专利名称：远志在制备Aβ引起的老年痴呆病的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药远志在抗老年痴呆病中的药物应用，具体地说是涉及中药远志在制备抑制阿尔茨海默病的β-淀粉样蛋白分泌的药物和抑制β分泌酶(简称BACE)药物方面的用途。
背景技术：
老年痴呆症是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主要临床表现的中枢神经系统的退行性疾病，是智能损害的综合征。该病症一般可分为3类1.原发性退行性痴呆，称为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，简称AD)；2.脑血管性痴呆(VD)；3.混合性痴呆(现命名为皮层下缺血性脑白质病)，包括帕金森痴呆(PD)、脑叶萎缩症、宾斯旺格尔病(Binswanger)。老年痴呆中阿尔茨海默病和血管性痴呆是两大最主要的类型，患病率占所有痴呆的90％以上，其中AD约占半数，与另一种老年期常见的脑血管性痴呆在病因、发病机理和预后等方面有着本质区别。AD多隐匿起病，进行性加重，以痴呆为主要临床表现，大脑主要病理改变为淀粉斑、神经纤维缠结和选择性神经元及突触丢失。国外资料表明，在世界范围内，每年因AD花费1000亿美元。在西方国家AD已成为继心脏病、肿瘤、脑中风之后的第4位致死原因。我国流行病学调查发现60岁以上人群的患病率达3.46％～3.9％，另有报道北京地区患病率为3.3％，上海地区患病率为4.6％。AD致残致死率极高，由于病因不明而无有效治疗措施。
AD的病因目前尚未明确，据析可能是铝代谢异常、脑中乙酰胆碱能的生化改变、自身免疫和病毒感染等。近年来关注的病因学有淀粉样变学说；基因学说；炎症学说；以及胆碱能损伤学说等。越来越多的科学家相信AD的淀粉样变的发生机制与β-淀粉样蛋白有关。
β-淀粉样蛋白生成机制AD患者脑中有三种异常结构老年斑、神经纤维缠结(NFT)和淀粉样物质沉积脑血管。老年斑又称淀粉斑或神经炎斑，是AD脑重要的特征性病理改变，所有散发性和家族性AD病人大脑均可见典型或弥散性淀粉斑。淀粉斑核心成分为β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，简称Aβ或βA4)。Aβ由细胞分泌，在细胞基质沉淀聚积之后则有很强的神经毒性，是AD脑淀粉斑周边神经元变性和死亡的主要原因。由于Aβ是由β-淀粉样蛋白前体(Amyloid β-Protein Precursor，简称APP)经β分泌酶和γ分泌酶水解后产生的，因此抑制β-分泌酶能够减少Aβ的产生，故寻找有效的β-分泌酶抑制剂是AD治疗研究的一个热点。
国外的AD治疗药物主要是神经营养药、拟胆碱药或胆碱酯酶抑制剂，均属对证治疗药物，据研究报道并无显著疗效或能减缓AD的发展。目前为止尚无有效的抑制Aβ分泌和有效的β-分泌酶抑制剂供临床应用。
中医关于老年性痴呆的诊断多包括了西医的VD、AD或二者的混合型，即所针对的老年痴呆仅为泛指了的全部相关病症。中药治疗老年痴呆的有效方剂为调心方(党参、茯苓、甘草、石菖蒲、远志等)和补肾方(天冬、麦冬、生地、熟地、山茱萸等)、当归芍药散、黄连解毒汤、钓藤散、抑肝散、小柴胡汤、柴胡加龙骨牡蛎汤、DX-9386(人参、远志、茯苓、石菖蒲等)等。其中临床显示黄连解毒汤对VD的治疗更为有效。
在中医药文献记载中，植物远志属于益智安神类中药，《中国药典》(2000版)收载了2种基源植物远志Polygala tenuifolia和卵叶远志P.sibirica，药用部位为根，味苦、辛、温，归心、肾、脾经，具有安神益智、祛痰、消肿等功效。据记载，中药远志的药理活性多为祛痰镇咳、镇静安神、抗惊厥、抗衰老、降压以及脑保护等方面。
远志的成分主要是皂苷类、糖及糖苷类、酮类、生物碱等。远志皂苷作为其中活性成分之一，已有一些分离、提纯其单体的研究报道。矢部等进行了远志对神经细胞营养因子作用的试验，证明远志水浸膏对脑有保护作用；饭冢进为探讨远志的脑保护活性，对KCN低氧脑障碍的作用进行了研究，发现几种酰基糖具有缩短正向反射消失持续时间的作用，表明远志脑保护作用出现的部分原因与酰基糖有关(饭冢进.国外医学-中医中药分册，1995，17(5)29)。
