降解和CRFR信号转换途径的下调。本领域的技术人员可确定使细胞与试验化合物接触的适当的时间(即，在激动剂治疗之前、之中或之后)，这取决于选用何种脱敏机制。例如，在激动剂处理后，使细胞与试验化合物接触可检测阻滞受体脱敏的试验化合物，所述脱敏是由于受体磷酸化而产生的。
在另一个实施方案中，本发明提供了筛选一种或多种试验化合物的方法来鉴定候选化合物，该候选化合物调节CRF2R基因的转录或调节CRF2R表达。调节CRFR基因的转录活性的候选化合物可使用与CRF2R调节区域(报道基因结构)可操作连接的报道基因来鉴定。这些方法是本领域已知的。在一个这样的方法中，使报道基因结构与试验化合物接触，在存在细胞因子源的情况下，测定报道基因的表达量。与对照样品相比，使得表达量增加的试验化合物就是可增加CRF2R基因转录的候选化合物。为了提供在体外或体内转录所需的细胞因子，从可正常表达CRF2R的任意细胞类型中制备适当的细胞或细胞提取物。
调节CRF2R表达的候选化合物也可在使细胞与试验化合物接触并测定CRFR的表达的方法中鉴定。将存在试验化合物时的CRF2R的表达量与没有试验化合物时的表达量相比较。增加CRF2R表达的试验化合物被鉴定为候选化合物，用于增加肌肉质量或肌肉功能。这样的方法检测了可增加CRF2R的转录或翻译，或增加mRNA或CRF2R蛋白质稳定性的候选化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选一个或多个试验化合物的方法，以鉴定调节CRF或CRF类似物的表达的候选化合物。用与上述鉴定基本相同但有下述修改的方法来实施这些鉴定，以鉴别调节CRFR的表达的候选化合物。为了鉴定调节来自CRF基因或CRF类似基因的转录的候选化合物，报道基因与相关的CRF基因或CRF类似基因的调节区域可操作地连接，细胞因子应源自表达相关基因的细胞类型。
VII.使用骨骼肌萎缩模型来筛选候选化合物通过体外鉴定从一个或多个试验化合物中选择的候选化合物，如上所述，可在骨骼肌萎缩和/或肥大的模拟系统中进一步测试其调节骨骼肌质量或功能的性质。这些骨骼肌萎缩或肥大的模型包括骨骼肌萎缩的体外细胞培养模型和体内动物模型。这些附加级别的筛选用于进一步缩小候选化合物的范围，以供另外的研究，例如，临床试验。
肌肉萎缩的细胞培养模型骨骼肌萎缩的体外模型在本领域中是已知的。这些模型描述于，例如，Vandenburgh，H.H.，体外24609-619(1988)、Vandenburgh，H.H.等人，J ofBiomechanics，24 Suppl 191-99(1991)、Vandenburgh，H.H等人，In VitroCell.Dev.Biol.，24(3)166-174(1988)、Chromiak，J.A.，等人，In VitroCell.Dev.Biol.Anim.，34(9)694-703(1998)、Shansky，J.，等人，InVitro Cell.Dev.Biol.Anim.，33(9)659-661(1997)、Perrone，C.E.等人，J.Biol.Chem.270(5)2099-2106(1995)、Chromiac，J.A.and Vandenburgh，H.H.，J.Cell.Physiol.159(3)407-414(1994)和Vandenburgh，H.H.andKarlisch，P.，In Vitro Cell.Dev.Biol.25(7)607-616(1989)。在上述的体外筛选后，可使用这些模型，但不是必须使用，以便进一步缩小候选化合物的范围，以供在动物模型中的测试。利用候选化合物来处理细胞培养模型，通过评定在肌肉标记内的变化来测量该模型对于处理的响应，所述肌肉标记为例如肌肉蛋白质合成或降解、骨骼肌质量或收缩功能的变化。诱导肌肉标记大量变化的那些化合物典型地被筛选进一步用于骨骼肌萎缩的动物模型。
骨骼肌萎缩的动物模型给人类以外的动物施用候选化合物，监控动物反应，例如，通过评价萎缩或肥大的标记的变化，例如骨骼肌质量、骨骼肌功能、肌肉或肌肉纤维切面面积、收缩的蛋白质含量、不收缩的蛋白质含量、或与骨骼肌质量或功能变换相关的生化的或遗传标记。诱导骨骼肌肥大或阻止任何方面的骨骼肌萎缩的候选化合物应被认为是用于治疗人骨骼肌萎缩的可能的治疗候选化合物，在本发明中称为候选治疗化合物。除了评估候选化合物调节骨骼肌萎缩的性质之外，不希望的副作用，例如毒性，也在这样的筛选中进行检测。没有不可接受的高度副作用可用作选择候选治疗化合物的附加标准。
骨骼肌萎缩的多种动物模型在本领域中是已知的，例如在下述参考文献中所描述的那些模型Herbison，G.J.，等人，Arch.Phys.Med.Rehabil.60401-404(1979)、Appell，H-J.Sports Medicine 1042-58(1990)、Hasselgren，P-O.和Fischer，J.E.World J.Surg.22203-208(1998)、Agbenyega，E.T.和Wareham，A.C.Comp.Biochem.Physiol.102A141-145(1992)、Thomason，D.B.和Booth，F.W.J.Appl.Physiol.681-12(1990)、Fitts，R.H.，等人，J.Appl.Physiol.601946-1953(1986)、Bramanti，P.，等人，Int.J.Anat.Embryol.10345-64(1998)、Cartee，G.D.J.Gerontol.A Biol.Sci.Med.Sci.50137-141(1995)、Cork，L.C.，等人，Prog.Cl in.Biol.Res.229241-269(1987)、Booth，F.W.和Gollnick，P.D.Med.Sci.Sports Exerc.15415-420(1983)、Bloomfield，S.A.Med.Sci.Sports Exerc.29197-206(1997)。这些模型的优选动物为小鼠和大鼠。这些模型包括，例如，废用诱导的萎缩模型，例如固定或其它的肢体固定、后肢悬吊、完全的动物固定和失重情况。神经损害诱导的萎缩模型包括，例如，神经粉碎、切除支配特定肌肉的神经段、对神经应用毒素、和用病毒、细菌或真核感染物来感染神经。糖皮质素诱导的萎缩模型包括给动物应用萎缩诱导剂量的外源性糖皮质素、刺激生成内源性皮质类固醇，例如，通过应用可活化下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的激素。败血病诱导的萎缩模型包括，例如，用败血病诱导的有机体，例如细菌，进行接种、用免疫活化的化合物，例如细菌细胞壁提取物或内毒素来处理动物、和肠壁的穿孔。恶病质诱导的萎缩模型包括，例如，用可能形成恶病质的肿瘤细胞给动物接种、用导致恶病质的感染物(例如可引起AIDS的病毒)来感染细胞，用可引起恶病质的激素或细胞因子，例如CNTF、TNF、IL-6、IL-1等来处理动物。心力衰竭诱导的萎缩模型包括处理动物，使其在发生心力衰竭时伴有骨骼肌萎缩。神经变形疾病诱导的萎缩模型包括自身免疫的动物模型，例如用神经元组分免疫动物细胞所引起的萎缩。肌营养不良诱导的萎缩模型包括天然的或人造的遗传诱导的肌营养不良模型，比发生在如Mdx小鼠内的营养不良基因的突变。
骨骼肌肥大的动物模型包括，例如由于相对肢的失活而增加的肢肌肉使用模型、在废用萎缩诱导事件后的重新称重、重新利用由于短暂的神经损害而萎缩的肌肉、由于协同酌肌的失活使选择性肌肉的增加使用(例如，代偿性肥大)、由于在肌肉上增加负荷产生的肌肉增加使用和由于在糖皮质素诱导的萎缩后切除糖皮质素而产生的肥大。优选的动物萎缩模型包括切除坐骨神经萎缩模型、糖皮质素诱导的萎缩模型和腿固定废用型萎缩模型，以下将详细描述。
切除坐骨神经萎缩模型包括麻醉动物，然后用外科手术切除一小段右或左坐骨神经，例如，在小鼠内大约在沿股骨的中点分离坐骨神经，然后取出3至5mm的片段。这样切除了下肢肌肉组织的神经，导致这些肌肉萎缩。典型地，对股二头肌的完整神经切除为实际的正常活动提供了满意的膝运动。典型地，在未处理的动物中，切除神经肌肉的质量在切除神经10天后减少了30％至50％。在切除神经后，例如，通过注射或例如通过植入微型渗透泵(例如，Alzet，Palo Alto，CA)连续注入测试化合物，以测定它们对切除神经诱导的骨骼肌萎缩的效果。在切除神经的不定时间后，使动物安乐死，迅速解剖切除神经的或未切除神经的小腿肌肉，清除腱和结缔组织，称量肌肉。分析受感染的肌肉的萎缩程度，例如，通过测量肌肉质量、肌肉切面面积、肌肉纤维切面面积或收缩的蛋白质含量。
糖皮质素诱导的萎缩模型包括给测试动物施用糖皮质素，例如，每天1.2mg地塞米松/kg饮用水。典型地，在未处理的动物中，在施用地塞米松10天后，其骨骼肌质量减少了30％至50％。伴随施用糖皮质素或在施用之后，例如通过注射或连续注入试验化合物，以测定它们对糖皮质素诱导的骨骼肌萎缩的效果。在施用糖皮质素的不定时间后，用上述的切除神经模型分析受感染的肌肉的萎缩程度。
腿固定废用型萎缩模型包括从一个动物的膝向下至脚固定一条后腿。典型地，在固定10天后，肌肉质量减少了20％至40％。在固定后，注射或通过植入微型渗透泵(例如，Alzet，Palo Alto，CA)连续注入试验化合物，测定它们对腿固定诱导的骨骼肌萎缩的效果。在腿固定后的不定时间，用上述的切除神经模型分析受感染的肌肉的萎缩程度。
本领域的技术人员可认识到，在筛选用于人的化合物中，因为人类CRF2R和其它动物物种的CRF2R之间有差异，当使用人类之外的CRF2R进行筛选时，可能会产生一些错误的正或负的结果。因此，优选在初始体外筛选时使用人类CRF2R。在某些情况下，鉴定的候选化合物可能仅对人受体有活性，而对人类之外受体没有活性。在这些情况下，仍希望在第二级筛选中测定这些候选化合物是否能调节骨骼肌质量或功能。因为这些候选化合物不会活化人类之外的CRF2R，建议不使用人类以外的动物的体内筛选标准。在这些情况下，对于这些候选化合物的二级筛选可在表达人类CRFR的转基因动物中进行。
任意种类的动物，尤其是哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、山羊、狗和人类以外的灵长类动物，可用于产生CRFR转基因动物。优选小鼠和大鼠，最优选小鼠。在本领域中已知有多种技术可用于将人类CRFR转基因到动物中，以生成起始系(founder line)的转基因动物。这些技术包括但不限于原核显微注射、反转录病毒调节的基因转移到细菌系(germ line)、胚胎干细胞中的基因目标、胚胎的电穿孔和精子调节的基因转移。
VIII.治疗骨骼肌萎缩的基因疗法可通过超量表达CRF2R的基因(增加CRF2R的表达)或在适当的组织内在构成上活化的CRF2R来增加CRF2R的总活性。通过类似的超量表达CRF基因，可在体内增加CRF含量。这些基因的超量表达将增加总的细胞的CRF2R活性，从而来调节骨骼肌萎缩。将该基因或相关的基因插入到患者内适合表达的载体内。这些载体包括但不限于腺病毒、与腺病毒相关的病毒、反转录病毒和疱疹病毒载体，以及将DNA引入到细胞内的其它颗粒(例如，脂质体、金颗粒等)或通过直接注射包含相关基因的DNA表达载体至人组织(例如，肌肉)。
IX.药物制剂和使用方法通过本发明所述的筛选方法鉴定的候选化合物或候选治疗化合物可应用到个体，以治疗骨骼肌萎缩，或诱导骨骼肌肥大。最后，本发明包括了调节骨骼肌萎缩的方法和组合物，包括但不限于通过以下因素诱导的骨骼肌萎缩，包括由于外科手术、卧床休息、骨折导致的废用；由于脊髓损伤导致的切除神经/神经损害；自身免疫疾病；传染病；用于不相关疾病的糖皮质素；由于感染或其它原因引起的败血病；由于疾病或饥饿引起的营养限制；癌恶病质；慢性炎症；爱滋恶病质；COPD；充血性心力衰竭；老年性肌肉萎缩和遗传障碍，例如，肌营养不良、神经变形病。CRF2R激动剂可用于抑制骨骼肌萎缩。有效化合物不必显示具有对CRFR的绝对特异性。希望其它受感染的受体的特定拮抗剂可与有效的但非特异性的激动剂共同使用。或者，通过单独调节剂量或定量服用来解决特异性的缺乏。
通过本发明的筛选方法鉴定的候选化合物或候选治疗化合物可结合其它化合物一起施用，所述其它化合物延长或增大CRF2R或CRF2R信号转换途径的活性。这些化合物可以是已知的化合物，例如茶碱，或者这些化合物可由本发明的方法来鉴定以延长或增大CRF2R受体或CRF2R信号转换途径的活性。
剂量测定可激动CRFR的安全的并可具有治疗效果的化合物可通过使用体外或体内技术的标准程序来测定。具有很大治疗指数的化合物为优选的，但是具有较低治疗指数的化合物也是有用的，只要其副作用的程度是可接受的。从体外和体内的毒物学和药理学技术得到的数据可用于配制有用的人范围的剂量。优选的剂量范围为其中化合物的循环浓度为具有可接受的安全性的治疗最大值。化合物的循环浓度可根据剂量形式、给药后的时间、给药途径等变化。在这个范围之外的剂量也是有用的，只要其副作用是可接受的。病人的年龄和体重等这些因素可用于确定在常规方式中的因素。药物遗传学方法可用于优化在临床群体中的化合物选择、剂量和给药方案。
制剂和使用根据本发明用于调节骨骼肌萎缩的药物组合物可利用常规方法，使用可药用的载体和赋形剂来配制。本发明的组合物优选以单位剂型提供。本发明所使用的“单位剂型”为本发明的包含一定量的CRF2R激动剂的组合物，根据良好的医疗实践，适于以单次剂量给动物施用、优选哺乳动物、更优选人类患者。配制药物组合物，用于通过，例如，鼻内、经皮、吸入、肠胃外、皮肤的、口服或直肠来输送给药。对于口服给药，该药物组合物可采用片剂或胶囊的形式，所述片剂或胶囊包含药理活性的化合物和添加剂，该添加剂包括但不限于粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可被包衣。用于口服给药的液体制剂包括但不限于糖浆、悬浮剂或干产物，在使用前用液体赋形剂重新制成的、包含药理活性的化合物和添加剂，包括但不限于悬浮剂、乳化剂、无水赋形剂、防腐剂、缓冲盐、芳香剂、着色剂、甜味剂等。口服给药的药物组合物可配制用于药理活性的化合物在嘴、胃或肠道内的控制释放。
对于吸入给药，根据本发明所使用的化合物可通过但不限于以下剂型来输送液体、粉末、凝胶或利用加压或未加压的推进剂的气溶胶喷剂，以预先测定的或未预先测定的剂量给药。药理活性的化合物可与适当的填充剂、赋形剂、防腐剂、缓冲液等进行配制。对于肠胃外给药，药理活性的化合物可与可接受的生理载体、防腐剂等配制，并制成悬浮剂、溶液、乳液、作为组分的粉末等，以用于快速注射或注入。这些化合物的制剂可通过多种技术来给药，包括皮下注射针、高压装置等。对于直肠给药，药理活性的化合物可与可接受的生理载体、防腐剂等配制，作为栓剂、灌肠剂等进行输送。对于皮肤给药，药理活性的化合物可与可接受的生理载体，包括洗剂、润肤剂等配制，或掺入到贴剂类装置。对于长期给药，药理活性的化合物与适当的添加剂，例如，但不限于，聚合物、疏水物质、树脂等，可配制为长效制剂，用于在包括但不限于肌内和皮下位置的多个部位注射或植入。另外，药理活性的化合物可通过配药装置给药。
监测临床试验期间的效果化合物(例如，药物)对CRF2R表达或活性的影响的监测不仅应用在基础药物筛选中，而且还应用在临床试验中。例如，通过筛选鉴定方法测定的化合物增加CRF2R受体活性或CRF2R受体表达的有效性可在具有或可能具有骨骼肌萎缩的病人的临床试验中评估。在施用试验化合物或安慰剂后的不定时间，通过观察骨骼肌质量、骨骼肌功能、肌肉损坏的生化标记物、或基本生活条件量度标准的变化，测定化合物对于病人的效果。测量在人类患者内的骨骼肌质量的方法在本领域内是已知的，包括，例如测量肢的周长；用例如计算机x线体层照相术、MRI或超声波学测量肌肉厚度、或用肌肉活组织检查法来检查形态学的和生化参数(例如，切面纤维面积、纤维直径、或酶活性)。另外，由于骨骼肌质量与骨骼肌功能相关，肌肉功能可用作肌肉质量的替代标记，可使用功能性量度，例如，强度、一组协同肌肉的力、或在肌电描记的记录中的收缩性来估算肌肉质量的变化。另外，可通过在患者的尿液或血液中定量测量氨基酸或氨基酸衍生物，即，3-甲基组氨酸的含量，来测量由于肌肉萎缩引起的肌肉蛋白质损耗。这些方法的综述参见Appell，Sports Med.1042-58(1990)。基本生活质量量度标准包括但不限于离开椅子的容易度、到达疲劳前的步数或爬楼梯的能力。
实施例实施例1人类CRF2R受体表达的载体构造提取人类CRF2R(hCRF2R)DNA序列，访问号码E12752，合成2个低聚核苷酸，其中一个包含在起始密码子端开始的基因的5’端部(5’低聚核苷酸)，一个包含含有终止密码子的基因的3’端部(3’低聚核苷酸)。这些低聚核苷酸设计用于含有限制性核酸内切酶部位，该部位不存在于hCRF2R基因内，在5’低聚核苷酸有一个独特部位，在3’低聚核苷酸有不同的独特限制性核酸内切酶部位。另外，3’低聚核苷酸含有聚腺苷酸附加信号序列。人骨骼肌的双链cDNA购自“通用快速克隆cDNA标本收藏”(the Universal QUICK-Clone cDNA collection)(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。使用上述的5’和3’低聚核苷酸，hCRF2R cDNA通过人骨骼肌cDNA的PCR使用AdvanTaq PCR试剂盒(ClonetechInc.，Palo Alto，CA，USA)放大。通过琼脂糖凝胶电泳，将hCRF2R基因PCR产物从PCR人工产物中纯化，hCRF2R基因DNA片段从琼脂糖凝胶中使用纯化产物，例如NucleoTrap(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)来纯化。
首先利用适当的限制性核酸内切酶切割hCRF2R PCR产物和pIRESneo载体，使得5’和3’限制性核酸内切酶部位适于连接，从而将hCRF2R PCR产物克隆到pIRESneo载体(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。根据厂商的推荐，使用DNA连接酶将pIRESneo载体DNA与hCRF2R PCR产物DNA连接，该连接酶来自AdvantAgeTMPCR Cloning Kit(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。连接的载体和插入结构(pIRESneo/hCRF2R)被用于转化TOP10F’的感受态大肠杆菌细胞(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。转化细胞被平铺在包含LB/X-gal/IPTG与氨必西林的琼脂上。选择白色的菌落(正克隆)，并分别在LB介质内培养。使用NucleoBond DNA纯化系统(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)分离质粒DNA。来自至少一个克隆物的插入结构被测序，以确保hCRF2R序列是正确的。包含稳定结合的Mercury CRE-LUC质粒(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)的HEK293细胞利用CalPhosTMMammalian Transfection Kit(ClonetechInc.，Palo Alto，CA，USA.)使用纯化的pIRESneo/hCRF2R DNA进行转染，该DNA具有正确的序列插入。用pIRESneo/hCRF2R DNA稳定转染的细胞通过在G418中培养细胞来选择。该稳定转染的细胞(HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF2R细胞)在DMEM(Life Technologies，Rockville，MD)中繁殖，所述DMEM包含10％牛胎儿血清(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)、青霉素/链霉素溶液(LifeTechnologies，Rockville，MD)、L-谷氨酰胺(Life Technologies，Rockville，MD)和非必要的氨基酸(Life Technologies，Rockville，MD)，培养条件为37℃的5％二氧化碳/95％空气环境。克隆的特征为在与CRF接触后的CRF结合和CRE-LUC活化，由实施例2和实施例3描述。以适当含量表达hCRF2R受体并适当偶联到CRE-LUC报道系统的细胞被用于进行另外的分析。
实施例2受体结合鉴定通过将实施例1的HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF2R细胞平铺在96孔的聚赖氨酸涂层的板上，在整个细胞中进行化合物的受体结合分析。在37℃的5％二氧化碳/95％空气下，在DMEM介质内播种细胞，该DMEM介质包含10％牛胎儿血清、青霉素/链霉素溶液、L-谷氨酰胺和非必要的氨基酸，然后将细胞培养过夜。除去培养介质，在MEM(Life Technologies，Rockville，MD)+10％Seablock(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)中加入适量用铕共价标记的CRF(Eu-CRF)。在室温下用Eu-CRF将该细胞培养90分钟，然后用不含镁和钙的磷酸酯缓冲盐水(Life Technologies，Rockville，MD)冲洗4次。在冲洗完成后，加入增强溶液(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)，在Wallac板读出器上(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)使用BioWorks Europium程序对该板分析。对于饱和结合分析，将对数剂量的从10(-12)至10(-3)M的Eu-CRF加入细胞中，在没有或具有饱和浓度的未标记CRF的情况下进行结合分析，以评估非特定结合。对于竞争性结合，加入一定浓度的Eu-CRF，其结合力为最大值的一半，另外改变相关化合物的浓度。
实施例3受体活化鉴定通过将实施例1的HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF2R细胞播种到PackardView Plate-96(Packard Inc.，CA)，进行受体活化分析。在37℃下的5％二氧化碳/95％空气中，在DMEM介质中播种细胞，该介质包含10％牛胎儿血清、青霉素/链霉素溶液、L-谷氨酰胺和非必要的氨基酸，并将细胞培养过夜。然后除去介质，并用DMEM(Life Technologies，Rockville，MD)取代，该DMEM介质包含含有相关化合物的0.01％牛蛋白片段V(SIGMA，St.Louis，MO)。然后在37℃下的5％二氧化碳/95％空气中将细胞培养4小时，接着除去介质，将细胞用Hanks Balanced Salt Solution(Life Technologies，Rockville，MD)冲洗两次。然后将赖氨酸试剂(Promega Inc.，Madison，WI)加入清洗过的细胞，在37℃下的5％二氧化碳/95％空气中将细胞培养20分钟。在-80℃将细胞放置20分钟，然后在37℃的5％二氧化碳/95％空气中培养20分钟。在这次培养后，将荧光素酶鉴定缓冲液和荧光素酶鉴定基质(Promega Inc.，Madison，WI)加入到细胞溶解产物中，使用发光计测定荧光素酶活性。通过比较与化合物接触后在HEK细胞中荧光素酶含量的增值，该细胞在与化合物接触后含有CRE-LUC结构，没有hCRF2R，从而评估化合物的相对活性。在有和没有过量的10倍hCRF2R拮抗剂存在的情况下，通过评估hCRF2R/CRE-LUC HEK细胞对化合物的荧光素酶响应，从而也检查了响应特异性。
实施例4筛洗以鉴定可延长或增大活化CRF2R和/或CRF2R受体信号转换途径的活性的候选化合物化合物的鉴定，该化合物延长或增大CRF2R或CRF2R信号转换途径的激动剂诱导的活化，包括所述受体活化鉴定的一个变化，描述在实施例3中。具体地说，通过播种HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF2R受体细胞到Packard ViewPlate-96(Packard Inc.，CA)来进行这个鉴定。在37℃的5％二氧化碳/95％空气下，在DMEM介质中播种细胞，该介质包含10％牛胎儿血清、青霉素/链霉素溶液、L-谷氨酰胺、非必要的氨基酸和饱和量的CRF，并培养48小时。然后除去上述介质，并用包含0.01％牛清蛋白片段V(SIGMA，St.Louis，MO)和CRF以及相关化合物的DMEM(Life Technologies，Rockville，MD)取代。在37℃的5％二氧化碳/95％空气中将细胞培养4小时，然后，除去介质，将细胞用HanksBalanced Salt Solution(Life Technologies，Rockville，MD)冲洗两次。然后将赖氨酸试剂(Promega Inc.，Madison，WI)加入冲洗后的细胞，将细胞在37℃的5％二氧化碳/95％空气中培养20分钟。然后将细胞在-80℃的温度下放置20分钟，接着在37℃的5％二氧化碳/95％空气中培养20分钟。在这次培养后，将荧光素酶鉴定缓冲剂和荧光素酶鉴定基质(Promega Inc.，Madison，WI)加入到细胞溶解产物，使用发光计来测量荧光素酶活性。在细胞浓度的偏差校正后，能显著激发高于对照的未处理细胞的荧光含量的荧光的试验化合物，被认为是调节骨骼肌质量或功能的候选化合物。大多数相关化合物为诱发具有较高含量荧光的物质。
