专利名称：：整合蛋白α的制作方法
技术领域：
：本发明涉及血小板凝集领域。更具体的，本发明涉及一种整合蛋白特异性抗体和肽，以及这些化合物用于抑制血小板凝集的用途。
背景技术：
：整合蛋白αIIbβ3抑制剂是一类新的抗血栓形成药物，该抑制剂通过阻断血纤维蛋白原与整合蛋白αIIbβ3的结合，进而抑制血栓形成中关键的血小板之间的相互作用(参见Topol，E.J.，Byzova，T.V.，andPlow，E.F.(1999)PlateletGPIIb-IIIablockers.Lancet353，227-231；Coller，B.S.(1997)PlateletGPIIb/IIIaantagoniststhefirstanti-integrinreceptortherapeutics.JClinInvest99，1467-1471)。整合蛋白αIIbβ3抑制剂现在被用于治疗非ST段抬高急性冠脉综合征和进行经皮冠状动脉治疗的病人(参见Proimos，G.(2001)PlateletaggregationinhibitionwithglycoproteinIIb-IIIainhibitors.JThrombThrombolysis11，99-110)。在这些抑制剂中，阿昔单抗(abciximab)(ReoPro，Centocor，Inc.，Malvern，Pennsylvania，andEliLilly&Company，Indianapolis，Indiana)(参见Coller，B.S.(1997)PlateletGPIIb/IIIaantagoniststhefirstanti-integrinreceptortherapeutics.JClinInvest99，1467-1471)，埃替非巴肽(eptifibatide)(INTEGRILIN，CORTherapeutics，Inc.，SouthSanFrancisco，California，andKeyPharmaceuticals，Inc.，Kenilworth，NewJersey)(参见Phillips，D.R.，andScarborough，R.M.(1997)Clinicalpharmacologyofeptifibatide.AmJCardiol80，11B-20B；Scarborough，R.M.(1999)Developmentofeptifibatide.AmHeartJ138，1093-1104)和替罗非班(tirofiban)(Aggrastat，Merck&Co.，Inc.，WhitehouseStation，NewJersey)(Vickers，S.，Theoharides，A.D.，Arison，B.，Balani，S.K.，Cui，D.，Duncan，C.A.，Ellis，J.D.，Gorham，L.M.，Polsky，S.L.，Prueksaritanont，T.，Ramjit，H.G.，Slaughter，D.E.，andVyas，K.P.(1999)Invitroandinvivostudiesonthemetabolismoftirofiban.DrugMetabDispos27，1360-1366)已经在美国通过了临床批准。其中第一个获得批准并且应用范围最广的药剂阿昔单抗是一种具有鼠源可变区和人源恒定区的嵌合Fab。它通过和配基结合区域邻近的表位结合进而通过空间阻碍抑制血纤维蛋白原结合。阿昔单抗已经被证实可以与整合蛋白αγβ3以及整合蛋白αMβ2发生交叉反应(参见Scarborough，R.M.(1999)Developmentofeptifibatide.AmHeartJ138，1093-1104)。另一方面，埃替非巴肽和替罗非班则是能够结合整合蛋白的RGD配基相互作用位点的小分子药物，而且它们是αIIbβ3特异性的。和阿昔单抗相比，它们具有较低的亲和力以及更短的半衰期。(参见Scarborough，R.M.(1999)Developmentofeptifibatide.AmHeartJ138，1093-1104；Vickers，S.，Theoharides，A.D.，Arison，B.，Balani，S.K.，Cui，D.，Duncan，C.A.，Ellis，J.D.，Gorham，L.M.，Polsky，S.L.，Prueksaritanont，T.，Ramjit，H.G.，Slaughter，D.E.，andVyas，K.P.(1999)Invitroandinvivostudiesonthemetabolismoftirofiban.DrugMetabDispos27，1360-1366；McClellan，K.J.，andGoa，K.L.)1998)Tirofiban.Areviewofitsuseinacutecoronarysyndromes.Drugs56，1067-1080)。急性血小板减少症被认为是使用αIIbβ3抑制剂治疗方法的并发症。在第一次被施用阿昔单抗的病人中，大约有0.5％-1％的病人出现严重的血小板减少症(血小板浓度小于50×109/L)(参见Berkowitz，S.D.，Sane，D.C.，Sigmon，K.N.，Shavender，J.H.，Harrington，R.A.，Tcheng，J.E.，Topol，E.J.，andCaliff，R.M.(1998)Occurrenceandclinicalsignificanceofthrombocytopeniainapopulationundergoinghigh-riskpercutaneouscoronaryrevascularization.Evaluationofc7E3forthePreventionofIschemicComplications(EPIC)StudyGroup.JAmCollCardiol32，311-319；Jubelirer，S.J.