虽有多部医书的统计表明，远志是益智药物中出现几率最高的中药之一，并且其益智作用比较全面，但到目前为止的研究，还仅局限于对泛指的抗老年痴呆方面的研发，并且多为复方形式，具体的治病机理以及从病因学角度治疗或缓解的疾病类型等研究尚未见报道。
目前国内外有关治疗或缓解Aβ导致的AD的药物研究无明显进展，已有的药物均属对证治疗药物，在显著疗效或减缓AD的发展方面也未见突破性进展；而中药方剂只能改善症状，从天然中草药中筛选治疗AD的中药提取物或有效成份成为近年来国际AD研究领域中的热点和共识，但目前尚无有效的抑制Aβ分泌和有效的β-分泌酶抑制剂的研究报道，也未有针对Aβ的系统研究以及从病因学角度治疗或缓解AD的药物或植物提取物。随着老龄人口的逐年增加，AD已成为严重威胁老年人身心健康的一种常见病，筛选和研制治疗AD的药物已成为十分迫切的任务。
发明内容
本发明的目的是提供中药远志在制备抑制β-淀粉样蛋白分泌和制备抑制β-分泌酶的药物中的应用。
本发明另一目的是提供了中药远志在制备治疗由于Aβ引起的AD的药物方面的应用。
本发明所提及的中药远志是指远志植物原料药的任何可药用形式，优选是主要包含远志总皂苷的远志原料药有效部位。根据已有文献的研究结果，远志总皂苷一般具有如下结构通式
其中的R1可以是H、CH3、CH3CO、Glc；R2可以是H、CH3、CH3CO、各种单糖、双糖或寡糖，糖上可以连接或不连接CH3CO、p-methoxycinnamoyl、3，4，5-trimethoxycinnamoyl、3，4-dimethoxycinnamoyl及3-hydroxy-3-methyl-glutaroyl等取代基。
所以本发明所提到的远志有效部位应该是通过任何可行方法获得的一类混合物，并尽可能地脱除了远志原料药中的酮、糖等成分而保留了全部的皂苷类物质。该远志有效部位可以是一种醇提取物，也可以是水提取物或其他形式的提取物。所述醇提取物的提取方法包括醇回流提取或醇超声提取，所得提取物在冷藏放置中析出沉淀，该沉淀物经过甲醇(MeOH)溶解，活性炭脱色，丙酮(Me2CO)沉淀最终得到粗制远志总皂苷提取物(杨云，中药化学成分提取分离手册，1998年第1版，p163-164)；或者经过有机溶剂萃取和/或树脂吸附法或柱层析法等精制提纯方法除去其他杂质成分最终得到远志总皂苷提取物。
本发明所述的远志有效部位包括上述中药远志的醇提产物-远志总皂苷；也包括将远志总皂苷溶解或混悬于溶剂中，采用有机溶剂萃取和/或大孔树脂吸附法或柱层析法除杂、初步精制和提纯后，利用本领域常规的干燥方法制备成的远志总皂苷；还包括中药远志粗提产物-远志总苷，该远志总苷可以是商业购得的，也可以是用远志的根或根皮为原料，经过溶剂提取、萃取得到的。
所述提取远志总皂苷所用的溶剂选自水、乙醇、甲醇、正丁醇或其它不超过9个C原子的低级醇中任意一种或任意两种以上溶剂以任意比例所组成的混合溶剂，采用常规的提取方法，例如室温下浸渍提取，或超声波震荡提取，或加热状态下浸润提取或回流提取等，所述溶剂优选乙醇，最终得到含远志总皂苷为主要成分的远志提取物。
所述远志有效部位优选为远志的乙醇提取物。
所述的萃取法、大孔树脂吸附法和柱层析法均为本领域技术人员熟知技术，洗脱时可以等度洗脱也可以梯度洗脱，在此不加赘述，而提取物中皂苷成分的测定也可按照任何常规方法或公知方法实现。
发明人通过药效学试验揭示了中药远志可抑制β-淀粉样蛋白的分泌和抑制β-分泌酶的功效，进而提出了中药远志在制备抑制β-淀粉样蛋白分泌和制备抑制β-分泌酶的药物中的应用。
基于这样的结果，本发明还提出了中药远志在制备治疗由于Aβ引起的AD的药物方面的应用。
本发明还提供了一种用于抑制β分泌酶和β-淀粉样蛋白分泌的药物组合物，该组合物含有上述任一形式的中药远志和药学可接受的载体。所述组合物包括口服给药的剂型和非口服给药的注射剂型。
