专利名称：一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与表达该融合蛋白的方法以及以该融合蛋白为活性成分的药物。
背景技术：
睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)，因发现其具有促进鸡胚睫状体神经节副交感神经元存活的作用而得名。随后的研究表明CNTF是一种具有多种生物学功能的细胞因子能促进感觉神经元、运动神经元、大脑神经元和海马神经元的存活；能够促进交感神经元的胆碱能分化，促进神经胶质祖细胞分化为星形胶质细胞；还能促进少突胶质细胞的生长和存活；此外，CNTF对一些外周组织如骨骼肌的生长也有促进作用。1994年，Henderson等人发现全身性地注射CNTF可引起小鼠消瘦，随后在治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的临床研究中也观察到重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)能使病人体重下降。但是，这种作用在当时被认为是一种不良的副作用。
随着CNTF受体(CNTFRα)及瘦素(Leptin)受体(Ob-R)基因相继得到克隆，Chen等人发现CNTF受体复合物中负责信号转导的成员gp130和LIFRβ与Ob-R的基因序列具有相似性。Baumann等人还发现gp130与Ob-R甚至具有相似的信号转导能力。以上研究又促使Gloaguen等人去探索CNTF与Leptin是否具有相似的减肥机制。Gloaguen等人首先用神经元细胞系证明了CNTF与Leptin可以激发相似的信号转导通路，随之用ob/ob、db/db以及膳食致肥的(DIO)小鼠动物模型做实验也证实了CNTF的减肥效果。Lambert等人则进一步证明了CNTF与Leptin可通过小鼠下丘脑激发相似的信号转导通路，并证实了CNTF在促使减肥的同时并没有发热、厌食及代谢异常等副作用发生，从而证明了CNTF的减肥作用并不是一种不良的副作用。
CNTF作为一种天然的与Leptin类似的物质(模拟物)，有效地弥补了Leptin的耐受问题，因而在肥胖症的治疗上具有良好的应用前景。AX15是由Regeneron公司发明的人睫状神经营养因子(hCNTF)的一个三重突变体第17位的Cys被Ala替换，第63位的Gln被Arg所替换，C末端缺失15个氨基酸。与天然hCNTF相比，AX15具有更高的生物学活性，更高的稳定性和可溶性。目前用AX15已完成了肥胖症治疗的III期临床实验，并取得了具有显著差异的统计学结果。
AX15(R13K)是赵洪亮等构建的KEX2蛋白酶抗性的AX15突变体，在体外和体内活性测定中都显示了与AX15相当的生物学活性(蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体及其生产方法和用途，中国发明专利申请号2003101001380；赵洪亮等.蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达，生物工程学报，2004，20(3)394-397)。
然而CNTF及其突变体的半衰期较短，只有频繁的给药才能获得令人满意的疗效，如在临床研究中往往采用每天注射一次的用药方式。但如此频繁的用药方式再加上较长的治疗周期使得病人较难承受。因此迫切需要研制出作用时间长的CNTF及其突变体。
人血清白蛋白(HSA)是机体中一种稳定的且半衰期较长的蛋白。研究表明许多蛋白药物与该白蛋白交联或融合后可以显著地使药物蛋白的半衰期延长，从而使用药次数减少。目前HGS(Human Genome Sciences)公司已发明了白蛋白融合生长激素(Albutropin)，白蛋白融合粒细胞集落刺激因子(Albugranin)及白蛋白融合干扰素(Albuferon)等产品并先后进入了I/II期临床研究，研究结果表明上述产品具有较长的体内半衰期，较高的安全性及较好的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的具有减肥作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质；3)序列表中的SEQ ID №2；4)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质。
其中，具有序列表中的SEQ ID No1的氨基酸残基序列的蛋白质名称为HSA-AX15(R13K)；具有序列表中的SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质名称为AX15(R13K)-HSA。序列表中的SEQ ID №1由804个氨基酸残基组成，自氨基端第1-609位为HSA的氨基酸残基序列，自氨基端第621-804位为AX15(R13K)的氨基酸残基序列，自氨基端第610-620位为连接肽序列。序列表中的SEQ ID No2由774个氨基酸残基组成，自氨基端第1-184位为AX15(R13K)的氨基酸残基序列，自氨基端第190-774位为HSA的氨基酸残基序列，自氨基端第185-189位为连接肽序列。
上述具有减肥作用的融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；5)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；6)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；7)与序列表中SEQ ID No4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；8)在高严谨条件下可与序列表中的序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №3由2415个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第2415位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQID №4由2325个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第2325位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。
扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种表达上述具有减肥作用的融合蛋白的方法。
本发明所提供的表达上述具有减肥作用的融合蛋白方法，是将含有上述具有减肥作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有减肥作用的融合蛋白。
所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌。