，Koenig，B.A.，andBates，M.C.(1999)AcuteprofoundthrombocytopeniafollowingC7E3Fab(Abciximab)therapycasereports，reviewoftheliteratureandimplicationsfortherapy.AmJHematol61，205-208；Kereiakes，D.J.，Berkowitz，S.D.，Lincoff，A.M.，Tcheng，J.E.，Wolski，K.，Achenbach，R.，Melsheimer，R.，Anderson，K.，Califf，R.M.，andTopol，E.J.(2000)ClinicalcorrelatesandcourseofthrombocytopeniaduringpercutaneouscoronaryinterventionintheeraofabciximabplateletglycoproteinIIb/IIIablockade.AmHeartJ140，74-80)，而在第二次被施用阿昔单抗的病人中出现这种严重血小板减少症的比例则为4％(参见Madan，M.，Kereiakes，D.J.，Hermiller，J.B.，Rund，M.M.，Tudor，G.，Anderson，L.，McDonald，M.B.，Berkowitz，S.D.，Sketch，M.H.，Jr.，Philips，H.R.，3rd，andTcheng，J.E.(2000)Efficacyofabciximabreadministrationincoronaryintervention.AmJCardiol85，435-440；Tcheng，J.E.，Kereiakes，D.J.，Braden，G.A.，Jordan，R.E.，Mascelli，M.A，Langrall，M.A.，andEffron，M.B.(1999)ReadministrationofabciximabinterimreportoftheReoProreadministrationregistry.AmHeartJ138，S33-38)。在替罗非班的临床实验中，在施用替罗非班的病人中出现这种血小板减少症的可能性为0.1％-0.5％，仅仅是未施药病人中出现这种病症的可能性的两倍(参见TheRESTOREInvestigators.RandomizedEfficacyStudyofTirofibanforOutcomesandREstenosis(1997)EffectsofplateletglycoproteinIIb/IIIablockadewithtirofibanonadversecardiaceventsinpatientswithunstableanginaoracutemyocardialinfarctionundergoingcoronaryangioplasty.Circulation96，1445-1453；PlateletReceptorInhibitioninIschemicSyndromeManagement(PRISM)StudyInvestigators.(1998)Acomparisonofaspirinplustirofibanwithaspirinplusheparinforunstableangina.NEnglJMed338，1498-1505；PlateletReceptorInhibitioninIschemicSyndromeManagementinPatientsLimitedbyUnstableSignsandSymptoms(PRISM-PLUS)StudyInvestigators.(1998)InhibitionoftheplateletglycoproteinIIb/IIIareceptorwithtirofibaninunstableanginaandnon-Q-wavemyocardialinfarction.NEnglJMed338，1488-1497)。而在埃替非巴肽的临床实验中，被施药病人中出现血小板减少症的可能性则与服用了安慰剂的对照组病人中出现的可能性近乎相等(参见McClure，M.W.，Berkowitz，S.D.，Sparapani，R.，Tuttle，R.，Kleiman，N.S.，Berdan，L.G.，Lincoff，A.M.，Deckers，J.，Diaz，R.，Karsch，K.R.，Gretler，D.，Kitt，M.，Simoons，M.，Topol，E.J.，Califf，R.M.，andHarrington，R.A.(1999)Clinicalsignificanceofthrombocytopeniaduringanon-ST-elevationacutecoronarysyndrome.TheplateletglycoproteinIIb/IIIainunstableanginareceptorsuppressionusingintegrilintherapy(PURSUIT)trialexperience.Circulation99，2892-2900)。在被施用埃替非巴肽的病人中，只有极少比例的病人会出现严重的，难以解释的血小板减少症(参见McClure，M.W.，Berkowitz，S.D.，Sparapani，R.，Tuttle，R.，Kleiman，N.S.，Berdan，L.G.，Lincoff，A.M.，Deckers，J.，Diaz，R.，Karsch，K.R.，Gretler，D.，Kitt，M.，Simoons，M.，Topol，E.J.，Califf，R.M.，andHarrington，R.A.