中药远志，尤其是所述远志总皂苷可作为抗衰老、抗老年痴呆症，尤其是治疗AD药物的有效成分。即，可按照常规方法制成用于抑制β分泌酶和β-淀粉样蛋白分泌的药物组合物，该组合物含有上述任一形式的中药远志，优选是远志总皂苷或含有远志总皂苷的远志提取物和药学可接受的载体。该药物可以包括口服给药的剂型和非口服给药的注射剂型。所述口服给药剂型为胶囊剂、颗粒剂、散剂、片剂、糖浆剂、酊剂注射剂等剂型，可临床用于抗衰老、预防和治疗老年痴呆症，尤其是AD。
经口服给药时，首先使该组合物与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口服给药时可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。
发明人经过大量的药理学筛选工作，发现远志提取物能抑制A β的分泌，并有抑制β-分泌酶的作用，这两项药理作用在本发明以前尚无文献报道。本发明还通过对中药远志进行醇提取，得到抗衰老、抗AD的以远志总皂苷为主要成分的远志提取物。按照本发明可以将以远志总皂苷为主要成分的远志提取物和其它植物药一起使用。
总之，本发明从病因学的角度研究了中药远志，尤其是远志总皂苷在抑制Aβ分泌和抑制β-分泌酶方面的功效及治疗AD中的药物用途，旨在寻找抑制Aβ分泌的有效药物和β-分泌酶的有效抑制剂，从而寻找到治疗AD的有效药物，相信对于抗AD的研究具有积极的推进作用。
图1显示远志提取物(远志总皂苷)对APP695基因转染SH-SY5Y细胞培养液总Aβ的影响。
图中lane 1为对照细胞的总Aβ；lane 2为试剂对照；lane 3-5为分别采用1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml剂量远志提取物处理细胞的总Aβ。
具体实施方案1、远志总皂苷提取物方法一远志(Polygala tenuifolia)药材1kg，稍加粉碎，经石油醚脱脂，加7倍量95％乙醇回流提取3次，第1次提取2小时，后两次各提取1小时，合并提取液，冰箱放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀晾干，用10倍量的MeOH溶解，活性炭脱色，过滤，滤液经回收溶剂至原体积的1/2，加入等量Me2CO过滤，收集沉淀，用Me2CO洗涤，得粗制远志总皂苷提取物约40g。
方法二取1kg远志的95％乙醇提取浸膏，悬浮于水中，分别用石油醚脱脂，氯仿、正丁醇萃取，萃取液浓缩至近干，溶解于水中，上大孔树脂，先用水洗，弃去洗脱液，然后用乙醇洗脱，洗脱液浓缩、冷冻干燥得总皂苷约20g。
2、药理学研究及结果本发明以抑制基因转染神经细胞中Aβ分泌为指标，对远志的抗AD活性进行了深入的研究。
1)远志提取物对人类β-淀粉样蛋白前体(简称APP)基因APP695转染的SH-SY5Y细胞Aβ分泌的抑制作用。
实验方法用APP695基因转染SH-SY5Y细胞系(SH-SY5Y APP695)作筛选模型。SH-SY5Y APP695细胞的培养条件为培养液MEM/F-12培养基，10％(V/V)灭活胎牛血清，0.4μg/ml潮霉素B，1％(V/V)非必需氨基酸，200mm的谷氨酰胺。
培养37℃，5％(V/V)CO2条件下培养。
将上述处于对数生长期的细胞等分于4个75cm2的培养瓶中，每瓶加入10ml培养基，至细胞贴壁生长密度大于95％，弃培养液，用PBS(PH7.4)洗涤，分别加入培养基10ml，其中三个实验组分别加入1μg/l、2μg/ml和4μg/ml上述方法一得到的远志提取物，对照组加入等体积无菌超纯水，细胞继续培养10小时后收集细胞培养液。
将各组细胞培养液于2700r/分离心15分钟，取上清各加入抗Aβ1-16单克隆抗体(WO-2)6μl，蛋白质G-agarose 35μl，于4℃旋转混合过夜，2700r/分离心10分钟后弃上清，沉淀物用PBS(PH7.4)洗涤三次，各加入蛋白电泳上样缓冲液25μl，于97℃变性10分钟，离心，取上清上样。电泳用10％Tris-Tricine凝胶，电泳结束后将蛋白质通过电转移法转移至硝酸纤维素膜(385mA，40min)。电转移结束后将硝酸纤维素膜置于PBS(PH7.4)中煮沸5min以增加蛋白信号，硝酸纤维素膜用5％的脱脂奶粉(PBS溶解)封闭1小时，PBS漂洗3次，每次5分钟，加入单克隆抗体WO-2(用PBS稀释，1∶2000)，室温下孵育1小时，PBS(PH7.4)漂洗3次，加入碱性磷酸酶偶联抗鼠IgG(用PBS稀释，1∶2000)，室温孵育1小时，用PBS漂洗后以BCIP/NBT系统染色。