实施例5筛选以鉴定特定用于CRF2R的候选化合物如同实施例3，鉴定活化CRF2R的化合物。为选择对CRFF2R的选择性高于CRF1R的那些化合物，也同样针对CRF1R筛选化合物。产生基本如实施例1所述的HEK293/CRE-LUC/p IRESneo/hCRF1R细胞，除了人类CRF1R(hCRF1R)DNA序列，访问号码为X72304，用于起始PCR放大。为确定化合物如何活化CRF1R，进行基本如实施例3所述的活化鉴定，不同的是使用HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF1R细胞在板上播种。将通过在CRF2R表达细胞中的化合物激发的荧光量与通过在CRF1R表达细胞中的化合物激发的荧光量进行比较。在CRF2R表达细胞中显示10倍于在CRF1R表达细胞中的较好响应(以物质的量为基准)的这些化合物被验证以另外用于特异响应以消除由于克隆变异产生的偏差。在存在或不存在10倍的过量CRF2R拮抗剂-抗蛙皮降压肽-30的情况下，用该化合物鉴定HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/hCRF2R细胞。那些显示对CRF2R具有大于10倍的选择性且其活性被抗蛙皮降压肽-30抑制的化合物被选作候选化合物。
实施例6筛选鉴定可增强hCRF2R表达的候选化合物包含hCRF2R基因的启动子区域的序列可从人类基因组数据库中提取，该序列从足够远的上游转录起始部位开始含有所有调节元件，这些调节元件在适当组织的hCRF2R基因的生理表达中是必需的。合成了两种低聚核苷酸，一种包含启动子区域的5’末端(5’低聚核苷酸)，一种包含包括转录起始部位的启动子区域的3’末端(3’低聚核苷酸)。这些低聚核苷酸也包含在hCRF2R基因调节区域内不存在的限制性核酸内切酶部位，在5’低聚核苷酸内具有一个独特部位，在3’低聚核苷酸内有一个不同的独特限制性核酸内切酶。使用PCR试剂盒，Advantage_Genomic PCR kit(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)，将5’和3’低聚核苷酸用于人DNA的hCRF2R基因调节区域的PCR放大(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。通过琼脂糖凝胶电泳将hCRF2R基因调节区域PCR产物从PCR人工产物中纯化，使用纯化产物，例如NucleoTrap(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)将hCRF2R基因调节区域DNA片段从琼脂糖凝胶中纯化。通过首先使用适当的限制性核酸内切酶切割hCRF2R基因调节区域PCR产物和pECFP-1载体，以便5’和3’限制性核酸内切酶部位易于结合，从而将hCRF2R基因调节区域PCR产物克隆到pECFP-1载体(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。按照厂商的推荐，使用得自AdvantAgeTMPCR Cloning Kit(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)的DNA连接酶，将pECFP-1载体DNA连接到hCRF2R基因调节区域PCR产物DNA。连接载体和插入结构被用于转化TOP10F’感受态大肠杆菌细胞(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。将细胞平铺在包含LB和卡那霉素的琼脂上，选择抗卡那霉素菌落进行进一步分析。抗卡那霉素克隆物在包含LB的卡那霉素介质中培养，使用NucleoBond DNA纯化系统(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)分离质粒DNA，通过DNA测序来分析包含hVPAC2基因调节区域的结构，以确保结构的正确和完整。利用磷酸钙调节的转染，使用CalPhosTM哺乳动物的转染试剂盒(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)，将包含hCRF2R基因调节区域的纯化的结构质粒DNA转染到HEK293细胞。使用G418选择转染细胞克隆物，然后分离，并在37℃的5％二氧化碳/95％空气，在DMEM(Life Technologies，Rockville，MD)介质中繁殖，该DMEM介质包含10％牛胎儿血清(Clonetech Inc.，PaloAlto，CA，USA)、青霉素/链霉素溶液(Life Technologies，Rockville，MD)、L-谷氨酰胺(Life Technologies，Rockville，MD)、非必要的氨基酸(LifeTechnologies，Rockville，MD)和G418(Life Technologies，Rockville，MD)。通过DNA印迹法来确定抗G418的克隆物的特征，以确保它们含有hCRF2R基因启动子序列；另外，使用适当的刺激剂来分析hCRF2R基因调节区域的活性。适当含量的表达hCRF2R基因调节区域-ECFP的细胞被用于鉴定，以评定可调节hCRF2R基因调节区域的活性的化合物，如下所述。通过以适当的密度将包含的hCRF2R基因调节区域-ECFP的HEK293细胞播种至具有清洁底部的黑色的96孔微量滴定板，并使其生长过夜，进行调节区域活化的分析。在第二天，将介质除去，将该测试化合物加入到新鲜的培养介质中。在37℃的5％二氧化碳/95％空气下，将细胞培养16小时，然后测量荧光(通过使用荧光计(bioluminTM960，Molecular Dynamics/Amersham Pharmacia Biotech，Pi scataway，NJ)检测在475(501)nm的发射，可得到在433(453)nm的激发)。在校正了细胞密度的偏差后，所激发的荧光显著高于对照的未处理的细胞的荧光量的试验化合物，被认为是调节骨骼肌质量或功能的候选化合物。大多数相关化合物为可诱发相对较高量的荧光的物质。
实施例7筛选鉴定可增加人类CRF表达的化合物鉴定可增强人类CRF(hCRF)表达的化合物的方法基本上与鉴定可增强hVPAC2受体表达的化合物所用的方法相同，不同的是所使用的调节区域用于hCRF基因。包含hCRF基因的调节区域的序列在足够远的上游转录起始部位开始含有所有调节元件，这些调节元件是在适当组织内的hCRF基因的生理表达必需的，该序列可从人基因组数据库中提取。合成了两种低聚核苷酸，一种包含调节区域的5’末端(5’低聚核苷酸)，一种包含包括转录起始部位的调节区域的3’末端(3’低聚核苷酸)。这些低聚核苷酸也含有在hCRF基因调节区域中没有的限制性内切酶部位，在5’低聚核苷酸中有一个独特的部位，在3’低聚核苷酸中有不同的独特限制性内切酶部位。使用Advantage_Genomic PCR试剂盒(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)，5’和3’低聚核苷酸用于人DNA(Clonetech Inc.，PaloAlto，CA，USA)的hCRF基因调节区域的PCR放大。通过琼脂糖凝胶电泳，从PCR人工产物中纯化hCRF基因调节区域PCR产物，使用纯化产物，NucleoTrap(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)，将hCRF基因调节区域DNA片段从琼脂糖凝胶中纯化。通过首先用适当的限制性内切酶切割hCRF基因调节区域PCR产物和pECFP-1载体，使得5’和3’限制性内切酶部位适于连接，将hCRF基因调节区域PCR产物克隆到pECFP-1载体(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。根据厂商推荐，使用来自AdvantAgeTMPCR Cloning Kit(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)DNA连接酶，将pECFP-1载体DNA连接到hCRF基因调节区域PCR产物DNA。连接的载体和插入结构被用于转化TOP10F’感受态大肠杆菌细胞(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。将细胞平铺在含有LB和卡那霉素的琼脂上，选择抗卡那霉素菌落用于进一步分析。在含有LB的卡那霉素介质中培养抗卡那霉素克隆物，使用NucleoBond DNA纯化系统(Clonetech Inc.，PaloAlto，CA，USA)分离质粒DNA，通过DNA测序来分析包含hCRF基因调节区域的结构，以确保结构的正确和完整。利用CalPhosTM哺乳动物的转染试剂盒(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)，使用磷酸钙调节的转染，将包含hCRF基因调节区域的纯化结构质粒DNA转染到HEK293细胞。使用G418选择转染细胞克隆物，然后分离，并在37℃的5％二氧化碳/95％空气下，在DMEM(LifeTechnologies，Rockville，MD)中繁殖，该DMEM介质包含10％牛胎儿血清(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)、青霉素/链霉素溶液(LifeTechnologies，Rockville，MD)、L-谷氨酰胺(Life Technologies，Rockville，MD)、非必要的氨基酸(Life Technologies，Rockville，MD)和G418(LifeTechnologies，Rockville，MD)。通过DNA印迹法来确定抗G418克隆物的特征，以确保它们含有hCRF基因调节区域序列；另外，使用适当地刺激剂来分析hCRF基因调节区域的活性。适量的表达hCRF基因调节区域-ECFP的细胞被用于鉴定，以按照如下步骤来评定能够调节hCRF基因调节区域的活性的化合物。如实施例5进行调节区域活性分析，不同的是使用包含hCRF基因调节区域结构的克隆物。
实施例8制备可活化hCRF2R的人体抗体的方法通过首先产生重组hCRF2R蛋白质来生成活化hCRF2R的完全的人类单克隆抗体，如下所述。按照实施例1的程序，得到hCRF2R PCR产物。通过首先用适当的限制性核酸内切酶切割hCRF2R基因PCR产物和pHAT20载体，使得5’和3’限制性核酸内切酶部位适于连接，从而将该hCRF2R的PCR产物克隆到pHAT20载体(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。根据厂商推荐，使用来自theAdvantAgeTMPCR Cloning Kit(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)DNA连接酶，将pHAT20载体DNA连接到hCRF2R基因PCR产物DNA。连接的载体/插入结构被用于转化TOP10F’感受态大肠杆菌细胞(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。将细胞平铺在含有LB和氨必西林的琼脂上，选择抗氨必西林菌落用于进一步分析。在包含氨必西林的LB介质中培养正克隆物，使用NucleoBond DNA纯化系统(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)分离质粒DNA，通过DNA测序来分析包含hCRF2R基因的结构，以确保结构的正确和完整。通过利用包含HAT序列的开始部分和在hCRF2R-pHAT20结构内没有的独特的限制性内切酶部位的5’低聚核苷酸，和先前利用的3’hCRF2R低聚核苷酸，使用hCRF2R-pHAT20载体DNA进行另外的PCR克隆。低聚核苷酸引物用于PCR放大来自hCRF2R-pHAT20结构的HAT-hCRF2R融合基因，如上所述纯化PCR产物。利用HAT-hCRF2R融合基因PCR产物，使用来自Clonetech(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)的BacPAKBaculovirus Expression System，将其克隆到pBacPAK8载体。HAT-hCRF2R融合基因与pBacPAK8载体的连接基本如上所述。hCRF2R/HAT-pBacPAK8结构被转染到TOP10’F感受态大肠杆菌细胞，选择抗氨必西林细胞，分离质粒DNA并进行验证，以确保结构完整，如上所述。利用CalPhosTM哺乳动物转染试剂盒(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)，将这种结构与直链BacPAK6DNA共同转染到Sf21昆虫宿主细胞。将昆虫细胞培养2至3天，然后从单个的透明噬斑中采集病毒。然后在Sf21细胞中放大病毒，对所采集的病毒进行滴定，利用BacPAK昆虫细胞介质使用所滴定的病毒大规模感染Sf21细胞，所有物质都是根据厂商推荐(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)。使用厂商推荐的条件，利用购自Clonetech(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA，USA)的TALON_CellThru纯化试剂盒来纯化重组HAT-CRF2R融合蛋白质。简而言之，在感染后48小时采集感染的Sf21细胞，并在萃取/加载缓冲液中进行超声处理。细胞溶解产物放置在TALON_CellThru柱。用萃取/加载缓冲液将柱子冲洗两次，结合的HAT-hCRF2R蛋白质用洗脱缓冲液洗脱。通过SDS-PAGE分析洗脱蛋白质的完整性，使用厂商推荐(Bio-Rad Laboratories，Hercules，Ca)的Bio-Rad SDS-PAGE系统和蛋白质定量系统来定量分析蛋白质浓度。使用纯化的HAT-hCRF2R融合蛋白质来对XenoMouse动物(Abgenix Inc.，Fremont，CA)进行免疫接种，用于如下的人单克隆抗体生产。在8个星期内，使用10μg纯化的重组HAT-hCRF2R融合蛋白质与25g辅剂单磷酰脂类A(Sigma，St.Louis，MO)对10只基因转殖鼠(XenoMouse)动物多次免疫接种。从接种疫苗的动物得到血清，并在抗原捕获ELISA中使用，利用纯化的HAT-hCRF2R融合蛋白质以检测HAT-hCRF2R蛋白质的抗体，包括利用HAT-hCRF2R融合蛋白质包覆聚苯乙烯ELISA板(Corning Glass Works，Corning，NY)，用PBS-1％BSA嵌段，在37℃用血清样品的1∶50稀释液冲洗并培养1小时。在用PBS洗涤5次后，用碱性磷酸酶共轭的人免疫球蛋白G的山羊抗体在37℃将该板培养1小时。用PBS将该板冲洗5次，并用对硝基苯基磷酸酯基质(Sigma，St.Louis，MO)的缓冲液检测抗体。使用板式读数计测量在405nm处的光密度，并进行信号定量分析。使用具有示例的高抗体产率的小鼠来形成杂交瘤细胞。通过将XenoMouse动物的脾细胞与非分泌的骨髓瘤细胞线NSA-bcl 2融合，使用4∶1比率的脾细胞与NSA-bcl2细胞，在30％聚乙二醇PEG1450存在的情况下，产生杂交瘤细胞。通过限制稀释到96孔的板分别克隆融合细胞，并在RPMI-1640介质中培养，所述介质包含10％牛胎儿血清、非必要的氨基酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素-链霉素和次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(所有物质都购自Life Technologies，Rockville，MD)。来自用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷选择的杂交瘤细胞的上清液被筛选用于通过ELISA的人体抗体生产，如上所述。选择产生HAT-hCRF2R融合蛋白质的人体抗体的杂交瘤细胞进行大规模抗体生产。通过蛋白质G-Sepharose色谱法来纯化单克隆抗体。简言之，将培养的杂交瘤细胞克隆物的上清液的加载缓冲液加载到蛋白质G-Sepharose柱(SIGMA，St.Louis，MO)内，冲洗3次，用洗脱缓冲液洗脱IgG。利用这些抗体筛选以评定hCRF2R活化(激动性)潜能。使用实施例3所述的方法来完成这个步骤。那些对于hCRF2R显示具有激动剂活性的人单克隆抗体被鉴定为候选化合物。
实施例9肌肉的绝对力测定从固定的小鼠腿上腱-至-腱地除去长指伸肌(EDL)和比目鱼肌。将丝缝线系于分离肌肉的各个腱，将肌肉放置于有机玻璃室，该室充满林格氏溶液(137mM氯化钠，24mM碳酸氢钠、11mM葡萄糖、5mM氯化钾、1mM硫酸镁、1mM磷酸钠、0.025mM筒箭毒碱，所有这些物质都是在pH7.4，用95％氧气/5％二氧化碳氧化的)，持续用95％氧/5％二氧化碳鼓泡，维持在25℃。在伺服马达杠杆臂(型号305B-LR Cambridge Technology Inc.，Watertown MA，USA)和力传感器的不锈钢钩(型号BG-50；Kul ite Semiconductor Products Inc.，Leonia，NJ，USA)之间水平排列肌肉，并通过在两个铂电极之间传送的脉冲进行场激发，两个铂电极纵向放置在肌肉的任意一侧。通过个人计算机用Labview板(型号PCI-MIO 16E-4)，Labview Inc.，Austin，TX，USA)产生的矩形波脉冲(持续时间0.2ms)被放大(Acurus功率放大器，型号A25，Dobbs Ferry，NY，USA)，以增大钛(titanic)收缩。调节刺激电压和肌肉长度(Lo)得到最大等长颤搐力。最大的钛(titanic)力的生成(Po)是通过频率-力的关系的坪值测定的。
实施例10使用作为hCRF2R受体的激动剂的人体抗体治疗学治疗骨骼肌萎缩男性患者，体重50kg，由于长时间的卧床休息，具有显著的臂部和腿部的肌肉萎缩，对其进行治疗以逆转骨骼肌萎缩。在3个月内，每周一次，将15mlpH为6的包括CRF2R受体的活化抗体的水溶液通过静脉注射至患者。该溶液包括以下组分组分浓度(mg/ml)CRF2R受体激动剂抗体 20L-组氨酸HCl 0.47L-组氨酸 0.3α，α-海藻糖二水合物20聚山梨酸酯20 0.1制菌的无菌水 适量至1mL在治疗阶段的最后，患者具有臂部和腿部的肌肉质量、力量和可动性的可测量的增加。
实施例11使用作为hCRF2R受体的激动剂的人体抗体进行骨骼肌萎缩的预防性治疗女性患者，体重55kg，准备在一个月内进行髋关节复位外科手术。治疗该患者以在手术之前和之后增强骨骼肌质量，最终减少由于肌肉在外科手术后的恢复中肌肉废用所引起的骨骼肌萎缩的程度。具体地，在手术前一个月和手术后2个月内每周一次，通过静脉注射给患者使用18ml pH为6.0的包括CRF2R受体的活化抗体的水溶液。该溶液包括以下组分
组分浓度(mg/ml)CRF2R活化抗体 20L-组氨酸HCl 0.47L-组氨酸0.3α，α-海藻糖二水合物 20聚山梨酸酯200.1制菌的无菌水适量至1mL在治疗阶段的最后，与没有抗体治疗的患者的预期状态相比，该患者具有臂部和腿部的肌肉质量、力量和可动性的可测量的增加。
实施例12使用作为CRF2R受体的激动剂的人体抗体来进行骨骼肌萎缩的预防性治疗女性患者，体重45kg，被固定以治疗由跌倒引起的肱骨的单纯骨折。治疗该患者，以防止由于在骨折治疗期间的废用和有限使用而引起的受伤的臂部和肩部的骨骼肌萎缩。具体地，从固定之日开始，每周一次，通过静脉注射给患者使用13ml pH为6.0的包括抗-hCRF2R受体的活化抗体的水溶液。该溶液包括以下组分组分浓度(mg/ml)活化CRFR抗体20L-组氨酸HCl 0.47L-组氨酸0.3α，α-海藻糖二水合物 20聚山梨酸酯200.1制菌的无菌水适量至1mL在治疗阶段的最后，与没有抗体治疗的患者的预期状态和后续治疗相比，患者具有受伤的臂部和肩部的肌肉质量、力量和可动性的可测量的保持，以及理疗时间的减少。
实施例13使用urocortin-II预防性治疗骨骼肌萎缩女性患者，体重60kg，以昏迷状态入院。通过本方法来治疗该患者，防止由于昏迷状态的废用引起的整个身体的骨骼肌萎缩。具体地，在昏迷期间每天一次，通过缓慢的静脉注入给患者使用大约500ml水溶液，该水溶液通过加入5ml下述储备溶液至500ml无菌盐水制得组分浓度(mg/ml)Urocortin-II12磷酸钠缓冲液，pH7.4 140治疗的结果是，与没有经过药物治疗的患者的状态相比，该患者具有可测量的骨骼肌质量和功能的保持，在昏迷期间和恢复清醒后减少的理疗需要。
实施例14使用CRF来治疗处理具有杜兴肌营养不良的病人男性患者，体重40kg，目前诊断为杜兴肌营养不良，使用具有高于类似剂量范围的具有CRF1-R和CRF2-R激动性的化合物。治疗该患者，使用持续释放的长效制剂的化合物，以在疾病治疗过程中提高或保持肌肉力量和功能。具体地，每月一次给该患者通过肌肉注射3ml pH为6.0的水溶液，该水溶液包括如下组分组分浓度(mg/ml)CRH(促肾上腺皮质激素释放激素)4D，L乳酸和乙醇酸共聚物 5治疗结果是，与疾病的自然发展过程所具有的症状相比，在与时间相关的功能评价中，该患者感到肌肉力量或肌肉功能的提高或其衰退减缓。
上述的具体实施方案不是用于限制本发明的范围，而只是旨在说明本发明的各个单独方面，在功能上等效的方法和组分都在本发明的范围之内。它们包括但不限于测试动物的种类、CRFR激动剂的性质和类别、动物性别、萎缩模型、活化CRFR的方法，包括遗传方法等。除了本文所显示和描述的，对于本发明的技术人员来说，根据阅读前述的讨论和附图，显而易见可对本发明作出各种修改。这些修改都在所附权利要求书的保护范围之内。
序列表<110>宝洁公司<120>鉴定利用促肾上腺皮质激素释放因子受体来调节肌肉质量或功能的化合物的方法<130>8448<160>44<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>2536<212>DNA<213>智人(智人(homo sapiens))<220>
<221>CDS<222>(227)..(1474)<400>1ggggaaacgg cggccagact tccccgggaa ggggcgagcg agagccgggc cgggccgggc 60cgggccgcgg ggccgggaag cgccgagccg ggcatctcct caccaggcag cgaccgagga120gcccggccgc ccaccccgtg ccgcccgagc ccgcagccgc ccgccggtcc ctctgggatg180tccgtaggac ccgggcattc aggacggtag ccgagcgagc ccgagg atg gga ggg 235Met Gly Gly1cac ccg cag ctc cgt ctc gtc aag gcc ctt ctc ctt ctg ggg ctg aac 283His Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Asn5 10 15ccc gtc tct gcc tcc ctc cag gac cag cac tgc gag agc ctg tcc ctg 331Pro Val Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser Leu Ser Leu20 25 30 35gcc agc aac atc tca gga ctg cag tgc aac gca tcc gtg gac ctc att 379Ala Ser Asn Ile Ser Gly Leu Gln Cys Asn Ala Ser Val Asp Leu Ile40 45 50ggc acc tgc tgg ccc cgc agc cct gcg ggg cag cta gtg gtt cgg ccc 427Gly Thr Cys Trp Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Leu Val Val Arg Pro55 60 65tgc cct gcc ttt ttc tat ggt gtc cgc tac aat acc aca aac aat ggc 475Cys Pro Ala Phe Phe Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr Asn Asn Gly70 75 80tac cgg gag tgc ctg gcc aat ggc agc tgg gcc gcc cgc gtg aat tac 523Tyr Arg Glu Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Ala Ala Arg Val Asn Tyr85 90 95tcc gag tgc cag gag atc ctc aat gag gag aaa aaa agc aag gtg cac 571Ser Glu Cys Gln Glu Ile Leu Asn Glu Glu Lys Lys Ser Lys Val His100 105 110 115tac cat gtc gca gtc atc atc aac tac ctg ggc cac tgt atc tcc ctg 619Tyr His Val Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys Ile Ser Leu120 125 130gtg gcc ctc ctg gtg gcc ttt gtc ctc ttt ctg cgg ctc agg agc atc 667Val Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu Arg Ser Ile