(1999)Clinicalsignificanceofthrombocytopeniaduringanon-ST-elevationacutecoronarysyndrome.TheplateletglycoproteinIIb/IIIainunstableanginareceptorsuppressionusingintegrilintherapy(PURSUIT)trialexperience.Circulation99，2892-2900)。尽管最近有报道指出是第一次被施用阿昔单抗后人体内被诱导产生的抗-鼠源可变区片段的抗体导致了在该病人第二次施用阿昔单抗时产生的严重的血小板减少症，但是在施用整合蛋白αIIbβ3抑制剂所引起的血小板减少症的原因目前还不清楚(参见Curtis，B.R.，Swyers，J.，Divgi，A.，McFarland，J.G.，andAster，R.H.(2002)Thrombocytopeniaaftersecondexposuretoabciximabiscausedbyantibodiesthatrecognizeabciximab-coatedplatelets.Blood99，2054-2059)。整合蛋白αvβ3，αvβ5，αIIbβ3，和α5β1对于许多含有Arg-Gly-Asp(RGD)三肽的粘蛋白都有一定的结合能力。利用其这一特性，一种合成的在其HCDR3中含有一个RGD基序，而且侧面连接有6个随机化残基的类粘蛋白人源抗体可以利用噬菌体展示技术从抗体库中淘选出来(参见Barbas，C.F.，3rd，Languino，L.R.，andSmith，J.W.(1993)High-affinityself-reactivehumanantibodiesbydesignandselectiontargetingtheintegrinligandbindingsite.ProcNatlAcadSciUSA90，10003-10007)。其中最有效的抗体是Fab-9，它与整合蛋白αvβ3的结合能力要比和整合蛋白αvβ5和α5β1的结合能力强1000倍。尽管如此，这些淘选出来的抗体，包括Fab-9，都不能有效地区分两种β3整合蛋白，αvβ3和αIIbβ3。因此，一个基序优化的随机肽库被创建出来，以确定对Fab-9的HCDR3区域中RGD三肽基序的进一步的加工和淘选是否可以产生一种对整合蛋白αvβ3或者αIIbβ3具有特异性结合能力的抗体(参见Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。尽管很多淘选出来的抗体表现出对整合蛋白αγβ3或者αIIbβ3具有一些选择性，但是几乎所有的抗体对于这两种整合蛋白都具有结合能力。大部分淘选出来的抗体都具有一个相同的氨基酸序列(K/R)XD。有趣的是，RGD基团的中间位置的氨基酸Gly可以被Val，Ala，Asn，Arg，Thr，Gln，Asp，Ser以及Trp所取代(参见Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。发明简述本发明的一个优选的实施方案提供了一种分离并提纯的血小板凝集肽抑制剂，所述肽包含9到大约50个氨基酸残基并且具有选自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸残基序列。在一个优选的实施方案中，该肽包括SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列。在另一优选的实施方案中，该肽由SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列组成。在另一更为优选的实施方案中，该肽基本上由SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列组成。本发明的一个实施方案提供了一种可以与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体。该抗体含有选自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列均包含在该抗体的抗原决定簇互补区(CDR)中。本发明的一个优选实施方案中，该抗体的抗原决定簇互补区(CDR)位于此抗体的重链上。本发明的一个更加优选的方案中，该抗体的抗原决定簇互补区是HCDR3。在另一实施方案中，所述抗体选自此处指定为RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或RAD88的抗体并且与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应。在本发明的另一个优选的实施方案中，该抗体是一种人源抗体。本发明的一个实施方案提供了一种可以与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体。本发明的一个实施方案提供了本发明中的抗体，免疫球蛋白和肽的使用方法。在本发明的一个实施方案中，此方法是抑制血小板凝集的方法，其包括将血小板与抑制有效量的肽相接触，所述肽具有选自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述方法是抑制血小板凝集的方法，其包括将血小板与抑制有效量的抗体相接触，所述抗体与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应并且包含选自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列是位于所述抗体的抗原决定簇互补区上的。本发明同时提供了一种抑制血纤维蛋白原与血小板结合的方法，该方法包括将血小板与抑制有效量的肽相接触，所述肽具有选自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸序列。