所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115，KM71(可购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(可购自美国Invitrogen公司)。
所述大肠杆菌可为E.coli JM109，E.coliHB101，E.coli Top10。
用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9(其物理图谱如图1所示)、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。
当所述宿主为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)时，需用甲醇进行诱导表达，甲醇的终浓度可为0.5％。
上述重组表达载体均可按照常规方法构建。
培养含有本发明的具有减肥作用的融合蛋白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
本发明还提供了一种减肥及治疗肥胖症的药物。
本发明所提供的减肥及治疗肥胖症的药物，它的活性成分为上述具有减肥作用的融合蛋白。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为1-50μg具有减肥作用的融合蛋白/kg体重，每隔7-14天给药一次，疗程为3至12个月。
实验证明，本发明的融合蛋白稳定性高、半衰期较长，在医学上也具有较高的安全性及较好的疗效；该融合蛋白的表达量高，易纯化，并具有生产周期短，生产规模大，成本低的优点，具有重要的应用前景和实际意义。
图1是酵母表达质粒pPIC9的物理图谱。
图2是HSA-AX15(R13K)融合蛋白基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3是AX15(R13K)-HSA融合蛋白基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
图4是融合蛋白HSA-AX15(R13K)和AX15(R13K)-HSA在巴斯德毕赤酵母中的表达的SDS-PAGE电泳图谱。
图5是融合蛋白HSA-AX15(R13K)分离纯化后的SDS-PAGE电泳图谱。
图6是融合蛋白HSA-AX15(R13K)促TF-1细胞存活活性的测定曲线。
图7是融合蛋白HSA-AX15(R13K)的减肥效果曲线。
具体实施例方式
下述实施例中的所有物质含量的百分比均为质量百分比。
主要试剂
1.DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、聚合酶等分别购自GIBCO-BRL、Pharmacia、Bio-Labs及华美生物工程有限公司2.PCR扩增试剂盒 (瑞典Pharmacia公司产品)3.DNA序列分析试剂盒 (美国USB公司产品)4.酪蛋白水解物 (德国MERK公司产品)5.Bacto-酵母抽提物 (美国Difco公司产品)6.酵母菌原生质体转化法的一些溶液配制(1)SED1M山梨醇，25mM EDTA，50mM DTT，pH8.0。
(2)SCE9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠，0.168gEDTA，pH5.8。
(3)CaS1M山梨醇，10mM CaCl2。
(4)SOS1M山梨醇，0.3×YPD，10mM CaCl2。
(5)CaT20mM Tris-HCl，pH7.5，20mM CaCl2。
(6)PEG20％PEG-3350，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl(pH7.4)。
(7)1M PBS缓冲液132ml 1M K2HPO4，868ml 1M KH2PO4，pH6.0。
实施例1、具有减肥作用的融合蛋白的制备1、人血清白蛋白和人睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因的获得引物1AAGGATCCAAACGATGAAGTGGGTTACTTTC引物2GGGAATTCCTATTACCCAGTCTGATGAGAAGAAAT引物3GGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTGGTTCTGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGAC引物4AGAACCACCACCACCACCGGAACCACCACCACCCAAACCCAAAGCAGCTTGAGAAGCAGC引物5CCCTCGAGAAAAGAGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCCTCACCGTAAGGAC引物6AAGAATTCCTATTACCCAGTCTGATGAGAAGAAAT引物7CAGACTGGGGGTGGTGGTGGTTCCGACGCTCACAAGTCTGAAGTTGCT引物8GTGAGCGTCGGAACCACCACCACCCCCAGTCTGATGAGAAGAAATGAA(1)制备含有AX15(R13K)基因的重组载体AX15(R13K)基因表达载体AX15(R13K)/pPIC9按照文献(赵洪亮等蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达，生物工程学报，2004，20(3)394-397)的方法构建。
(2)制备含有HSA基因的重组载体HSA基因及其表达载体HSA/pPIC9按照2003年3月19日授权公告的授权公告号为CN1103373C、专利号为99102794.9，发明名称为人血清白蛋白改构基因、表达载体及其宿主的中国发明专利的方法构建。
(3)人血清白蛋白和人睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因(HSA-AX15(R13K)基因)的获得以步骤(2)中得到的含有HSA基因的重组载体HSA/pPIC9为模板，在引物1和引物4的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增HSA基因；以步骤(1)中得到的含有AX15(R13K)基因的重组载体AX15(R13K)/pPIC9为模板，在引物2和引物3的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增AX15(R13K)基因。以上述两步中的扩增产物为模板以引物1和引物2为引物扩增出HSA-AX15(R13K)融合蛋白基因。