135 140 145cgg tgc ctg cga aac atc atc cac tgg aac ctc atc tcc gcc ttc atc 715Arg Cys Leu Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser Ala Phe Ile150 155 160ctg cgc aac gcc acc tgg ttc gtg gtc cag cta acc atg agc ccc gag 763Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met Ser Pro Glu165 170 175gtc cac cag agc aac gtg ggc tgg tgc agg ttg gtg aca gcc gcc tac 811Val His Gln Ser Asn Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr Ala Ala Tyr180 185 190 195aac tac ttc cat gtg acc aac ttc ttc tgg atg ttc ggc gag ggc tgc 859Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly Glu Gly Cys200 205 210tac ctg cac aca gcc atc gtg ctc acc tac tcc act gac cgg ctg cgc 907Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp Arg Leu Arg215 220 225aaa tgg atg ttc atc tgc att ggc tgg ggt gtg ccc ttc ccc atc att 955Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe Pro Ile Ile230 235 240gtg gcc tgg gcc att ggg aag ctg tac tac gac aat gag aag tgc tgg1003Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu Lys Cys Trp245 250 255ttt ggc aaa agg cct ggg gtg tac acc gac tac atc tac cag ggc ccc1051Phe Gly Lys Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro260 265 270 275atg atc ctg gtc ctg ctg atc aat ttc atc ttc ctt ttc aac atc gtc1099Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe Asn Ile Val280 285 290cgc atc ctc atg acc aag ctc cgg gca tcc acc acg tct gag acc att1147Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile295 300 305cag tac agg aag gct gtg aaa gcc act ctg gtg ctg ctg ccc ctc ctg1195Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu310 315 320ggc atc acc tac atg ctg ttc ttc gtc aat ccc ggg gag gat gag gtc1243Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Glu Val325 330 335tcc cgg gtc gtc ttc atc tac ttc aac tcc ttc ctg gaa tcc ttc cag1291Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu Ser Phe Gln340 345 350 355ggc ttc ttt gtg tct gtg ttc tac tgt ttc ctc aat agt gag gtc cgt1339Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val Arg360 365 370tct gcc atc cgg aag agg tgg cac cgg tgg cag gac aag cac tcg atc1387Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys His Ser Ile375 380 385cgt gcc cga gtg gcc cgt gcc atg tcc atc ccc acc tcc cca acc cgt1435Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg390 395 400gtc agc ttt cac agc atc aag cag tcc aca gca gtc tga gctggcaggt 1484Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val
405 410 415catggagcag cccccaaaga gctgtggctg gggggatgac ggccaggctc cctgaccacc 1544ctgcctgtgg aggtgacctg ttaggtctca tgcccactcc cccaggagca gctggcactg 1604acagcctggg ggggccgctc tccccctgca gccgtgcagg actctagctc atgagtggaa 1664agtcacctac aggactgggc cgggcccagg gcctctggct tccctgccca atcctccctg 1724gagaagggac atgggaatga attgaaatgg ggcgctggac acctacagca gcacgcatgt 1784ccctccaagg ctgtcttctc ccagagcaca agaaggccag cccactgggc cctggggctg 1844ccctcggcaa ccgtggggag gccatttgct gccctggggc atcatgggca actcgtgaca 1904gcctctgact caccacgatg acgcctctgg acctcggtga tgccttccga caccactggg 1964aaccaagggc cctcactcag gaaccctgga gacagaagtc aggtgtcatc atcagacttg 2024cggccacagc actagagtca cccccccagg cctccagaac cttactggca ctgtggcact 2084gccaccagca atgccctgcc ttgctgcctt caccctgaac atttagtacc ctgcaggcca 2144ggccagcttc ccctcactta accaccccat accagtcacc tcctgctcct tttcctcttt 2204tgtgagaaga tgggggctgg agggggcaga gtggcctgtg agcaagagcc aggggtgtcc 2264cagtcccagc ctctggggca gagcttgtag ccctggatgg cctctggggc aggaccacta 2324gctaagcaag ccaggagaag acccctgccc aagtggctct tgggacaacg tgctgcttac 2384actccaggtg tggaccggcc gcagccccca ctgacctgcc catgtccaga gggactggac 2444agccagggca gggctttggg gggcactaga agatgagggt gtcggctgtg aggcgggtgg 2504ctggtataaa taatatttat cttttcaacc ag2536<210>2<211>415<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>2Met Gly Gly His Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Gly Leu Asn Pro Val Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser20 25 30Leu Ser Leu Ala Ser Asn Ile Ser Gly Leu Gln Cys Asn Ala Ser Val35 40 45Asp Leu Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Leu Val50 55 60Val Arg Pro Cys Pro Ala Phe Phe Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr65 70 75 80Asn Asn Gly Tyr Arg Glu Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Ala Ala Arg85 90 95
Val Asn Tyr Ser Glu Cys Gln Glu Ile Leu Asn Glu Glu Lys Lys Ser100 105 110Lys Val His Tyr His Val Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys115 120 125Ile Ser Leu Val Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu130 135 140Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser145 150 155 160Ala Phe Ile Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met165 170 175Ser Pro Glu Val His Gln Ser Asn Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr180 185 190Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly195 200 205Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp210 215 220Arg Leu Arg Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe225 230 235 240Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu245 250 255Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr260 265 270Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe275 280 285Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser290 295 300Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu305 310 315 320Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu325 330 335Asp Glu Val Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu340 345 350Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser355 360 365
Glu Val Arg Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys370 375 380His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser385 390 395 400Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val405 410 415<210>3<211>1285<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(38)..(1285)<400>3cccgggcatt caggacggta gccgagcgag cccgagg atg gga ggg cac ccg cag55Met Gly Gly His Pro Gln1 5ctc cgt ctc gtc aag gcc ctt ctc ctt ctg ggg ctg aac ccc gtc tct103Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Asn Pro Val Ser10 15 20gcc tcc ctc cag gac cag cac tgc gag agc ctg tcc ctg gcc agc aac151Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser Leu Ser Leu Ala Ser Asn25 30 35atc tca gga ctg cag tgc aac gca tcc gtg gac ctc att ggc acc tgc199Ile Ser Gly Leu Gln Cys Asn Ala Ser Val Asp Leu Ile Gly Thr Cys40 45 50tgg ccc cgc agc cct gcg ggg cag cta gtg gtt cgg ccc tgc cct gcc247Trp Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Leu Val Val Arg Pro Cys Pro Ala55 60 65 70ttt ttc tat ggt gtc cgc tac aat acc aca aac aat ggc tac cgg gag295Phe Phe Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr Asn Asn Gly Tyr Arg Glu75 80 85tgc ctg gcc aat ggc agc tgg gcc gcc cgc gtg aat tac tcc gag tgc343Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Glu Cys90 95 100cag gag atc ctc aat gag gag aaa aaa agc aag gtg cac tac cat gtc391Gln Glu Ile Leu Asn Glu Glu Lys Lys Ser Lys Val His Tyr His Val105 110 115gca gtc atc atc aac tac ctg ggc cac tgt atc tcc ctg gtg gcc ctc439Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys Ile Ser Leu Val Ala Leu120 125 130ctg gtg gcc ttt gtc ctc ttt ctg cgg ctc agg agc atc cgg tgc ctg487Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu135 140 145 150cga aac atc atc cac tgg aac ctc atc tcc gcc ttc atc ctg cgc aac535Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser Ala Phe Ile Leu Arg Asn155 160 165gcc acc tgg ttc gtg gtc cag cta acc atg agc ccc gag gtc cac cag583Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met Ser Pro Glu Val His Gln
170 175 180agc aac gtg ggc tgg tgc agg ttg gtg aca gcc gcc tac aac tac ttc631Ser Asn Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe185 190 195cat gtg acc aac ttc ttc tgg atg ttc ggc gag ggc tgc tac ctg cac679His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly Glu Gly Cys Tyr Leu His200 205 210aca gcc atc gtg ctc acc tac tcc act gac cgg ctg cgc aaa tgg atg727Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp Arg Leu Arg Lys Trp Met215 220 225 230ttc atc tgc att ggc tgg ggt gtg ccc ttc ccc atc att gtg gcc tgg775Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe Pro Ile Ile Val Ala Trp235 240 245gcc att ggg aag ctg tac tac gac aat gag aag tgc tgg ttt ggc aaa823Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu Lys Cys Trp Phe Gly Lys250 255 260agg cct ggg gtg tac acc gac tac atc tac cag ggc ccc atg atc ctg871Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Met Ile Leu265 270 275gtc ctg ctg atc aat ttc atc ttc ctt ttc aac atc gtc cgc atc ctc919Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu280 285 290atg acc aag ctc cgg gca tcc acc acg tct gag acc att cag tac agg967Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg295 300 305 310aag gct gtg aaa gcc act ctg gtg ctg ctg ccc ctc ctg ggc atc acc 1015Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr315 320 325tac atg ctg ttc ttc gtc aat ccc ggg gag gat gag gtc tcc cgg gtc 1063Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Glu Val Ser Arg Val330 335 340gtc ttc atc tac ttc aac tcc ttc ctg gaa tcc ttc cag ggc ttc ttt 1111Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu Ser Phe Gln Gly Phe Phe345 350 355gtg tct gtg ttc tac tgt ttc ctc aat agt gag gtc cgt tct gcc atc 1159Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val Arg Ser Ala Ile360 365 370cgg aag agg tgg cac cgg tgg cag gac aag cac tcg atc cgt gcc cga 1207Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys His Ser Ile Arg Ala Arg375 380 385 390gtg gcc cgt gcc atg tcc atc ccc acc tcc cca acc cgt gtc agc ttt 1255Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Val Ser Phe395 400 405cac agc atc aag cag tcc aca gca gtc tga 1285His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val410 415<210>4<211>415<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>4
Met Gly Gly His Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Gly Leu Asn Pro Val Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser20 25 30Leu Ser Leu Ala Ser Asn Ile Ser Gly Leu Gln Cys Asn Ala Ser Val35 40 45Asp Leu Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Leu Val50 55 60Val Arg Pro Cys Pro Ala Phe Phe Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr65 70 75 80Asn Asn Gly Tyr Arg Glu Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Ala Ala Arg85 90 95Val Asn Tyr Ser Glu Cys Gln Glu Ile Leu Asn Glu Glu Lys Lys Ser100 105 110Lys Val His Tyr His Val Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys115 120 125Ile Ser Leu Val Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu130 135 140Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser145 150 155 160Ala Phe Ile Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met165 170 175Ser Pro Glu Val His Gln Ser Asn Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr180 185 190Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly195 200 205Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp210 215 220Arg Leu Arg Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe225 230 235 240Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu245 250 255Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr260 265 270
Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe275 280 285Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser290 295 300Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu305 310 315 320Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu325 330 335Asp Glu Val Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu340 345 350Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser355 360 365Glu Val Arg Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys370 375 380His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser385 390 395 400Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val405 410 415<210>5<211>1146<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(19)..(1146)<400>5agccgagcga gcccgagg atg gga ggg cac ccg cag ctc cgt ctc gtc aag 51Met Gly Gly His Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys1 5 10gcc ctt ctc ctt ctg ggg ctg aac ccc gtc tct gcc tcc ctc cag gac 99Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Asn Pro Val Ser Ala Ser Leu Gln Asp15 20 25cag cac tgc gag agc ctg tcc ctg gcc agc aac atc tca gac aat ggc 147Gln His Cys Glu Ser Leu Ser Leu Ala Ser Asn Ile Ser Asp Asn Gly30 35 40tac cgg gag tgc ctg gcc aat ggc agc tgg gcc gcc cgc gtg aat tac 195Tyr Arg Glu Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Ala Ala Arg Val Asn Tyr45 50 55tcc gag tgc cag gag atc ctc aat gag gag aaa aaa agc aag gtg cac 243Ser Glu Cys Gln Glu Ile Leu Asn Glu Glu Lys Lys Ser Lys Val His60 65 70 75tac cat gtc gca gtc atc atc aac tac ctg ggc cac tgt atc tcc ctg 291Tyr His Val Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys Ile Ser Leu
80 85 90gtg gcc ctc ctg gtg gcc ttt gtc ctc ttt ctg cgg ctc agg agc atc339Val Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu Arg Ser Ile95 100 105cgg tgc ctg cga aac atc atc cac tgg aac ctc atc tcc gcc ttc atc387Arg Cys Leu Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser Ala Phe Ile110 115 120ctg cgc aac gcc acc tgg ttc gtg gtc cag cta acc atg agc ccc gag435Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met Ser Pro Glu125 130 135gtc cac cag agc aac gtg ggc tgg tgc agg ttg gtg aca gcc gcc tac483Val His Gln Ser Asn Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr Ala Ala Tyr140 145 150 155aac tac ttc cat gtg acc aac ttc ttc tgg atg ttc ggc gag ggc tgc531Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly Glu Gly Cys160 165 170tac ctg cac aca gcc atc gtg ctc acc tac tcc act gac cgg ctg cgc579Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp Arg Leu Arg175 180 185aaa tgg atg ttc atc tgc att ggc tgg ggt gtg ccc ttc ccc atc att627Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe Pro Ile Ile190 195 200gtg gcc tgg gcc att ggg aag ctg tac tac gac aat gag aag tgc tgg675Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu Lys Cys Trp205 210 215ttt ggc aaa agg cct ggg gtg tac acc gac tac atc tac cag ggc ccc723Phe Gly Lys Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro220 225 230 235atg atc ctg gtc ctg ctg atc aat ttc atc ttc ctt ttc aac atc gtc771Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe Asn Ile Val240 245 250cgc atc ctc atg acc aag ctc cgg gca tcc acc acg tct gag acc att819Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile255 260 265cag tac agg aag gct gtg aaa gcc act ctg gtg ctg ctg ccc ctc ctg867Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu270 275 280ggc atc acc tac atg ctg ttc ttc gtc aat ccc ggg gag gat gag gtc915Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Glu Val285 290 295tcc cgg gtc gtc ttc atc tac ttc aac tcc ttc ctg gaa tcc ttc cag963Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu Ser Phe Gln300 305 310 315ggc ttc ttt gtg tct gtg ttc tac tgt ttc ctc aat agt gag gtc cgt 1011Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val Arg320 325 330tct gcc atc cgg aag agg tgg cac cgg tgg cag gac aag cac tcg atc 1059Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys His Ser Ile335 340 345cgt gcc cga gtg gcc cgt gcc atg tcc atc ccc acc tcc cca acc cgt 1107Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg
350 355 360gtc agc ttt cac agc atc aag cag tcc aca gca gtc tga 1146Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val365 370 375<210>6<211>375<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>6Met Gly Gly His Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Gly Leu Asn Pro Val Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser20 25 30Leu Ser Leu Ala Ser Asn Ile Ser Asp Asn Gly Tyr Arg Glu Cys Leu35 40 45Ala Asn Gly Ser Trp Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Glu Cys Gln Glu50 55 60Ile Leu Asn Glu Glu Lys Lys Ser Lys Val His Tyr His Val Ala Val65 70 75 80Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys Ile Ser Leu Val Ala Leu Leu Val85 90 95Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn100 105 110Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser Ala Phe Ile Leu Arg Asn Ala Thr115 120 125Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met Ser Pro Glu Val His Gln Ser Asn130 135 140Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe His Val145 150 155 160Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala165 170 175Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp Arg Leu Arg Lys Trp Met Phe Ile180 185 190Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile195 200 205Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Pro210 215 220
Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu225 230 235 240Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr245 250 255Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala260 265 270Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met275 280 285Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Glu Val Ser Arg Val Val Phe290 295 300Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser305 310 315 320Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val Arg Ser Ala Ile Arg Lys325 330 335Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala340 345 350Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser355 360 365Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val370 375<210>7<211>1206<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1206)<400>7atg gga ggg cac ccg cag ctc cgt ctc gtc aag gcc ctt ctc ctt ctg 48Met Gly Gly His Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ggg ctg aac ccc gtc tct gcc tcc ctc cag gac cag cac tgc gag agc 96Gly Leu Asn Pro Val Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser20 25 30ctg tcc ctg gcc agc aac atc tca gga ctg cag tgc aac gca tcc gtg 144Leu Ser Leu Ala Ser Asn Ile Ser Gly Leu Gln Cys Asn Ala Ser Val35 40 45gac ctc att ggc acc tgc tgg ccc cgc agc cct gcg ggg cag cta gtg 192Asp Leu Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Leu Val50 55 60gtt cgg ccc tgc cct gcc ttt ttc tat ggt gtc cgc tac aat acc aca 240
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Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg320 325 330aag gca gtg aag gcc acc ctg gtg ctc ctg ccc ctc ctg ggc atc acc1117Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr335 340 345tac atg ctc ttc ttc gtc aat ccc ggg gag gac gac ctg tca cag atc1165Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Asp Leu Ser Gln Ile350 355 360 365atg ttc atc tat ttc aac tcc ttc ctg cag tcg ttc cag ggt ttc ttc1213Met Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly Phe Phe370 375 380gtg tct gtc ttc tac tgc ttc ttc aat gga gag gtg cgc tca gcc gtg1261Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Arg Ser Ala Val385 390 395agg aag agg tgg cac cgc tgg cag gac cat cac tcc ctt cga gtc ccc1309Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp His His Ser Leu Arg Val Pro400 405 410atg gcc cgg gcc atg tcc atc cct aca tca ccc aca cgg atc agc ttc1357Met Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile Ser Phe415 420 425cac agc atc aag cag acg gcc gct gtg tga cccctcggtc gcccacctgc 1407His Ser Ile Lys Gln Thr Ala Ala Val430 435acagctcccc tgtcctcctc caccttcttc ctctgggttc tctgtgctgg gcaggctctc 1467gtggggcagg agatgggagg ggagagacca gctctccagc ctggcaggaa agagggggtg 1527cggcagccaa gggggactgc aagggacagg gatgagtggg ggccaccagg ctcagcgcaa 1587gaggaagcag agg 1600<210>12<211>438<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>12Met Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Leu Leu Tyr Val Pro His Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Leu Leu Cys Leu Leu Pro Pro Pro Leu Gln Tyr Ala Ala20 25 30Gly Gln Ser Gln Met Pro Lys Asp Gln Pro Leu Trp Ala Leu Leu Glu35 40 45Gln Tyr Cys His Thr Ile Met Thr Leu Thr Asn Leu Ser Gly Pro Tyr50 55 60Ser Tyr Cys Asn Thr Thr Leu Asp Gln Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg65 70 75 80Ser Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Arg Pro Cys Pro Glu Tyr Phe Asn85 90 95
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gcc ttc ctg ctt ttc ctg gcc ctg cgg agc att cgc tgt ctg cgg aat556Ala Phe Leu Leu Phe Leu Ala Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn120 125 130 135gtg att cac tgg aac ctc atc acc acc ttt atc ctg cga aat gtc atg604Val Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Thr Phe Ile Leu Arg Asn Val Met140 145 150tgg ttc ctg ctg cag ctc gtt gac cat gaa gtg cac gag agc aat gag652Trp Phe Leu Leu Gln Leu Val Asp His Glu Val His Glu Ser Asn Glu155 160 165gtc tgg tgc cgc tgc atc acc acc atc ttc aac tac ttc gtg gtg acc700Val Trp Cys Arg Cys Ile Thr Thr Ile Phe Asn Tyr Phe Val Val Thr170 175 180aac ttc ttc tgg atg ttt gtg gaa ggc tgc tac ctg cac acg gcc att748Asn Phe Phe Trp Met Phe Val Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile185 190 195gtc atg acc tac tcc act gag cgc ctg cgc aag tgc ctc ttc ctc ttc796Val Met Thr Tyr Ser Thr Glu Arg Leu Arg Lys Cys Leu Phe Leu Phe200 205 210 215atc gga tgg tgc atc ccc ttc ccc atc atc gtc gcc tgg gcc atc ggc844Ile Gly Trp Cys Ile Pro Phe Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly220 225 230aag ctc tac tat gag aat gaa cag tgc tgg ttt ggc aag gag cct ggc892Lys Leu Tyr Tyr Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe Gly Lys Glu Pro Gly235 240 245gac ctg gtg gac tac atc tac caa ggc ccc atc att ctc gtg ctc ctg940Asp Leu Val Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Ile Ile Leu Val Leu Leu250 255 260atc aat ttc gta ttt ctg ttc aac atc gtc agg atc cta atg aca aag988Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys265 270 275tta cgc gcg tcc acc aca tcc gag aca atc cag tac agg aag gca gtg1036Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val280 285 290 295aag gcc acc ctg gtg ctc ctg ccc ctc ctg ggc atc acc tac atg ctc1084Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu300 305 310ttc ttc gtc aat ccc ggg gag gac gac ctg tca cag atc atg ttc atc1132Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Asp Leu Ser Gln Ile Met Phe Ile315 320 325tat ttc aac tcc ttc ctg cag tcg ttc cag ggt ttc ttc gtg tct gtc1180Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val330 335 340ttc tac tgc ttc ttc aat gga gag gtg cgc tca gcc gtg agg aag agg1228Phe Tyr Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Arg Ser Ala Val Arg Lys Arg345 350 355tgg cac cgc tgg cag gac cat cac tcc ctt cga gtc ccc atg gcc cgg1276Trp His Arg Trp Gln Asp His His Ser Leu Arg Val Pro Met Ala Arg360 365 370 375gcc atg tcc atc cct aca tca ccc aca cgg atc agc ttc cac agc atc1324Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile Ser Phe His Ser Ile380 385 390