本发明同时提供了一种抑制血小板凝集的方法，该方法包括将血小板与抑制有效量的抗体相接触，所述抗体与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应并且包含选自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列是位于所述抗体的抗原决定簇互补区上的。本发明也提供了具有整合蛋白αIIbβ3结合活性的抗体，其中所述结合与其它蛋白质的结合活性竞争，所述其它蛋白质包含三肽基序精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(RAD)的氨基酸残基序列，并且所述结合是在标准竞争测定中进行的。在更进一步的实施方案中，所述蛋白质是另外一种抗体，该抗体的决定簇互补区含有一种氨基酸残基序列，该氨基酸序列选自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31，而且所述的结合是在标准竞争测定中进行的。本发明的另一个实施方案提供了一种一种药用组合物，该药用组合物包含血小板凝集肽抑制剂和适宜的药用载体，该药用组合物以适宜于静脉给药、动脉给药、淋巴循环给药、腹膜内给药、透皮给药、皮下给药、肌内给药、关节腔内给药以及肺部给药的形态存在。更进一步的实施方案涉及包含与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体和适宜的药用载体的药物组合物。本发明的另一个实施方案涉及使用血小板凝集肽抑制剂作为治疗剂以防止在选自肺部栓塞、暂时性缺血发作(TIAs)、深静脉栓塞、冠状动脉旁路手术和在自体，非自体或者合成的脉管移植中放置人工瓣膜或脉管的手术的条件下的血栓形成。更进一步的实施方案涉及使用一种能够与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体作为治疗剂来防止血栓形成。本发明的另一个实施方案中，血小板凝集肽抑制剂可以用作治疗剂以防止在选自通过球囊、冠状动脉粥样斑块切除术和激光血管成形术进行的血管成形术过程中的血栓形成。更进一步的实施方案涉及使用一种能够与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体作为治疗剂来防止血栓形成。本发明还涉及一种处理受试者以治疗或防止血栓形成性紊乱的方法，该紊乱选自肺部栓塞、暂时性缺血发作(TIAs)、深静脉栓塞、冠状动脉旁路手术和在自体，非自体或者合成的脉管移植中放置人工瓣膜或脉管的手术，该方法包括施用有效量的具有血小板凝集抑制活性的肽于受试者以达到期望的治疗。本发明的另一实施方案涉及处理受试者以治疗或防止血栓形成性紊乱的方法，该方法包括施用有效量的与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体于受试者以达到期望的治疗。本发明一方面提供了一种分离并提纯的血小板凝集肽抑制剂，所述肽具有9到大约50个氨基酸残基并且氨基酸残基序列相应于V(V/W)CRAD(K/R)RC(由SEQIDNO4，5，6和7示例)。该肽优选包括SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列。更优选地，该肽具有SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列。本发明另一方面提供了与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体。该抗体的抗原决定簇互补区域含有V(R/G)V(V/W)CRAD(R/K)RCYAMDV的氨基酸序列(由SEQIDNos8，25，26，28，29，30和31示例)。优选地，该抗原决定簇互补区位于该抗体的重链上；更加优选的，该抗原决定簇互补区为HCDR3。该抗体最优选的为一种人源性抗体。示例和优选的抗体为如下中的5种RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或者RAD88。本发明还涉及具有RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或者RAD88中任一个的免疫反应性的抗体。本发明的另一方面提供了一种抑制血小板凝集的方法。该方法包括将血小板与抑制有效量的本发明的肽或者抗体相接触的步骤。本发明的另一方面提供了一种抑制血纤维蛋白原与血小板结合的方法。该方法包括将血小板与抑制有效量的本发明的肽或者抗体相接触的步骤。附图简述在构成说明书一部分的附图中图1表示筛选出的Fab只与人整合蛋白αIIbβ3结合，而不与其他的RGD结合的人整合蛋白结合。图中所示为基于固定化的人整合蛋白αvβ3，αvβ5，αIIbβ3和α5β1的ELISA实验结果，以及含有由pComb3X-转染的E.Coli所表达的可溶性Fab的上清液。结合了HRP的大鼠抗-HA的单克隆抗体被用于探测。图2表示的是FabRAD87结合到人血小板上，而不能结合到人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上。流式细胞术的结果分析表明该FabRAD87只结合到同时表达整合蛋白αvβ3，αIIbβ3的人血小板上，而不能结合到主要表达整合蛋白αvβ3的HUVEC上。与此对比的，Fab阿昔单抗能够结合到人血小板和人脐静脉血细胞(HUVEC)上，这个结果进一步验证了已被记载过的Fab阿昔单抗与两种β3整合蛋白的交叉反应性。y轴以线性刻度表示每次的计数，x轴以对数刻度表示的是荧光强度。图3表示的是FabRAD87和源自筛选出来的HCDR3序列的合成的肽对整合蛋白αIIbβ3与纤维蛋白原之间反应的抑制作用。