该步PCR反应的扩增体系为HSA基因 1μlAX15(R13K)基因1μl引物1 2μl引物2 2μldNTP 1μl10×pfu酶缓冲液 5μlpfu酶 1μl蒸馏水37μl总体积50μl反应条件为94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 3分钟，共进行30个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶检测结果如图2所示，表明HSA-AX15(R13K)基因的大小与预测的一致。图中泳道1为DL2000分子量标准(从上到下依次为2000，1000，750，500，250，100bp)，泳道2为HSA基因，泳道3为AX15(R13K)基因，泳道4为HSA-AX15(R13K)基因。将酵母表达载体pPIC9(载体物理图谱如图1所示)和得到的HSA-AX15(R13K)基因分别用BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切后，用T4DNA连接酶将HSA-AX15(R13K)基因克隆入pPIC9，得到重组表达载体HSA-AX15(R13K)/pPIC9。并用DNA序列分析试剂盒(美国USB公司产品)对该重组载体进行测序，结果表明HSA-AX15(R13K)基因具有序列表中序列SEQ ID NO3的核苷酸序列，其编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质。
(4)人血清白蛋白和人睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因(AX15(R13K)-HSA基因)的获得以步骤(2)中得到的含有HSA基因的重组载体HSA/pPIC9为模板，在引物6和引物7的引导下，利用PCR扩增试剂盒(瑞典Pharmacia公司产品)扩增HSA基因；以步骤(1)中得到的含有AX15(R13K)基因的重组载体AX15(R13K)/pPIC9为模板，在引物5和引物8的引导下，扩增AX15(R13K)基因。以上述两步中的扩增产物为模板以引物5和引物6为引物扩增出AX15(R13K)-HSA融合蛋白基因。该步PCR反应的扩增体系为HSA基因 1μlAX15(R13K)基因 1μl引物52μl引物62μldNTP1μl10×pfu酶缓冲液 5μlpfu酶 1μl蒸馏水 37μl总体积 50μl反应条件为94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 3分钟，共进行30个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶检测结果如图3所示，表明AX15(R13K)-HSA基因的大小为与预测的一致。图中泳道1为DL2000分子量标准(从上到下依次为2000，1000，750，500，250，100bp)，泳道2为HSA基因，泳道3为AX15(R13K)基因，泳道4为AX15(R13K)-HSA基因。将酵母表达载体pPIC9(载体物理图谱如图1所示)和AX15(R13K)-HSA基因分别用XhoI和EcoRI限制性内切酶酶切后，用T4DNA连接酶将AX15(R13K)-HSA基因克隆入pPIC9，得到重组表达载体AX15(R13K)-HSA/pPIC9。并用DNA序列分析试剂盒(美国USB公司产品)对该重组载体进行测序，结果表明AX15(R13K)-HSA基因具有序列表中序列SEQ ID NO4的核苷酸序列，其编码具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的蛋白质。
2、人血清白蛋白和人睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的表达将上述两重组表达载体HSA-AX15(R13K)/pPIC9和AX15(R13K)-HSA/pPIC9用酵母原生质体转化法转化巴斯德毕赤酵母GS115 his4(Mut+his-)NRRLY-15851，将转化产物涂布在MD平板上，经组氨酸营养缺陷筛选，得到转化子。随机挑取24个转化子，接种于4ml BMGY培养基(1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液)培养液中，每隔12小时加入0.5％甲醇进行诱导表达，在30℃ 100rpm摇培36-48小时，5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，将样品分别进行15％SDS-PAGE电泳鉴定，用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴定出高表达克隆，然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保菌、斜面培养，用于作为进一步表达的工程菌HSA-AX15(R13K)/pPIC9(GS115)和AX15(R13K)-HSA/pPIC9(GS115)。
挑取上述工程菌的菌落分别接种于4ml BMGY(1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液)液体培养基中，30℃ 100rpm摇培12-24小时。取1ml酵母菌液转接于50ml BMGY培养液内，继续摇培18-24小时，再按4％接菌量将40ml种子接入1000ml BMGY培养基内，在30℃ 100rpm继续摇培24-30小时，将培养液用5000rpm离心5min，弃上清，然后将工程菌HSA-AX15(R13K)/pPIC9(GS115)和AX15(R13K)-HSA/pPIC9(GS115)分别用200ml BMMY(1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液)诱导表达培养基悬浮菌体，在30℃ 100rpm摇培3-4天，每隔24小时补加甲醇(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。这时巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度已达到OD600＝18-20，每升菌体干重为100-300克，基因表达的外源蛋白大多数分泌到液体培养基内。发酵培养基在4℃ 10000rpm离心20min，弃菌体，获得含大量融合蛋白表达产物的上清液，将其进行SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果如图4所示，表明HSA-AX15(R13K)和AX15(R13K)-HAS均获得了表达。图中，第3和第4泳道是HSA-AX15(R13K)/pPIC9(GS115)表达的上清，第5和第6泳道是AX15(R13K)-HSA/pPIC9(GS115)表达的上清，第2和第7泳道是阴性对照(pPIC9(GS115))，第1泳道是分子量标准，箭头示目的条带。结果表明融合蛋白的表达量约为100mg/L。