aag cag acg gcc gct gtg tga cccctcggtc gcccacctgc acagctcccc 1375Lys Gln Thr Ala Ala Val395tgtcctcctc caccttcttc ctctgggttc tctgtgctgg gcaggctctc gtggggcagg 1435agatgggagg ggagagacca gctctccagc ctggcaggaa agagggggtg cggcagccaa 1495gggggactgc aagggacagg gatgagtggg ggccaccagg ctcagcgcaa gaggaagcag 1555agg1558<210>14<211>397<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>14Met Gly Arg Glu Pro Trp Pro Glu Asp Arg Asp Leu Gly Phe Pro Gln1 5 10 15Leu Phe Cys Gln Gly Pro Tyr Ser Tyr Cys Asn Thr Thr Leu Asp Gln20 25 30Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg Ser Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Arg35 40 45Pro Cys Pro Glu Tyr Phe Asn Gly Val Lys Tyr Asn Thr Thr Arg Asn50 55 60Ala Tyr Arg Glu Cys Leu Glu Asn Gly Thr Trp Ala Ser Lys Ile Asn65 70 75 80Tyr Ser Gln Cys Glu Pro Ile Leu Asp Asp Lys Gln Arg Lys Tyr Asp85 90 95Leu His Tyr Arg Ile Ala Leu Val Val Asn Tyr Leu Gly His Cys Val100 105 110Ser Val Ala Ala Leu Val Ala Ala Phe Leu Leu Phe Leu Ala Leu Arg115 120 125Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Val Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Thr130 135 140Phe Ile Leu Arg Asn Val Met Trp Phe Leu Leu Gln Leu Val Asp His145 150 155 160Glu Val His Glu Ser Asn Glu Val Trp Cys Arg Cys Ile Thr Thr Ile165 170 175Phe Asn Tyr Phe Val Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Val Glu Gly180 185 190Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Met Thr Tyr Ser Thr Glu Arg Leu
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atc cac tgg aac ctc atc acc acc ttc atc ctg aga aac atc acg tgg713Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Thr Phe Ile Leu Arg Asn Ile Thr Trp155 160 165ttc ctg ctg caa ctc atc gac cac gaa gtg cat gag ggc aat gag gtc761Phe Leu Leu Gln Leu Ile Asp His Glu Val His Glu Gly Asn Glu Val170 175 180tgg tgc cgc tgc gtc acc acc ata ttc aac tac ttt gtg gtc acc aac809Trp Cys Arg Cys Val Thr Thr Ile Phe Asn Tyr Phe Val Val Thr Asn185 190 195ttc ttc tgg atg ttt gtg gaa ggc tgc tac ctg cac acg gcc atc gtc857Phe Phe Trp Met Phe Val Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val200 205 210atg acg tac tcc acg gag cat ctg cgc aag tgg ctc ttc ctc ttc att905Met Thr Tyr Ser Thr Glu His Leu Arg Lys Trp Leu Phe Leu Phe Ile215 220 225 230gga tgg tgc ata ccc tgc cct atc att gtc gcc tgg gca gtt ggc aaa953Gly Trp Cys Ile Pro Cys Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Val Gly Lys235 240 245ctc tac tat gag aat gag cag tgc tgg ttt ggc aag gaa cct ggt gac1001Leu Tyr Tyr Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe Gly Lys Glu Pro Gly Asp250 255 260tta gtg gac tac atc tac cag ggc ccc atc atc ctc gtg ctc ctc atc1049Leu Val Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Ile Ile Leu Val Leu Leu Ile265 270 275aat ttt gtg ttt ctg ttc aac atc gtc agg atc ctg atg aca aaa ctg1097Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu280 285 290cga gcc tcc acc aca tcc gag acc atc cag tac agg aag gca gtg aag1145Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys295 300 305 310gcc acc ctg gtc ctc ctc ccc ctg ttg ggc atc acc tac atg ctc ttc1193Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe315 320 325ttt gtc aat cct gga gag gac gac ctg tca cag att gtg ttc atc tac1241Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Asp Leu Ser Gln Ile Val Phe Ile Tyr330 335 340ttc aac tct ttc ctg cag tcc ttt cag ggt ttc ttt gtg tcc gtt ttc1289Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe345 350 355tac tgc ttc ttc aat gga gag gtg cgc tcc gcc ctg aga aag cgg tgg1337Tyr Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Arg Ser Ala Leu Arg Lys Arg Trp360 365 370cac cgt tgg cag gac cac cac gcc ctc cga gtg cct gtg gcc cgg gcc1385His Arg Trp Gln Asp His His Ala Leu Arg Val Pro Val Ala Arg Ala375 380 385 390atg tcc att ccc aca tcg ccc acc agg atc agc ttc cac agc atc aag1433Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile Ser Phe His Ser Ile Lys395 400 405cag aca gct gcc gtg tga tcccctgtca cccatctgcc cagcactcca 1481Gln Thr Ala Ala Val410
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Trp Leu Phe Leu Phe Ile Gly Trp Cys Ile Pro Cys Pro Ile Ile Val225 230 235 240Ala Trp Ala Val Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe245 250 255Gly Lys Glu Pro Gly Asp Leu Val Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Ile260 265 270Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg275 280 285Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln290 295 300Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly305 310 315 320Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Asp Leu Ser325 330 335Gln Ile Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly340 345 350Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Arg Ser355 360 365Ala Leu Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp His His Ala Leu Arg370 375 380Val Pro Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile385 390 395 400Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Thr Ala Ala Val405 410<210>19<211>1514<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(44)..(1339)<400>19gatccctatc cctgagcaag cgagtggcag gatctggtgt ccc atg ggg cac cca 55Met Gly His Pro1ggc tct ctt ccc agt gca caa ctc ctc ctc tgc cta tac tct ctg ctc103Gly Ser Leu Pro Ser Ala Gln Leu Leu Leu Cys Leu Tyr Ser Leu Leu5 10 15 20cca ctg ctc cag gtg gcc caa cca ggc agg cca ctc cag gac cag ccc151
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<221>CDS<222>(132)..(1424)<400>25gggcattacc ttggtgggta ggtcgggcag ggtaggacag gcctaagaga gaggccggac60agacctcctt tggaagcagc cacttctggt ccccatccct ggagcgatcg agcggcagga 120tctgctgtcc c atg ggg acc cca ggc tct ctt ccc agt gca cag ctt ctc170Met Gly Thr Pro Gly Ser Leu Pro Ser Ala Gln Leu Leu1 5 10ctc tgc ctg ttt tcc ctg ctt cca gtg ctc cag gtg gcc caa cca ggc 218Leu Cys Leu Phe Ser Leu Leu Pro Val Leu Gln Val Ala Gln Pro Gly15 20 25
cag gca ccc cag gac cag ccc ctg tgg aca ctt ttg gag cag tac tgc266Gln Ala Pro Gln Asp Gln Pro Leu Trp Thr Leu Leu Glu Gln Tyr Cys30 35 40 45cac agg acc aca att ggg aat ttt tca ggt ccc tac acc tac tgc aac314His Arg Thr Thr Ile Gly Asn Phe Ser Gly Pro Tyr Thr Tyr Cys Asn50 55 60acg acc ttg gac cag atc ggg acc tgc tgg cca cag agc gca ccc gga362Thr Thr Leu Asp Gln Ile Gly Thr Cys Trp Pro Gln Ser Ala Pro Gly65 70 75gcc cta gta gag aga ccg tgc ccc gag tac ttc aat ggc atc aag tac410Ala Leu Val Glu Arg Pro Cys Pro Glu Tyr Phe Asn Gly Ile Lys Tyr80 85 90aac acg acc cgg aat gcc tac aga gag tgc ctg gag aac ggg acc tgg458Asn Thr Thr Arg Asn Ala Tyr Arg Glu Cys Leu Glu Asn Gly Thr Trp95 100 105gcc tca agg gtc aac tac tca cac tgc gaa ccc att ttg gat gac aag506Ala Ser Arg Val Asn Tyr Ser His Cys Glu Pro Ile Leu Asp Asp Lys110 115 120 125aga aag tat gac ctg cat tac cga atc gcc ctc att gtc aac tac ctg554Arg Lys Tyr Asp Leu His Tyr Arg Ile Ala Leu Ile Val Asn Tyr Leu130 135 140ggt cac tgt gtt tcc gtg gtg gcc ctg gtg gcc gct ttc ctg ctt ttc602Gly His Cys Val Ser Val Val Ala Leu Val Ala Ala Phe Leu Leu Phe145 150 155cta gtg ctg cgg agt atc cgc tgc ctg agg aat gtg atc cac tgg aac650Leu Val Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Val Ile His Trp Asn160 165 170ctc atc acc acc ttc att ctg aga aac atc gcg tgg ttc ctg ctg caa698Leu Ile Thr Thr Phe Ile Leu Arg Asn Ile Ala Trp Phe Leu Leu Gln175 180 185ctc atc gac cac gaa gtg cac gag ggc aat gag gtc tgg tgc cgc tgc746Leu Ile Asp His Glu Val His Glu Gly Asn Glu Val Trp Cys Arg Cys190 195 200 205atc acc acc atc ttc aac tat ttt gtg gtc aec aac ttc ttc tgg atg794Ile Thr Thr Ile Phe Asn Tyr Phe Val Val Thr Asn Phe Phe Trp Met210 215 220ttt gtg gag ggc tgc tac ctg cac acg gcc att gtc atg acg tac tcc842Phe Val Glu Gly Cys Tyr Leu Hi s Thr AlaIle Val Met Thr Tyr Ser225 230 235aca gag cac ctg cgc aag tgg ctt ttc ctc ttc att gga tgg tgc att890Thr Glu His Leu Arg Lys Trp Leu Phe Leu Phe Ile Gly Trp Cys Ile240 245 250ccc tgc cct atc atc atc gcc tgg gca gtt ggc aaa ctc tac tat gag938Pro Cys Pro Ile Ile Ile Ala Trp Ala Val Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu255 260 265aat gag cag tgc tgg ttt ggc aag gaa gct ggt gat ttg gtg gac tac986Asn Glu Gln Cys Trp Phe Gly Lys Glu Ala Gly Asp Leu Val Asp Tyr270 275 280 285atc tac cag ggc ccc gtc atg ctt gtg ctg ttg atc aat ttt gta ttt1034Ile Tyr Gln Gly Pro Val Met Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Val Phe290 295 300
ctg ttt aac atc gtc agg atc ctg atg acg aag tta cga gca tcc acc 1082Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr305 310 315acg tcc gag aca atc caa tac agg aag gca gtg aag gcc acg ctg gtc 1130Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val320 325 330ctc ctc ccc ctg ttg ggc atc acc tac atg ctc ttc ttt gtc aat cct 1178Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro335 340 345ggc gag gac gac ctg tcc cag att gtg ttc atc tac ttc aac tct ttc 1226Gly Glu Asp Asp Leu Ser Gln Ile Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe350 355 360 365ctg cag tcc ttc cag ggt ttc ttt gtg tcc gtt ttc tac tgc ttc ttc 1274Leu Gln Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Phe370 375 380aat gga gag gtg cgc gcg gcc ctg aga aac ggg tgg cac cgc tgg cag 1322Asn Gly Glu Val Arg Ala Ala Leu Arg Asn Gly Trp His Arg Trp Gln385 390 395gac cac cac gcc ctc cgg gtg cct gtg gcc cgg gcc atg tcc atc cct 1370Asp His His Ala Leu Arg Val Pro Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro400 405 410acg tcg ccc acc agg atc agc ttc cac agc atc aag cag aca gct gct 1418Thr Ser Pro Thr Arg Ile Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Thr Ala Ala415 420 425gtg tga ccctctgtca ccgtctgccc ggcagtccac cactgaggca gcttctccat 1474Val430cctttacagc cttcccctgg gtcctccttg ctaccctgac ccacagggta caaggtacag1534gagaagggag gagaacgaac actcccgcct ggaaggaaag gaaagctatg acatgggggg1594gctctgaagg accagggccc agtgcagcca gccacacatc tccaagcacg aaggagcagg1654aggacatcac aggaccctca gaagggatgc atctcacacc atcaagcctc tgtgcaccca1714gcctcttttg tggggtcctc actgcagcac catttacatc tgaagaaact gaggctcaga1774gcaggcaggg acctggccaa gtcacatagc tacttgcccc acccacagca cccacagttg1834gctctgctcc ttgctttcca tctccacacg tgagggcgcc ctctaaaggt gagggagaca1894agaatgacct tatctggctt catcccagaa gctgtcgagc agagatgacc agccctttac1954caaggtagcc ttcttcttcc ccagtctgtt tcccatgtgt ctccaggaga atgctggctt2014tcagtcggcc atccctcctg ggagtcccca attcagtctg ggctcagtct ggggacctag2074accacgggaa gtgagttaga tggaaagtca cactctccac agtgccagac agaagggaga2134acagaagcgc ctggggaaga agggtgagga tcccccaaat cagagtatgc ctgggagtga2194ttgaaacaag ggccccagga tctcagtgac atcagccagg catctgtgga gttggccaca2254attcaagcaa cgagatgttg gagagatatt gtgagccagt aataaaggca gaatgtctgc2314aggacatatc catgcccctc ttcttactgg ctaggcccaa gcaggccttc ctgtggagtc2374tttaggttca aagggcccga atcattcctg tcaccccaaa gggtggcatc tgcaccaccc2434