生物素(酰)化的纤维蛋白原和下列物质混合(A)不同浓度的FabRAD87，Fab阿昔单抗和混合的人IgG作为阴性对照；(B)合成肽链，然后再加入到固定在ELISA板上的整合蛋白αIIbβ3中。链霉抗生物素-辣根过氧化物酶被用于探测。图中标出了3次独立实验的平均值和标准偏差。图4表示的是FabRAD87在体外抑制血小板凝集。图中所示的血小板凝集检测反应是从全血比浊法(lumi-aggregometer)得到的。每一次检测反应中，15μlFabRAD87(A)或者Fab阿昔单抗(B)溶液被混合入435μl的富含血小板血浆，使其最终浓度达到20nM到100nM之间。然后加入ADP至终浓度为20μM，接着监测凝集10分钟。3个独立实验结果各点的平均值(plottedmeanvalues)和标准偏差如(C)所示。图5表示的是来源于筛选出的HCDR3序列的合成肽在体外抑制血小板凝集。血小板凝集测定反应如图4中描述的那样在特定浓度的肽的存在下进行。值得注意的是3条具有RAD基序的环形肽强烈地抑制血小板凝集(A-C所示)，而一条含有RAD基序和2条含有一个逆向RAD基序的对照肽则没有产生超过背景(D)的效果。在所有血小板凝集分析中，阿昔单抗Fab均作为阳性对照。图6表示的是本发明中抗体的部分重链的氨基酸序列。本发明的详细描述本发明提供了一种可以与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体。术语“抗体”以及其不同的表述形式在这里是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子上免疫活性部位，比如含有抗体结合位点或互补位的分子。其中可以作为示例的抗体分子包括完整的免疫球蛋白分子，大体完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的部分，其中包括已知的被称为Fab，Fab′，F(ab′)2和F(v)的部分，单结构域抗体(dAbs)，折叠的免疫球蛋白构建体及其活性区段。本发明中的一种抗体是使用噬菌体展示技术合成并提纯的(参见，例如国际申请WO94/18221)。下面实施例有关于该过程的详细描述。优选的抗体是人抗体。本发明还公开了一种具有整合蛋白αIIbβ3特异性的人抗体，该抗体源自一个新设计的合成的人抗体库。首先，上述抗体库中的两个半胱氨酸残基被从HCDR3区域中去除。HCDR3长度的减少以及二硫键的去除导致了HCDR3环状结构具有了更大的结构柔性。经过配基结合测定实验中的观察，来源于上述被选出的抗体HCDR3区的肽(CSFGRGDIRNC)(SECIDNO1)与其线性结构GSFGRGDIRNG(SEQIDNO2)在配体结合上具有几乎相同的效能，这一点支持二硫键的去除(参见Smith，J.W.，Hu，D.，Scatterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。第二步，我们选择RAD，而不是RGD，作为整合蛋白结合核心基序，同时随机选择六个残基侧接。在对包含RGD区域的多肽的检测实验中，一种包含有RAD区域的多肽GRADSP已经被广泛用作无活性的对照多肽(参见Wu，M.H.，Ustinova，E.，andGranger，H.J.(2001)Integrinbindingtofibronectinandvitronectinmaintainsthebarrierfunctionofisolatedporcinecoronaryvenues.JPhysiol532，785-791；Slepian，M.J.，Massia，S.P.，Dehdashti，B.，Fritz，A.，andWhitesell，L.)1998)Beta3-integrinsratherthanbetal-integrinsdominateintegrin-matrixinteractionsinvolvedinpostinjurysmoothmusclecellmigration.Circulation97，1818-1827；Guilherme，A.，Torres，K.，andCzech，M.P.(1998)Cross-talkbetweeninsulinreceptorandintegrinalpha5betalsignalingpathways.JBiolChem273，22899-22903；Hautanen，A.，Gailit，J.，Mann，D.M.，andRuoslahti，E.(1989)EffectsofmodifcationsoftheRGDsequenceanditscontextonrecognitionbythefibronectinreceptor.JBiolChem264，1437-1442；Adderley，S.R.，andFitzgerald，D.J.(2000)GlycoproteinIIb/IIIaantagonistsinduceapoptosisinratcardiomyocytesbycaspase-3activation.JBiolChem275，5760-5766).However，thefactthatweselectedRADfromourmotifoptimizationlibrary)。尽管如此，从基序优化库中选择RAD区域的情况说明侧接的残基决定了RAD基序能否与整合蛋白结合(参见Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。我们假定包含在随机侧接区域中的RAD基序可能增加了选出对于整合蛋白αIIbβ3具有特异结合力的抗体的可能性。这里我们使用噬菌体展示技术，从基于随机化的HCDR3序列VGXXXRADXXXYAMDV(SEQIDNO3)的合成的人类抗体库选出对于整合蛋白αIIbβ3具有特异结合力的单克隆抗体。