3、HSA-AX15(R13K)融合蛋白的分离纯化将步骤2中的培养上清的pH调至5.0并稀释5倍后用S Sepharose F.F进行初步纯化。阳离子交换层析所用平衡缓冲液为50mM pH5.0的醋酸缓冲液，洗脱缓冲液为含1M NaCl的50mM pH5.0醋酸缓冲液。经阳离子交换层析后再用Source30RPC反向层析进行纯化。反向色谱所用平衡缓冲液为含0.1％TFA蒸馏水，洗脱缓冲液为含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈。最后用Superdex200分子筛进行进一步纯化获得最终产物，凝胶过滤所用缓冲液为PBS和0.1％Tween80，将纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图5所示，表明HSA-AX15(R13K)融合蛋白的纯度已达90％以上。图中，1为Marker(从上到下依次为97.4，66.2，43.0，31.0，20.1kDa)，泳道2为培养上清，泳道3为阳离子交换纯化样品，泳道4为反向色谱纯化样品，泳道5为凝胶过滤纯化样品，箭头示目的条带。
实施例2、具有减肥作用的融合蛋白的促TF-1细胞存活活性测定利用TF-1(前髓样细胞)细胞系测定了融合蛋白促细胞存活活性，具体方法参考文献(Saggio I等CNTF variants with increased biological potency and receptorselectivity defined a function site of receptor interaction.The EMBOJ，1995，14(13)3045-3054)。结果如图6所示，融合蛋白HSA-AX15(R13K)的比活约是AX15(R13K)的1/4，但由于AX15(R13K)的分子量是21085Da，而融合蛋白的分子量是88210Da，融合蛋白中AX15(R13K)部分只占整个分子的1/4左右，因此与HSA融合并未影响AX15(R13K)的活性。
实施例3、动物实验将24只昆明小鼠随机分为3组，每组8只注射2.0mg/kg AX15(R13K)的对照组、注射1.6mg/kg的HSA-AX15(R13K)实验组、注射4.8mg/kg的HSA-AX15(R13K)实验组。上述对照组和实验组中的每只昆明小鼠每隔两天按上述剂量注射一次AX15(R13K)或融合蛋白，共注射2次，每天测一次体重，其体重的变化结果如图7所示，表明融合蛋白HSA-AX15(R13K)的作用比AX15(R13K)更为持久注射2.0mg/kg AX15(R13K)后48小时内体重即开始反弹，而注射4.8mg/kg的融合蛋白HSA-AX15(R13K)后能使体重连续3天保持下降，注射1.6mg/kg的融合蛋白HSA-AX15(R13K)后能使体重连续2天保持下降，到第6天，注射4.8mg/kg及1.6mg/kg融合蛋白HSA-AX15(R13K)组的小鼠体重分别下降至原体重的68％和90％。说明本发明的融合蛋白由于延长了半衰期从而可以显著地提高重组蛋白药物的体内疗效。
序列表<160>4<210>1<211>804<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala1 5 10 15Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala20 25 30His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu35 40 45Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val50 55 60Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp65 70 75 80Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp85 90 95Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala100 105 110Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln115 120 125His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val130 135 140Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro165 170 175Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys180 185 190Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu195 200 205Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys210 215 220Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val225 230 235 240Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser245 250 255Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly260 265 270Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile275 280 285Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu290 295 300Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp305 310 315 320Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser325 330 335Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly340 345 350Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val355 360 365Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys370 375 380Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu385 390 395 400Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu420 425 430Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val435 440 445Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His450 