ccagcgtaga ccccacctgt gccagggact aatattctgg aattgggagg gagaggaggc 2494aaggcccttc aggctccgaa agcaagaaga cacagtttga tttcaggctt ctcttccatt 2554cctctgtccc tggagcagaa gaggggtgtt ggggcaagcc aacagacttg aaaaggcccc 2614cgg2617<210>26<211>430<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>26Met Gly Thr Pro Gly Ser Leu Pro Ser Ala Gln Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15Phe Ser Leu Leu Pro Val Leu Gln Val Ala Gln Pro Gly Gln Ala Pro20 25 30Gln Asp Gln Pro Leu Trp Thr Leu Leu Glu Gln Tyr Cys His Arg Thr35 40 45Thr Ile Gly Asn Phe Ser Gly Pro Tyr Thr Tyr Cys Asn Thr Thr Leu50 55 60Asp Gln Ile Gly Thr Cys Trp Pro Gln Ser Ala Pro Gly Ala Leu Val65 70 75 80Glu Arg Pro Cys Pro Glu Tyr Phe Asn Gly Ile Lys Tyr Asn Thr Thr85 90 95Arg Asn Ala Tyr Arg Glu Cys Leu Glu Asn Gly Thr Trp Ala Ser Arg100 105 110Val Asn Tyr Ser His Cys Glu Pro Ile Leu Asp Asp Lys Arg Lys Tyr115 120 125Asp Leu His Tyr Arg Ile Ala Leu Ile Val Asn Tyr Leu Gly His Cys130 135 140Val Ser Val Val Ala Leu Val Ala Ala Phe Leu Leu Phe Leu Val Leu145 150 155 160Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Val Ile His Trp Asn Leu Ile Thr165 170 175Thr Phe Ile Leu Arg Asn Ile Ala Trp Phe Leu Leu Gln Leu Ile Asp180 185 190His Glu Val His Glu Gly Asn Glu Val Trp Cys Arg Cys Ile Thr Thr195 200 205
Ile Phe Asn Tyr Phe Val Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Val Glu210 215 220Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Met Thr Tyr Ser Thr Glu His225 230 235 240Leu Arg Lys Trp Leu Phe Leu Phe Ile Gly Trp Cys Ile Pro Cys Pro245 250 255Ile Ile Ile Ala Trp Ala Val Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Asn Glu Gln260 265 270Cys Trp Phe Gly Lys Glu Ala Gly Asp Leu Val Asp Tyr Ile Tyr Gln275 280 285Gly Pro Val Met Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn290 295 300Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu305 310 315 320Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro325 330 335Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp340 345 350Asp Leu Ser Gln Ile Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser355 360 365Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Phe Asn Gly Glu370 375 380Val Arg Ala Ala Leu Arg Asn Gly Trp His Arg Trp Gln Asp His His385 390 395 400Ala Leu Arg Val Pro Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro405 410 415Thr Arg Ile Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Thr Ala Ala Val420 425 430<210>27<211>1248<212>DNA<213>绵羊(Ovis aries)<220>
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1 5 10 15ggg ctg aac tcc atc tcc gcc tcc ctc cag gac cag cat tgc gag agc 96Gly Leu Asn Ser Ile Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser20 25 30ttg tcc ctg gcc agc aac gtc tct gga ctg cag tgc aac gct tcc gtg144Leu Ser Leu Ala Ser Asn Val Ser Gly Leu Gln Cys Asn Ala Ser Val35 40 45gac ctt aat ggc acc tgc tgg ccc cag agt cct gca ggg cag ttg gtg192Asp Leu Asn Gly Thr Cys Trp Pro Gln Ser Pro Ala Gly Gln Leu Val50 55 60gtt cga ccc tgc ctc gta ttt ttc tat ggt gtc cgc tac aat acc aca240Val Arg Pro Cys Leu Val Phe Phe Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr65 70 75 80agc aat ggc tac cgg gtg tgc ctg gcc aat ggc acg tgg gca gcc cgc288Ser Asn Gly Tyr Arg Val Cys Leu Ala Asn Gly Thr Trp Ala Ala Arg85 90 95gtg aat cac tcc gag tgc caa gag atc ctc agc gaa gga gag aag agc336Val Asn His Ser Glu Cys Gln Glu Ile Leu Ser Glu Gly Glu Lys Ser100 105 110aag gcg cac tac cac atc gcc gtc atc atc aac tac ctg ggc cac tgc384Lys Ala His Tyr His Ile Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys115 120 125atc tcc ctg gcg gcc ctc ctg gtg gcc ttt gtc ctc ttt ctg cgg ctc432Ile Ser Leu Ala Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu130 135 140agg agc atc cgg tgc gtg aga aac atc atc cac tgg aac ctc atc tca480Arg Ser Ile Arg Cys Val Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser145 150 155 160gcc ttc atc ctg cgc aat gcc acg tgg ttc gtg gtc cag ctc acc atg528Ala Phe Ile Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met165 170 175agc ccc gaa gtc cat cag agc aac gtg ggc tgg tgc agg ctg gtg aca576Ser Pro Glu Val His Gln Ser Asn Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr180 185 190gcc gcc tac aac tac ttc cac gtg acc aac ttc ttc tgg atg ttc ggc624Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly195 200 205gag ggc tgc tac ctg cac acg gct gtc gtg ctc aca tac tcc acg gac672Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Val Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp210 215 220cgg ctg cgc aaa tgg atg ttt atc tgc atc ggc tgg ggt gtg ccc ttc720Arg Leu Arg Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe225 230 235 240ccc atc att gtg gcc tgg gcc att gga aag ttg tac tac gac aat gag768Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu245 250 255aag tgc tgg ttt ggc aaa agg cct ggg gtg tac act gat tac atc tac816Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr260 265 270cag ggc ccg atg atc ttg gtc ctg ctg atc aat ttc atc ttc ctt ttc864Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe
275 280 285aac atc gtt cgc atc ctc atg acc aaa ctc cgg gca tcc acc acc tct912Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser290 295 300gag acc att cag tac agg aag gct gtg aag gcc act ctg gtg ctg ctc960Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu305 310 315 320ccc ctc ctg ggc atc acg tac atg ctg ttc ttc gtg aac ccc ggg gag1008Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu325 330 335gac gag gtc tcc cgg gtc gtc ttc atc tac ttc aac tcc ttc ctg gaa1056Asp Glu Val Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu340 345 350tct ttc cag ggc ttc ttc gtg tct gtg ttc tac tgc ttc ctc aac agc1104Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser355 360 365gag gtc cgc tct gcc atc cgg aag agg tgg cac cgc tgg cag gac aag1152Glu Val Arg Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys370 375 380cac tca atc cgt gcc cgt gtg gct cgc gcc atg tcc atc ccc acc tcc1200His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser385 390 395 400ccc acc cgt gtc agc ttt cac agc atc aag cag tcc aca gca gtg tga1248Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val405 410 415<210>28<211>415<212>PRT<213>绵羊(Ovis aries)<400>28Met Gly Arg Arg Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Gly Leu Asn Ser Ile Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser20 25 30Leu Ser Leu Ala Ser Asn Val Ser Gly Leu Gln Cys Asn Ala Ser Val35 40 45Asp Leu Asn Gly Thr Cys Trp Pro Gln Ser Pro Ala Gly Gln Leu Val50 55 60Val Arg Pro Cys Leu Val Phe Phe Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr65 70 75 80Ser Asn Gly Tyr Arg Val Cys Leu Ala Asn Gly Thr Trp Ala Ala Arg85 90 95Val Asn His Ser Glu Cys Gln Glu Ile Leu Ser Glu Gly Glu Lys Ser100 105 110
Lys Ala His Tyr His Ile Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys115 120 125Ile Ser Leu Ala Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Leu Arg Leu130 135 140Arg Ser Ile Arg Cys Val Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Ser145 150 155 160Ala Phe Ile Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met165 170 175Ser Pro Glu Val His Gln Ser Asn Val Gly Trp Cys Arg Leu Val Thr180 185 190Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly195 200 205Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Val Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp210 215 220Arg Leu Arg Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe225 230 235 240Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu245 250 255Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr260 265 270Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe275 280 285Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser290 295 300Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu305 310 315 320Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu325 330 335Asp Glu Val Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu340 345 350Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser355 360 365Glu Val Arg Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys370 375 380
His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser385 390 395 400Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val405 410 415<210>29<211>1248<212>DNA<213>非洲蟾涂(Xenopus laevis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1248)<400>29atg ctg ttg gcc aaa act cca tgt cta cta ctg gtg cag gtg atc gct48Met Leu Leu Ala Lys Thr Pro Cys Leu Leu Leu Val Gln Val Ile Ala1 5 10 15gct gga atc agt ttt gcc ctc acc tct ctc cag gac caa tgt gaa acc96Ala Gly Ile Ser Phe Ala Leu Thr Ser Leu Gln Asp Gln Cys Glu Thr20 25 30ctg cag cac aat tct aac ttc aca ggt ctt gcc tgc aac gct tcc att144Leu Gln His Asn Ser Asn Phe Thr Gly Leu Ala Cys Asn Ala Ser Ile35 40 45gat atg atc ggc act tgc tgg ccc agt act gca gct gga cag atg gtg192Asp Met Ile Gly Thr Cys Trp Pro Ser Thr Ala Ala Gly Gln Met Val50 55 60gcc aga ccc tgc ccc gag tac ttc cat ggg gtg caa tac aac aca aca240Ala Arg Pro Cys Pro Glu Tyr Phe His Gly Val Gln Tyr Asn Thr Thr65 70 75 80ggg aat gtg tac aga gaa tgt cac ctg aac ggc agc tgg gct ggg aga288Gly Asn Val Tyr Arg Glu Cys His Leu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Arg85 90 95gga gac tac gct caa tgc cag gag att cta aag caa gag aag aaa acc336Gly Asp Tyr Ala Gln Cys Gln Glu Ile Leu Lys Gln Glu Lys Lys Thr100 105 110aaa gtt cat tat cac ata gcc atc gtg att aac ttc ctg ggt cac tcc384Lys Val His Tyr His Ile Ala Ile Val Ile Asn Phe Leu Gly His Ser115 120 125att tcc ctt tgt gct ctc ctg gtg gct ttt atc ctg ttc ttg agg ttg432Ile Ser Leu Cys Ala Leu Leu Val Ala Phe Ile Leu Phe Leu Arg Leu130 135 140agg agc atc cgg tgc cta cgt aat atc atc cac tgg aac ctg atc acg480Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Thr145 150 155 160gct ttt att ctg cgt aat gta acc tgg ttt gtg atg cag ctc act ctc528Ala Phe Ile Leu Arg Asn Val Thr Trp Phe Val Met Gln Leu Thr Leu165 170 175agc cat gaa gcc cac gac agc aat gtg gtt tgg tgc cgc ctg gtc acc576Ser His Glu Ala His Asp Ser Asn Val Val Trp Cys Arg Leu Val Thr180 185 190atc gct cac aat tat ttt tat gtt acc aac ttc ttc tgg atg ttt ggg624
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Ile Ser Gln Ile Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu Ser Phe370 375 380Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val385 390 395 400Arg Ser Ala Val Arg Lys Arg Trp His Arg Arg Gln Asp Lys His Ser405 410 415Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr420 425 430Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Ser Ala Val435 440 445<210>35<211>1442<212>DNA<213>Ameiurus nebulosus<220>