选出的抗体的HCDR3含有一段具有极强一致性的氨基酸序列(V(V/W)CRAD(K/R)RC)(参见SEQIDNos4，5，6，7)，而且对整合蛋白αIIbβ3具有高特异性，而不与其他RGD结合整合蛋白如αvβ3，αvβ5和α5β1结合。同时该抗体，以及来源于其HCDR3区序列的三段合成多肽VWCRADRRC(SEQIDNO5)，VWCRADKRC(SEQIDNO6)和VVCRADRRC(SEQIDNO7)均强烈地抑制整合蛋白αIIbβ3和纤维蛋白原之间的反应，进而抑制离体的血小板凝集。据我们所知，这是第一个具有整合蛋白αIIbβ3特异性的完全人单克隆抗体并且可以有效抑制血小板凝集。本发明一方面提供了一种分离并提纯的血小板凝集肽抑制剂，所述肽具有9到大约50个氨基酸残基并且具有相应于V(V/W)CRAD(K/R)RC(参见SEQIDNos4，5，6，7)的氨基酸序列。该肽优选包括SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列。在另一优选的实施方案中，该肽具有SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列。另一方面，本发明提供了一种具有能够与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体。该抗体的抗原决定簇互补区含有氨基酸序列V(R/G)V(V/W)CRAD(R/K)RCYAMDV(参见SEQIDNos8，25，26，28，29，30和31)。优选的，该抗体的抗原决定簇互补区位于抗体的重链上。更加优选的，该抗原决定簇互补区是HCDR3。最优选的，该抗体是一种人抗体。示例性和优选的抗体在这里被指定为如下抗体中的5种RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或RAD88。本发明还涉及具有RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或RAD88中任一个的免疫反应性的抗体。本发明的另一方面也提供了一种抑制血小板凝集的方法，该方法包括将血小板与抑制有效量的本发明中的肽或抗体相接触的步骤。本发明的另一方面也提供了一种抑制血纤维蛋白原与血小板发生结合反应的方法，该方法包括将血小板与抑制有效量的本发明中的肽或抗体相接触的步骤。本发明的一个实施方案中提供了含有此处所述的结合位点，并且可以与预先选定的靶分子发生特异性结合的人单克隆抗体。本发明同时描述了可以产生这种抗体分子的细胞系，培养该细胞系的方法以及生产这种人单克隆抗体的方法。本发明的一个优选的实施方案中，展示于噬菌粒颗粒表面的是一种融合蛋白，该融合蛋白包含一条免疫球蛋白的重链或轻链和丝状噬菌体膜锚定蛋白。事实上，该展示蛋白是一种工程化的免疫球蛋白的轻链或重链，其中导入了结合位点。此外，在本发明的很多实施方案中，该展示蛋白是作为异源二聚体在噬菌体表面上被表达制备的，该异源二聚体由重链和轻链多肽组成，其中一个或另一个与膜锚定蛋白形成融合蛋白。因此，当重链作为融合蛋白时，优选实施方案中的展示蛋白包含Fab片段，其具有锚定重链和轻链。在其中一个实施方案中，本发明也提供了一种编码上述人单克隆抗体的多核苷酸。该单克隆抗体含有此处所述的结合位点并且人单克隆抗体可以特异性地结合事先选定的靶分子。编码该人单克隆抗体的核苷酸序列可以通过测序来鉴定氨基酸序列。DNA测序的方法已经被广泛使用而且该方法可以用来实施本发明中的实施方案。这些方法可能会使用如下酶DNA聚合酶I的Klenow片段，SEQUENASE(USBiochemical，ClevelandOhio)，Taq聚合酶(Pekin-Elmer)，热稳定性T7聚合酶(AmershamPharmaciaBiotech，PiscatawayN，J.)，或者是DNA聚合酶和纠错外切酶的组合，如在ELONGASE扩增系统中所使用(LifeTechnologies，GaithersburgMd.)。优选的，序列被如下面的机器自动制备，这些机器包括HamiltonMICROLAB2200(Hamilton，RenoNev.)，Peltierthermalcycler200(PTC200；MJResearch，WatertownMass。)以及ABICATALYST800(Perkin-Elmer)。然后使用ABI373，377DNA测序系统(Perkin-Elmer)，MEGABACE1000DNA测序系统(MolecularDynamics，SunnyvaleCalif.)或者其他一些本领域已知的系统。最后再使用本领域中广泛使用的算法对测序结果进行分析(参见Ausubel，F.M.(1997)ShortProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NewYorkN.Y.，unit7.7；Meyers，R.A.(1995)MolecularBiologyandBiotechnology，WileyVCH，NewYorkN.Y.，pp.856-853.)。本发明中产生单克隆抗体的细胞系的制备方法在这里进行了详细的描述首先使用噬菌粒载体诱变的方法，然后使用常规的筛选技术来检测目的单克隆抗体的基本结合模式，以确定该抗体的结合位点是否存在。因此，如果一个待测的人单克隆抗体能够与预先选出的靶分子结合，那么该待测人单克隆抗体就被认为等同于本发明中的细胞系产生的人单克隆抗体。不经过艰苦的试验，通过检测一个人单克隆抗体是否能够抑制本发明中人单克隆抗体与预先选出的靶分子之间的结合来证明该抗体是否等同于本发明中的单克隆抗体是有可能的。如果通过标准竞争性检测实验发现本发明的人单克隆抗体对固相化的靶分子的结合降低，则表明待测单克隆抗体与本发明的抗体竞争那么就证明很有可能这两种单克隆抗体可以结合相同的，或者是密切相关的表位。