455 460Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val465 470 475 480Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg485 490 495ValThr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe500 505 510Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala515 520 525Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu530 535 540Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys545 550 555 560Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala565 570 575Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe580 585 590Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly595 600 605Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Phe Thr Glu610 615 620His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Lys Asp Leu Ala Ser Arg Ser Ile625 630 635 640Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser645 650 655Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala
660 665 670Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp Ser Glu Leu Thr Glu675 680 685Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val690 695 700Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr705 710 715 720Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala725 730 735Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys740 745 750Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Val Gly Asp Gly755 760 765Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu770 775 780Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser Ser785 790 795 800His Gln Thr Gly<210>2<211>774<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Lys Asp Leu Ala1 5 10 15Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala20 25 30
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1.一种具有减肥作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质；3)序列表中的SEQ ID №2；4)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有减肥作用的蛋白质。
2.权利要求1所述的具有减肥作用的融合蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述人具有减肥作用的融合蛋白的编码基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；5)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；6)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；7)与序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；8)在高严谨条件下可与序列表中的序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的基因的表达载体、细胞系及工程菌。
5.扩增权利要求2或3所述的融合蛋白编码基因中任一片段的引物对。
6.一种表达权利要求1所述的具有减肥作用的融合蛋白的方法，是将含有具有减肥作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有减肥作用的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述酵母菌为巴氏毕赤酵母；所述巴氏毕赤酵母为巴氏毕赤酵母GS115，KM7或SMD1168。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于用于构建所述重组表达载体的出发载体为pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K。
10.一种减肥及治疗肥胖症的药物，它的活性成分为权利要求1所述的具有减肥作用的融合蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供一种具有减肥作用的融合蛋白及其编码基因与表达该融合蛋白的方法以及以该融合蛋白为活性成分的减肥及治疗肥胖症的药物。本发明所提供的具有减肥作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID N
文档编号A61P3/04GK1760210SQ20041008048
公开日2006年4月19日 申请日期2004年10月11日 优先权日2004年10月11日
发明者刘志敏, 赵洪亮, 薛冲, 张伟, 熊向华, 杨秉芬 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所