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atc att aac tac ctg ggt cac tgc ttg tca ctg ttc act ctt ctt atc548Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys Leu Ser Leu Phe Thr Leu Leu Ile135 140 145gcc ttc ata atc ttc tta cga ctc agg agt att cgc tgt tta agg aac596Ala Phe Ile Ile Phe Leu Arg Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn150 155 160 165atc atc cac tgg aat cta acc tct gcc ttc atc ctg aga aat gcg acg644Ile Ile His Trp Asn Leu Thr Ser Ala Phe Ile Leu Arg Asn Ala Thr170 175 180tgg ttc atc gtt cag ctc acc atg aac cct gat gta cac gag agc aac692Trp Phe Ile Val Gln Leu Thr Met Asn Pro Asp Val His Glu Ser Asn185 190 195gtg cca tgg tgc cgt tta gtg acg acg gca tat aac tac ttc cac atg740Val Pro Trp Cys Arg Leu Val Thr Thr Ala Tyr Asn Tyr Phe His Met200 205 210gcc aat ttt ttc tgg atg ttc ggc gaa ggc tgt tat ctt cac aca gcc788Ala Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala215 220 225atc gtg ctc acc tac tcc act gac aaa ctc aag aaa tgg atg ttc atc836Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp Lys Leu Lys Lys Trp Met Phe Ile230 235 240 245tgc atc gga tgg tgt att cct tcg cct att atc gtc gcc tgg gcc atc884Cys Ile Gly Trp Cys Ile Pro Ser Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile250 255 260gga aag ctg tac tac gac aac gag aag tgt tgg ttt ggg aag aga gca932Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Ala265 270 275ggc ata tac aca gac tac atc tac cag ggc ccc atg atc ctg gta ctt980Gly lle Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu280 285 290atg atc aat ttc gtg ttc ctc ttc aac ata gta agg atc ctc atg acc1028Met Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr295 300 305aaa ctc cgg gcc tcc acc aca tcc gaa acc atc cag tac agg aag gcg1076Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala310 315 320 325gtg aag gcc acg ctc gtg tta ctg cct ctg ctc ggg atc acg tac atg1124Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met330 335 340ctg ttc ttc gta aac cca gga gag gac gaa atc tcg cag atc gtc ttc1172Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Glu Ile Ser Gln Ile Val Phe345 350 355atc tac ttc aat tcc ttt ctg cag tcc ttt cag ggc ttc ttt gtg tcc1220Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser360 365 370gtg ttc tac tgt ttt cta aac agc gag gtc cgc tcg gct gtt cgg aag1268Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val Arg Ser Ala Val Arg Lys375 380 385cac tgg cac cgc tgg cag gac cac cat tcc atc cgc gca cga gtt gcg1316His Trp His Arg Trp Gln Asp His His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala390 395 400 405
aga gcg atg tcc att ccc acc tca cct tcg cgc ctc agc ttc cac agc 1364Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Ser Arg Leu Ser Phe His Ser410 415 420atc aaa cag tcc acc tct gtc tga tacagggacg cataacattg aaaaagaaag1418Ile Lys Gln Ser Thr Ser Val425aggcaggcac tctatcagtg agga 1442<210>36<211>428<212>PRT<213>Ameiurus nebulosus<400>36Met Trp Ile Cys Leu Met Leu Lys Val Leu Ser Ile Leu Ser Phe Val1 5 10 15Val Val Lys Val Ser Ala Asp Leu Thr Cys Asp Ala Val Leu Met Leu20 25 30Ala Ser Gly Asn His Thr Leu Tyr His Leu Asp Ala Ala Asn His Ser35 40 45Asp Thr Asn Asn Ser Gly Val Phe Cys Ser Thr Val Ile Asp Gly Ile50 55 60Gly Thr Cys Trp Pro Arg Ser Val Ala Gly Glu Met Val Ser Arg Pro65 70 75 80Cys Pro Glu Phe Leu Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr Asn Lys Ile85 90 95Phe Arg Lys Cys Leu Ala Asn Gly Thr Trp Ala Pro Lys Ser Asn Tyr100 105 110Ser Gln Cys Lys Ala Ile Leu Asn Val Gln Arg Lys Ser Lys Leu His115 120 125Tyr Arg Ile Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys Leu Ser Leu130 135 140Phe Thr Leu Leu Ile Ala Phe Ile Ile Phe Leu Arg Leu Arg Ser Ile145 150 155 160Arg Cys Leu Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Thr Ser Ala Phe Ile165 170 175Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Ile Val Gln Leu Thr Met Asn Pro Asp180 185 190Val His Glu Ser Asn Val Pro Trp Cys Arg Leu Val Thr Thr Ala Tyr195 200 205
Asn Tyr Phe His Met Ala Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly Glu Gly Cys210 215 220Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp Lys Leu Lys225 230 235 240Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Cys Ile Pro Ser Pro Ile Ile245 250 255Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu Lys Cys Trp260 265 270Phe Gly Lys Arg Ala Gly Ile Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro275 280 285Met Ile Leu Val Leu Met Ile Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val290 295 300Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile305 310 315 320Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu325 330 335Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Glu Ile340 345 350Ser Gln Ile Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln355 360 365Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val Arg370 375 380Ser Ala Val Arg Lys His Trp His Arg Trp Gln Asp His His Ser Ile385 390 395 400Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Ser Arg405 410 415Leu Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ser Val420 425<210>37<211>1218<212>DNA<213>Ameiurus nebulosus<220>
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Met Glu Val Ser Leu Leu Glu Leu Leu Ser Val Glu Val Asn Cys Ser1 5 10 15ctc gcg gac gcg ttt gga gac cct gcg tac gga aac gca tca gac gct 96Leu Ala Asp Ala Phe Gly Asp Pro Ala Tyr Gly Asn Ala Ser Asp Ala20 25 30ctg tac tgc aac gcc acg gcg gat gag atc ggc acg tgc tgg ccg agg144Leu Tyr Cys Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg35 40 45agc ggc gcg ggg aga gtg gtg gcg cgg ccg tgc ccc gac ttc atc aac192Ser Gly Ala Gly Arg Val Val Ala Arg Pro Cys Pro Asp Phe Ile Asn50 55 60ggg gtc aag tac aac agc acc agg agc gcg tat aga gaa tgc ctg gag240Gly Val Lys Tyr Asn Ser Thr Arg Ser Ala Tyr Arg Glu Cys Leu Glu65 70 75 80aac ggc aca tgg gct ttc aag atc aac tac tcc agc tgc gag ccc att288Asn Gly Thr Trp Ala Phe Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Cys Glu Pro Ile85 90 95tta gag gaa aag agg aag tac ccg gtc cac tac aag atc gct ctc atc336Leu Glu Glu Lys Arg Lys Tyr Pro Val His Tyr Lys Ile Ala Leu Ile100 105 110atc aac tat ttg gga cac tgc ata tct gta ggt gct ctc gtc atc gcc384Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys Ile Ser Val Gly Ala Leu Val Ile Ala115 120 125ttc gtt ctc ttc ctg tgc ttg aga agc atc cgg tgt ttg cgg aat gta432Phe Val Leu Phe Leu Cys Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Val130 135 140att cac tgg aat tta ata acc acc ttc atc ctg agg aac atc atg tgg480Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Thr Phe Ile Leu Arg Asn Ile Met Trp145 150 155 160ctt ctg ctg cag ctc atc gac cac aac atc cat gaa agg aac gag ccg528Leu Leu Leu Gln Leu Ile Asp His Asn Ile His Glu Arg Asn Glu Pro165 170 175tgg tgc cgc ctc ata acc acc gtc tat aac tat ttt gtg gtg acg aat576Trp Cys Arg Leu Ile Thr Thr Val Tyr Asn Tyr Phe Val Val Thr Asn180 185 190ttt ttc tgg atg ttc gtg gag ggc tgt tat ctt cac aca gcc atc gtt624Phe Phe Trp Met Phe Val Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val195 200 205atg acc tac tcc acc gac aag ctc cgg aag tgg gtc ttc ctc ttc atc672Met Thr Tyr Ser Thr Asp Lys Leu Arg Lys Trp Val Phe Leu Phe Ile210 215 220ggg tgg tgt att ccg tgt ccg gtc atc att gcg tgg gcc gtc ggg aag720Gly Trp Cys Ile Pro Cys Pro Val Ile Ile Ala Trp Ala Val Gly Lys225 230 235 240ctg tac aac gaa aac gaa cag tgc tgg ttt gga aaa gaa ccc gga aaa768Leu Tyr Asn Glu Asn Glu Gln Cys Trp Phe Gly Lys Glu Pro Gly Lys245 250 255tac gtg gac tac att tat cag ggt cct gtg att gtt gtt ctg ctg ata816Tyr Val Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Val Ile Val Val Leu Leu Ile260 265 270aac ttc gtg ttc ctg ttc aac atc gta cgt att ctc atg acg aag ctg864
Asn Phe Val Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu275 280 285cga gcc tcc acc acg tca gag acc ata cag tac agg aaa gcg gtg aag 912Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys290 295 300gcg acg tta gtg ctg ctt cct ctg ctc ggc atc aca tac atg ctg ttc 960Ala Thr Leu Val Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe305 310 315 320ttc gtg aat ccg ggg gat gat gac atc tca cag att gtc ttt att tat1008Phe Val Asn Pro Gly Asp Asp Asp Ile Ser Gln Ile Val Phe Ile Tyr325 330 335ttc aat tcc ttc ctg cag tcc ttt cag ggt ttc ttc gtc tca gtg ttt1056Phe Asn Ser Phe Leu Gln Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe340 345 350tac tgc ttc ctc aac ggt gag gta cgg tca gca gta agg aaa cgt tgg1104Tyr Cys Phe Leu Asn Gly Glu Val Arg Ser Ala Val Arg Lys Arg Trp355 360 365cac aga tgg cag gat aac cac gct ctc cgt gtt cgg gtt gcc agg gcg1152His Arg Trp Gln Asp Asn His Ala Leu Arg Val Arg Val Ala Arg Ala370 375 380atg tcc atc cca aca tca cct act cgc atc agc ttc cac agc att aaa1200Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile Ser Phe His Ser Ile Lys385 390 395 400cac acc acc gct gtg tga1218His Thr Thr Ala Val405<210>38<211>405<212>PRT<213>Ameiurus nebulosus<400>38Met Glu Val Ser Leu Leu Glu Leu Leu Ser Val Glu Val Asn Cys Ser1 5 10 15Leu Ala Asp Ala Phe Gly Asp Pro Ala Tyr Gly Asn Ala Ser Asp Ala20 25 30Leu Tyr Cys Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg35 40 45Ser Gly Ala Gly Arg Val Val Ala Arg Pro Cys Pro Asp Phe Ile Asn50 55 60Gly Val Lys Tyr Asn Ser Thr Arg Ser Ala Tyr Arg Glu Cys Leu Glu65 70 75 80Asn Gly Thr Trp Ala Phe Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Cys Glu Pro Ile85 90 95Leu Glu Glu Lys Arg Lys Tyr Pro Val His Tyr Lys Ile Ala Leu Ile100 105 110
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Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Ile Ser Phe His Ser Ile Lys385 390 395 400His Thr Thr Ala Val405<210>39<211>1248<212>DNA<213>家牛(Bos taurus)<220>
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gcc gcc tac aac tac ttc cac gtg acc aac ttc ttc tgg atg ttc ggt 624Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly195 200 205gag ggc tgc tac ctg cac acg gcc atc gtg ctc acg tac tcc aca gac 672Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp210 215 220cgg ctg cga aag tgg atg ttt atc tgc atc ggc tgg ggt gtg cct ttc 720Arg Leu Arg Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly Trp Gly Val Pro Phe225 230 235 240ccc atc att gtg gcc tgg gcc att ggg aag ctg tac tac gac aat gag 768Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu245 250 255aag tgc tgg ttt ggc aaa agg cct ggg gtg tac act gac tac atc tac 816Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr260 265 270cag ggc ccg atg atc ttg gtc ctg ctg atc aat ttc atc ttc ctt ttc 864Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe275 280 285aac atc gtc cgc atc ctc atg acc aaa ctc cgg gca tcc acc acc tct 912Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser290 295 300gag acc att cag tac agg aag gct gtg aag gcc act ctg gtg ctg ctc 960Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu305 310 315 320ccc ctc ctg ggc atc acg tac atg ctg ttc ttc gtg aac cct ggg gag1008Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu325 330 335gac gag gtc tcc agg gtc gtc ttc atc tac ttc aac tcc ttc ctg gaa1056Asp Glu Val Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu340 345 350tct ttc cag ggc ttc ttc gtg tct gtg ttc tac tgc ttc ctc aac agc1104Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser355 360 365gag gtc cgc tct gcc atc cgg aag agg tgg cac cgc tgg cag gac aag1152Glu Val Arg Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys370 375 380cac tca atc cgt gcc cgc gtg gct cgc gcc atg tcc atc ccc acc tcc1200His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser385 390 395 400ccc acc cgt gtc agc ttt cac agc atc aag cag tcc aca gca gtg tga1248Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val405 410 415<210>40<211>415<212>PRT<213>家牛(Bostaurus)<400>40Met Gly Arg Arg Pro Gln Leu Arg Leu Val Lys Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Gly Leu Asn Ser Ile Ser Ala Ser Leu Gln Asp Gln His Cys Glu Ser