另外还有一种方法可以用来证明待测人单克隆抗体是否具有与本实验中人单克隆抗体或肽相同的特异性首先使用可以与本发明中人单克隆抗体或多肽发生特异反应的靶分子来孵育该抗体或者多肽；然后加入待测的人单克隆抗体以检测该待测人单抗与靶分子的结合力是否被抑制。如果该待测人单抗的结合力被抑制，那么证明该待测人单抗与本发明中的人单抗或肽具有相同的，或者功能等同的表位特异性。除此以外，还有一种方法可以用来证明待测人单克隆抗体是否具有与本实验中人单克隆抗体或多肽相同的特异性首先确定待测抗体的抗原决定簇互补区(CDR)的氨基酸序列。具有完全相同或者功能等同的氨基酸序列的CDR的抗体分子具有相同的结合特异性。氨基酸序列测序的方法在本领域众所周知。一个抗体的免疫特异性，靶分子结合能力及其对于表位的亲和性由与该抗体发生特异免疫反应的表位来定义。这种表位特异性至少有一部分被该抗体重链可变区的氨基酸残基序列所定义，还有部分地被轻链可变区的氨基酸残基序列所决定。特别优选的人单克隆抗体具有由大肠杆菌、真菌等微生物，杂交瘤细胞或者下面将要介绍到的质粒载体所产生的单克隆抗体的结合特性。该领域中制备肽，多肽，蛋白质以及抗体的方法均已经熟知。短语“具有结合特异性”是指相当的单克隆抗体对预先选择的靶分子具有相同或者近似的免疫反应性，并且竞争与靶分子结合。术语“保守的变异”是指抗体肽链上的某个氨基酸被另外一个氨基酸所取代，产生的新的抗体仍然能够特异性地结合预先选择的目标分子。类似的，本发明的一个优选的实施方案涉及编码上述重链和/或轻链的核苷酸序列及其互补序列。互补序列是指在极为严紧的杂交实验条件下，能够与上述核苷酸序列发生杂交反应的核苷酸序列。人单克隆抗体与鼠单克隆抗体相比，具有特别的优点，尤其是在作为用于人类的治疗剂时。特定的，人单克隆抗体不会被作为“外来的”抗原而很快地被清理掉，而且不会像外来抗原或外来抗体一样激活人体免疫系统。本发明的一个实施方案提供了由当前方法制备的本发明的单克隆抗体。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及截短的免疫球蛋白分子，其含有来自本发明的人单克隆抗体的Fab片段。没有Fc受体的Fab片段是可溶的，而且在血浆中具有更长的半衰期，因此具有在治疗剂方面的优势；而且在使用可溶性Fab的模式也具有诊断优势。可溶性Fab片段的制备在免疫学领域都已被熟知，而且有很多种方法可以用来制备该片段。这里描述了其中一种优选的制备可溶性Fab片段的方法。优选的，本发明的抗体可以与整合蛋白αIIbβ3发生特异性的免疫反应，即和其他的整合蛋白分子相比，该抗体优先与整合蛋白αIIbβ3特异性的结合。这里作为示例和优选的抗体在这里被指定为RAD3，RAD4，RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或者RAD88。这些抗体的VH区的氨基酸序列如图6所示。特别优选的，该人单克隆抗体是指具有免疫反应特异性的单克隆抗体，其具有成对出现的重链和轻链免疫球蛋白可变区的氨基酸序列，所述轻链是指在这里描述的轻链，而该重链具有一个如图6中所示的氨基酸序列及其保守取代基。表2那些和表2相比具有较弱保守性的取代基可以通过挑选残基进行选择，所述残基在以下性质的维持反面显著不同(a)取代区肽链骨架结构，比如片层和螺旋状结构；(b)目标位点分子的电荷或者疏水性；或(c)侧链的体积。一般认为发生在下列结构中的取代会最大程度上改变蛋白质的性质(a)亲水残基，比如丝氨酰基，苏氨酰基，取代为(或被取代为)一个疏水残基，比如亮氨酰基，异亮氨酰基，苯丙胺酰基，缬氨酰基，丙氨酰基；(b)一个半胱氨酸或脯氨酸取代为(或被取代为)别的残基；(c)一个带正电侧链的残基，如赖氨酰基，精氨酰基或者组胺酰基，取代为(或被取代为)一个带负电侧链的残基，如谷氨酰基，天冬氨酰基；或者(d)一个有较大体积侧链的残基，如苯丙氨酸，取代为(或被取代为)一个不带侧链的残基，如甘氨酸。有许多种方法，比如斯卡查德分析法(Scatchardanalysis)，可以与放射性免疫测定法相结合来测定抗体对一种整合蛋白的亲和力。亲和力是用一个结合常数Ka来表示的，Ka被定义为在平衡状态下，整合蛋白-抗体复合物的摩尔浓度与游离抗原和游离抗体的摩尔浓度的比值。一个多克隆抗体制剂的组分会对不同的整合蛋白表位具有不同的亲和性，因此该制剂的结合常数Ka是指该制剂组分对于整合蛋白的亲和性或亲和力的平均值。而一个单克隆抗体制剂的组分则对某一个特殊的整合蛋白表位具有单一的特异性，因此该制剂的结合常数Ka则是其亲和力的真实量度。Ka值在109-1012L/mol的高亲和力抗体制剂被优先用于免疫测定，在此免疫测定过程中，整合蛋白-抗体复合物必须经过一些十分剧烈的处理过程。而Ka值在106-107L/mol的低亲和力抗体制剂则被优先用于一些免疫纯化或类似过程中，在这类过程中整合蛋白最终需要从抗原上解离，而且优选以具有活性的形态存在。(参见Catty，D.(1988)Antibodies，VolumeIAPracticalApproach，IRLPress，Washington，D.C.；andLiddell，J.E.andCryer，A.(1991)APracticalGuidetoMonoclonalAntibodies，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)亲和力同样也可以用解离常数Kd来表述。优选的结合力包括那些具有低于如下数值的Kd值10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M或10-13M。另一方面，本发明提供了一种可以抑制血小板凝集的肽。该肽具有9到约50个氨基酸残基，而且该肽来源于本发明的抗体。优选的，该肽包含有符合如下通式的氨基酸序列V(V/W)CRAD(K/R)RC(参见SEQIDNOs4，5，6，7)。作为示例的优选的肽在下面实施例中进行了阐明。