结果细胞培养液中Aβ含量随远志提取物浓度的增加而减少(图1)，6次独立实验均得到相同结果，经单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验显示1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml远志提取物处理组细胞分泌Aβ的含量与对照组相比有明显差异(p＜0.05)。实验证明中药远志提取物对SH-SY5Y APP695基因转染细胞Aβ分泌具有抑制作用。(见表1)表1.远志提取物对SH-SY5Y基因转染细胞Aβ分泌的抑制作用远志提取物浓度(μg/ml)对照组 12 4Aβ含量与对照组含100.00±0.00 75.75±19.89*36.33±10.26**28.86±8.42**量差异(％)*p＜0.05，**p＜0.01。
2)远志提取物对β分泌酶(BACE)的抑制作用实验材料重组人BACE-1(购于R&D公司)；荧光底物IV(购于R&D公司)；醋酸钠缓冲液。
仪器Fluostar galaxy微板光学测定仪及配套荧光测定384孔板(BMG公司产品)。
实验步骤先于荧光测定板孔中加入0.01μg/ml、0.1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的上述方法一得到的远志提取物，每个浓度三个复孔，另取三个孔不加远志提取物作为阴性对照，其后于每孔中加入酶和底物，酶终浓度4μg/ml，底物终浓度10μM，混匀，Ex320nm，Em 405nm处测荧光，计算荧光值变化斜率，比较酶活性。
实验结果10μg/ml和100μg/ml的远志提取物对BACE的抑制率分别为69.64％和83.28％(见表2).IC50(μg/ml)0.2465。
表2.远志提取物β分泌酶(BACE)的抑制作用远志提取物浓度(μg/ml)对照组0.01 0.1 10 100对BACE的抑制率(％)0 45.3245.4869.6483.28
以上描述了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
权利要求
1.中药远志在制备抑制β-淀粉样蛋白分泌的药物中的应用。
2.中药远志在制备抑制β-分泌酶的药物中的应用。
3.中药远志在制备治疗由于Aβ引起的老年痴呆病的药物中的应用。
4.如权利要求1-3任一项中的应用，其中所述的中药远志为含有远志总皂苷的远志有效部位。
5.如权利要求4的应用，其中所述的中药远志有效部位是经醇提取方法得到的远志提取物。
6.如权利要求5的应用，其中所述的醇提取方法包括醇回流提取法或醇超声提取法。
7.如权利要求6的应用，其中所述的醇提取方法还进一步包括有机溶剂萃取和/或大孔吸附树脂吸附除杂过程。
8.如权利要求5或6的应用，其中所述的醇提取方法中所用的醇为乙醇。
9.如权利要求1-3任一项中的应用，其中所述的药物为含有中药远志和药学可接受的载体的药物组合物。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述的药物包括口服给药的剂型和非口服给药的剂型。
全文摘要
本发明提供中药远志在抗由于Aβ引起的老年痴呆病中药物用途，本发明还提供了中药远志，尤其是远志总皂甙在制备抑制β－淀粉样蛋白分泌的药物中的应用以及在制备抑制β－分泌酶的药物中的应用。
文档编号A61P25/28GK1579468SQ03153399
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月12日 优先权日2003年8月12日
发明者张岱, 贾宏晓, 屠鹏飞, 姜勇 申请人:张岱, 北京大学精神卫生研究所