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290 295 300Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu305 310 315 320Pro Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu325 330 335Asp Glu Val Ser Arg Val Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu340 345 350Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser355 360 365Glu Val Arg Ser Ala Ile Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys370 375 380His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser385 390 395 400Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln Ser Thr Ala Val405 410 415<210>41<211>1422<212>DNA<213>Gallus gallus<220>
<221>CDS<222>(138)..(1400)<400>41tcacagggag gttataaaag gcagtgagtg gggagcgggg cacgcggagc cacctgagca 60cgaggatttg gagccccgac ggcagcggga gcggagccgg ccatgccccg ggtcgttggg120tgcggaggga gctaagg atg gtg ccc ggc ccg cgt cct gcc ctc ctc ctc 170Met Val Pro Gly Pro Arg Pro Ala Leu Leu Leu1 5 10ctc ctc ttt ctc ctg cag gcg ttt ctc ctc tgg gat agt ccc gtt gca 218Leu Leu Phe Leu Leu Gln Ala Phe Leu Leu Trp Asp Ser Pro Val Ala15 20 25gcc tcc atc caa gag cag tac tgt gag agc ctg ctg ccc acc acc aac 266Ala Ser Ile Gln Glu Gln Tyr Cys Glu Ser Leu Leu Pro Thr Thr Asn30 35 40cac aca gga cct cag tgc aac gcc tcg gtg gac ctg att ggc acg tgc 314His Thr Gly Pro Gln Cys Asn Ala Ser Val Asp Leu Ile Gly Thr Cys45 50 55tgg ccc cgc agt gca gtg gga caa ctg gtg gct cgg ccc tgc ccc gag 362Trp Pro Arg Ser Ala Val Gly Gln Leu Val Ala Arg Pro Cys Pro Glu60 65 70 75tat ttc tac ggc gtg cgg tac aac acc aca aac aat ggc tac agg gaa 410Tyr Phe Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Thr Thr Asn Asn Gly Tyr Arg Glu80 85 90
tgc ctc gct aac ggg agc tgg gca gca cgg gtc aac tac tcc cag tgc 458Cys Leu Ala Asn Gly Ser Trp Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gln Cys95 100 105cag gag atc ctc agt gag gag aag agg agc aag ctg cac tac cac atc 506Gln Glu Ile Leu Ser Glu Glu Lys Arg Ser Lys Leu His Tyr His Ile110 115 120gct gtc atc atc aac tac ctg ggg cac tgc gtc tcg ctg ggg acc ctc 554Ala Val Ile Ile Asn Tyr Leu Gly His Cys Val Ser Leu Gly Thr Leu125 130 135ctt gtg gcc ttc gtc ctc ttc atg cgc ctg cgg agc atc cgg tgc ttg 602Leu Val Ala Phe Val Leu Phe Met Arg Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu140 145 150 155agg aac atc atc cac tgg aac ctg atc aca gcc ttc atc cta cgc aat 650Arg Asn Ile Ile His Trp Asn Leu Ile Thr Ala Phe Ile Leu Arg Asn160 165 170gcc acg tgg ttt gtg gtg cag ctc acg atg aac cca gag gtg cac gag 698Ala Thr Trp Phe Val Val Gln Leu Thr Met Asn Pro Glu Val His Glu175 180 185agc aac gtg gtc tgg tgc cgc ttg gtc act gct gcc tac aat tac ttc 746Ser Asn Val Val Trp Cys Arg Leu Val Thr Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe190 195 200cat gtc acc aac ttc ttc tgg atg ttt ggc gag ggc tgc tac ctg cac 794His Val Thr Asn Phe Phe Trp Met Phe Gly Glu Gly Cys Tyr Leu His205 210 215aca gcc atc gtc ctc acc tat tcc acc gac aag ctc cgc aag tgg atg 842Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Ser Thr Asp Lys Leu Arg Lys Trp Met220 225 230 235ttc atc tgc att ggc tgg tgt atc ccc ttt ccc atc att gtc gcc tgg 890Phe Ile Cys Ile Gly Trp Cys Ile Pro Phe Pro Ile Ile Val Ala Trp240 245 250gcc atc ggg aag ctg tac tac gac aac gag aag tgc tgg ttt ggg aag 938Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Asn Glu Lys Cys Trp Phe Gly Lys255 260 265cga gca gga gtt tat act gac tac atc tat caa ggt ccc atg atc ctg 986Arg Ala Gly Val Tyr Thr Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Met Ile Leu270 275 280gtg ctt ctg atc aac ttc atc ttt ctg ttc aac att gtt cgg att ctc1034Val Leu Leu Ile Asn Phe Ile Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu285 290 295atg acc aag ctc cga gca tca acc acg tca gag aca atc cag tac aga1082Met Thr Lys Leu Arg Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg300 305 310 315aaa gca gtc aag gct acg ctg gtg ctg ctg tcc ttg ctg gga atc acc1130Lys Ala Val Lys Ala Thr Leu Val Leu Leu Ser Leu Leu Gly Ile Thr320 325 330tac atg ctg ttc ttt gtc aat ccg ggg gag gat gag atc tcc agg atc1178Tyr Met Leu Phe Phe Val Asn Pro Gly Glu Asp Glu Ile Ser Arg Ile335 340 345gtc ttc atc tac ttc aac tcc ttc ctg gag tcc ttc cag ggc ttc ttt1226Val Phe Ile Tyr Phe Asn Ser Phe Leu Glu Ser Phe Gln Gly Phe Phe350 355 360
gtc tct gtc ttc tac tgc ttc ctg aac agc gag gtg cgt tcg gct gtg 1274Val Ser Val Phe Tyr Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val Arg Ser Ala Val365 370 375cgg aag cgg tgg cac cga tgg cag gac aag cac tcc atc cgc gct cgg 1322Arg Lys Arg Trp His Arg Trp Gln Asp Lys His Ser Ile Arg Ala Arg380 385 390 395gtg gct cgg gcc atg tcc atc ccc acc tcc cca acc cgg gtc agc ttc 1370Val Ala Arg Ala Met Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Val Ser Phe400 405 410cac agc atc aag cag tcc tca gca gtg tga ggcaggagga ggcagctgcc ga1422His Ser Ile Lys Gln Ser Ser Ala Val415 420<210>42<211>420<212>PRT<213>红原鸡(Gallus gallus)<400>42Met Val Pro Gly Pro Arg Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Leu1 5 10 15Gln Ala Phe Leu Leu Trp Asp Ser Pro Val Ala Ala Ser Ile Gln Glu20 25 30Gln Tyr Cys Glu Ser Leu Leu Pro Thr Thr Asn His Thr Gly Pro Gln35 40 45Cys Asn Ala Ser Val Asp Leu Ile Gly Thr Cys Trp Pro Arg Ser Ala50 55 60Val Gly Gln Leu Val Ala Arg Pro Cys Pro Glu Tyr Phe Tyr Gly Val65 70 75 80Arg Tyr Asn Thr Thr Asn Asn Gly Tyr Arg Glu Cys Leu Ala Asn Gly85 90 95Ser Trp Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gln Cys Gln Glu Ile Leu Ser100 105 110Glu Glu Lys Arg Ser Lys Leu His Tyr His Ile Ala Val Ile Ile Asn115 120 125Tyr Leu Gly His Cys Val Ser Leu Gly Thr Leu Leu Val Ala Phe Val130 135 140Leu Phe Met Arg Leu Arg Ser Ile Arg Cys Leu Arg Asn Ile Ile His145 150 155 160Trp Asn Leu Ile Thr Ala Phe lle Leu Arg Asn Ala Thr Trp Phe Val165 170 175
Val Gln Leu Thr Met Asn Pro Glu Val His Glu Ser Asn Val Val Trp180 185 190Cys Arg Leu Val Thr Ala Ala Tyr Asn Tyr Phe His Val Thr Asn Phe195 200 205Phe Trp Met Phe Gly Glu Gly Cys Tyr Leu His Thr Ala Ile Val Leu210 215 220Thr Tyr Ser Thr Asp Lys Leu Arg Lys Trp Met Phe Ile Cys Ile Gly225 230 235 240Trp Cys Ile Pro Phe Pro Ile Ile Val Ala Trp Ala Ile Gly Lys Leu245 250 255Tyr Tyr Asp Asn Glu Lys Cys Trp Phe Gly Lys Arg Ala Gly Val Tyr260 265 270Thr Asp Tyr Ile Tyr Gln Gly Pro Met Ile Leu Val Leu Leu Ile Asn275 280 285Phe Ile Phe Leu Phe Asn Ile Val Arg Ile Leu Met Thr Lys Leu Arg290 295 300Ala Ser Thr Thr Ser Glu Thr Ile Gln Tyr Arg Lys Ala Val Lys Ala305 310 315 320Thr Leu Val Leu Leu Ser Leu Leu Gly Ile Thr Tyr Met Leu Phe Phe325 330 335Val Asn Pro Gly Glu Asp Glu Ile Ser Arg Ile Val Phe Ile Tyr Phe340 345 350Asn Ser Phe Leu Glu Ser Phe Gln Gly Phe Phe Val Ser Val Phe Tyr355 360 365Cys Phe Leu Asn Ser Glu Val Arg Ser Ala Val Arg Lys Arg Trp His370 375 380Arg Trp Gln Asp Lys His Ser Ile Arg Ala Arg Val Ala Arg Ala Met385 390 395 400Ser Ile Pro Thr Ser Pro Thr Arg Val Ser Phe His Ser Ile Lys Gln405 410 415Ser Ser Ala Val420<210>43<211>38<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>43Val Ile Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Arg Ile Leu Leu1 5 10 15Glu Gln Ala Arg Tyr Lys Ala Ala Arg Asn Gln Ala Ala Thr Asn Ala20 25 30Gln Ile Leu Ala His Val35<210>44<211>38<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>44Ile Val Leu Ser Leu Asp Val Pro Ile Gly Leu Leu Gln Ile Leu Leu1 5 10 15Glu Gln Ala Arg Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Ala Thr Thr Asn Ala20 25 30Arg Ile Leu Ala Arg Val3权利要求
1.鉴定用于调节骨骼肌质量或功能的候选化合物的方法，所述方法包括(a)用CRF2R接触试验化合物；(b)确定试验化合物是否结合CRF2R；和(c)鉴定那些结合CRF2R的试验化合物作为用于调节骨骼肌质量或功能候选化合物。
2.鉴定用于调节骨骼肌质量或功能的候选化合物的方法，所述方法包括(a)用表达功能性CRF2R的细胞接触试验化合物；(b)确定试验化合物是否活化CRF2R；和(c)鉴定可活化CRF2R的那些试验化合物作为用于调节骨骼肌质量或功能候选化合物。
3.如权利要求2所述的鉴定候选化合物的方法，所述方法还包括产生许多候选化合物。
4.如权利要求2所述的鉴定候选化合物的方法，其中所述CRF2R在真核细胞上表达。
5.如权利要求4所述的鉴定候选化合物的方法，其中所述CRF2R具有与序列标识号10的序列80％以上相同的氨基酸序列。
6.如权利要求4所述的鉴定候选化合物的方法，其中所述CRF2R具有与序列标识号10的序列90％以上相同的氨基酸序列。
7.如权利要求4所述的鉴定候选化合物的方法，其中所述CRF2R具有与序列标识号10、序列标识号12、序列标识号14、序列标识号18、序列标识号20、序列标识号24、序列标识号26、序列标识号32或序列标识号38的氨基酸序列对应的氨基酸序列。
8.如权利要求4所述的鉴定候选化合物的方法，其中所述CRF2R选自人、小鼠和大鼠的物种。
9.如权利要求8所述的鉴定候选化合物的方法，其中所述CRF2R来自人。
10.如权利要求4所述的鉴定候选化合物的方法，所述细胞含有细胞状cAMP含量，其中确定试验化合物是否活化CRF2R包括测量细胞状cAMP的含量。
11.如权利要求10所述的鉴定候选化合物的方法，其中所述细胞还包括与cAMP响应元素可操作地相连的报道基因，且对于细胞状cAMP含量的测定包括测定报道基因的表达。
12.如权利要求11所述的鉴定候选化合物的方法，其中所述报道基因为碱性磷酸酶、氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶、葡糖苷酸合成酶、生长激素、胎盘的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白质。
13.鉴定用于调节骨骼肌质量或功能的候选化合物的方法，所述方法包括任意顺序的以下步骤(a)用表达功能CRF2R的细胞接触试验化合物，并确定由测试化合物引起的CRF2R的活化量；(b)用表达功能CRF1R的细胞接触试验化合物，并确定由测试化合物引起的CRF CRF1RR的活化量；然后(c)比较CRF2R活化量和CRF1R活化量；和(d)鉴定那些显示对于CRF2R和CRF1R具有相似活性的，或显示对于CRF2R具有选择性的试验化合物作为用于调节骨骼肌质量或功能的候选化合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述候选化合物对于CRF2R具有100倍或更大的选择性。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述候选化合物对于CRF2R具有1000倍或更大的选择性。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述候选化合物对于CRF2R具有1至100倍的选择性。
17.从一组一种或多种候选化合物中鉴定候选治疗化合物的方法，所述候选化合物已被预先确定可结合或活化CRF2R，所述方法包括(a)对人类以外的动物施用候选化合物；和(b)确定候选化合物是否可调节被测动物的骨骼肌质量或功能。
18.鉴定候选化合物的方法，所述化合物可延长或增大CRF2R或CRF2R信号转换途径的激动剂诱导的活性，所述方法包括以下任意顺序的或同时进行的步骤(a)用表达功能性CRF2R的细胞接触试验化合物；(b)以足够的长时间和充足的浓度用CRF2R激动剂处理该细胞，使得在对照细胞内的CRF2R脱敏，然后(c)测定CRF2R的活化量；和(d)鉴定可延长或增大CRF2R或CRF2R信号转换途径的活性的试验化合物作为候选化合物，用于调节骨骼肌质量或功能。
19.从一组一个或多个候选化合物中鉴定候选的治疗化合物的方法，该候选化合物已预先被确定为可延长或增大CRF2R或CRF2R信号转换途径的活性，所述方法包括a)对人类以外的动物使用该候选化合物以及CRF2R激动剂；和b)测定该候选化合物是否可调节被测动物的骨骼肌质量或功能。
20.鉴定用于增加CRF2R或CFR表达的候选化合物的方法，所述方法包括(a)将试验化合物与细胞或包含报道基因的细胞溶解产物接触，所述报道基因与CRF2R调节元件或CRF调节元件可操作地相连；(b)检测报道基因的表达；和(c)鉴定那些可增加报道基因的表达的试验化合物作为用于调节骨骼肌质量或功能的候选化合物。
21.增强患者的骨骼肌质量或功能的方法，其中所述增强是患者所期望的，所述方法包括(a)鉴定希望增强肌肉质量或功能的患者；和(b)给该患者施用安全有效量的CRF2R激动剂。
22.治疗患者的骨骼肌萎缩的方法，该患者需要这样的治疗，所述方法包括(a)鉴定需要治疗骨骼肌萎缩的患者；和(b)给该患者施用安全有效量的化合物，所述化合物选自CRF2R激动剂、编码功能CRF2R的表达载体、编码构成上活性CRF2R的表达载体、编码CRF的表达载体和增加CRF2R或CRF的表达的化合物。
23.如权利要求22所述的治疗骨骼肌萎缩的方法，其中所述化合物为CRF2R激动剂。
24.如权利要求23所述的治疗骨骼肌萎缩的方法，其中所述CRF2R激动剂通过鉴定调节骨骼肌质量或功能的候选化合物的方法鉴定，所述方法包括(a)将试验化合物与CRF2R接触，(b)测定该试验化合物是否活化CRF2R；和(c)鉴定那些活化CRF2R的试验化合物作为候选化合物，用于调节骨骼肌质量或功能。
25.如权利要求23所述的治疗骨骼肌萎缩的方法，其中所述CRF2R激动剂为嵌合抗体或人体抗体。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述CRF2R激动剂对于CRF2R的选择性高于CRF1R。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述CRF2R激动剂对CRF2R的选择性大于或等于100倍。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述患者具有肌肉萎缩，所述CRF2R激动剂对CRF2R具有1至100倍的选择性。
29.如权利要求23所述的治疗骨骼肌萎缩的方法，所述方法还包括给该患者施用安全有效量的化合物，所述化合物可延长或增大CRF2R的活性或CRF2R信号转换途径的活性。
30.对CRF2R有特异性的纯化抗体，其中所述抗体为嵌合抗体或人体抗体。
31.如权利要求30所述的抗体，其中所述抗体为CRF2R激动剂。
32.如权利要求31所述的抗体，其中所述抗体为人体抗体。
33.药物组合物，所述药物组合物包括(a)安全有效量的CRF2R激动剂；和(b)可药用的载体。
34.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述CRF2R激动剂为对CRF2R有特异性的嵌合抗体或人体抗体。
35.如权利要求33所述的药物组合物，其中所述CRF2R激动剂为urocortinII。
全文摘要
本发明涉及鉴定化合物的筛选方法，所述化合物可结合或活化促肾上腺皮质激素释放因子2受体(CRF
文档编号A61K39/395GK1820200SQ02805927
公开日2006年8月16日 申请日期2002年3月6日 优先权日2001年3月6日
发明者R·J·伊斯福特, R·J·谢尔登 申请人:宝洁公司