本发明涉及用于实施这里所描述的治疗方法的组合物。本发明的组合物包含一种生理上可接受的载体以及至少一种源于此处所述的人单克隆抗体和肽，该单克隆抗体或肽作为活性成分溶解或分散于组合物中。在一个优选的实施方案中，该组合物在施用于人作为治疗之用的时候不具有免疫原性。术语“药学可接受的”，“生理上可接受的”以及关于此的其他一些阐述方式，当它们被用于形容组合物，载体，稀释剂和试剂的时候，是可替交地使用的，而且它们代表这些材料是可以被施用于人，同时不会引起诸如恶心，头晕，胃部不适等不良生理反应。在本领域，关于含有溶解或分散于其中的活性成分的药用组合物的制备方法已经被广泛了解。通常是把该药用组合物制备成为无菌的注射剂，液体溶液或乳浊液，水化的或非水化的，尽管如此，也可以将该药用组合物制备成适宜在用前制成溶液或者悬浊液的固态。该制剂也可以被乳化。因此，一种包含了抗体分子的组合物可以采取溶液，悬浊液，片剂，胶囊，缓释剂，粉术或其他剂型。该活性组分可以和一些药学上可接受，而且和该活性组分的活性不冲突的赋形剂混合，该活性组分应该根据这里描述的治疗方法来确定其合适的施用量。适合的赋形剂包括，举例来说水，盐溶液，葡萄糖，甘油，乙醇等及其组合。另外，如果需要的话，该组合物还可以包含微量的辅助剂，比如润湿剂，乳化剂，pH缓冲液等可以增强该活性组分的效力的物质。该发明中治疗组合物可以包含组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离端的氨基形成)，该酸加成盐是由无机酸，例如盐酸，磷酸，或者是诸如乙酸，酒石酸，苯乙醇酸等的有机酸形成的。由游离端羧基形成的盐也可能来源于无机碱，比如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙和氢氧化铁等；或者来源于有机碱，比如异丙胺，三甲胺，2-乙基乙醇，组氨酸和普鲁卡因等。生理上可接受的载体在本领域是众所周知的。示例性的液态载体是灭菌的水溶液，该水溶液可以除了活性组分和水以外不含有别的物质，也可以含有具有生理pH值的磷酸钠，或者生理盐水，或者两者都含有，比如磷酸盐缓冲液。另外，该液态载体也可以含有多于一种的缓冲盐类，以及诸如氯化钠，氯化钾，葡萄糖，丙二醇，聚乙二醇和其他溶质。液态组合物也可以包括有或无水的液相，该液相举例来说包括甘油，植物油，比如棉籽油，有机酯，比如乙基油酸，以及水油乳剂。一种治疗组合物包含有本发明中的人单克隆抗体，通常其量为每重量总治疗组合物至少0.1％重量的所述抗体。重量百分比是抗体的重量与总组合物的比率。因此，举例来说，重量百分比0.1是指每100克总治疗组合物中含有0.1克抗体。优选地，一种含有抗体的治疗组合物一般含有大约10微克(μg)每毫升(ml)到大约100毫克(mg)每毫升(ml)的抗体作为活性组分，更加优选的，含有大约1mg/ml到大约10mg/ml。(即，大约0.1-1重量百分比)。在另一实施方案中，一种治疗组合物包含有本发明中的肽，通常其量为每重量总治疗组合物至少0.1％重量的所述肽。重量百分比是肽的重量与总组合物的比率。因此，举例来说，重量百分比0.1是指每100克总治疗组合物中含有0.1克肽。优选地，一种含有肽的治疗组合物一般含有大约10微克(μg)每毫升(ml)到大约100毫克(mg)每毫升(ml)的肽作为活性组分，更加优选的，含有大约1mg/ml到大约10mg/ml。(即，大约0.1-1重量百分比)。本发明在另一方面提供了一种治疗方法，该治疗方法中使用的是本发明中的组合物和化合物。考虑到在病人体内使用人单克隆抗体的益处，这里描述的抗体非常适合作为一种用于体内的治疗试剂，所述抗体可以用于阻断或抑制那些能够与该抗体结合的目标分子的功能。这里描述的来源于该单克隆抗体的肽也可以用于本发明中的治疗方法。该治疗方法包括将确定含有目标分子的样品与含有治疗有效剂量的本发明中的人单克隆抗体或肽的组合物相接触，该单克隆抗体或肽能够与该目标分子结合。对于体内模式来说，该治疗方法包括给病人使用治疗有效剂量的生理上可接受的组合物，该组合物含有本发明中的人单克隆抗体或肽。该单克隆抗体和肽的施用量的范围是指足够产生预期效果的剂量，该预期效果是指由目标分子产生的疾病的症状得到改善。施用剂量不能大到产生不良副作用的程度，该不良副作用包括高血粘度综合征，肺部水肿，充血性心脏衰竭以及类似病症。一般地，施用剂量应该因病人的年龄，情况，性别以及患病程度的不同而不同，该剂量可以由本领域中有经验的人员决定。在发生并发症的情况下，医师可以调整该剂量。典型地，本发明中抗体的治疗有效剂量是指在该抗体存在于一种生理上可接受的组合物中被施用时，足够使其血浆浓度达到大约0.1微克(μg)每毫升(ml)到大约100μg/ml，优选浓度为大约1μg/ml到大约5μg/ml，通常为5μg/ml的剂量。不同的描述是，该剂量可以在大约0.1mg/kg到大约300mg/kg之间变化，优选剂量为大约0.2mg/kg到大约200mg/kg之间，最为优选的剂量可以在大约0.5mg/kg到大约20mg/kg之间变化，每天一次或多次施药，连续施药一天或多天。典型地，本发明中肽的治疗有效剂量是指在该肽存在于一种生理上可接受的组合物中被施用时，足够使其血浆浓度达到大约0.1微克(μg)每毫升(ml)到大约100μg/ml，优选浓度为大约1μg/ml到大约10μg/ml。不同的描述是，该剂量可以在大约0.1mg/kg到大约300mg/kg之间变化，优选剂量为大约0.2mg/kg到大约200mg/kg之间，每天一次或多次给药，连续给药一天或多天。本发明中的人单克隆抗体或肽可以通过非肠道注射或者逐步滴注(gradualinfusionovertime)的方式给药。虽然目标分子在体内一般可以通过全身施药来达到，而且因此最为常用的方法就是通过静脉注射该治疗组合物，但是其他的组织和输送方法在该目标组织也可能含有目标分子的时候也被使用。因此，本发明中的人单克隆抗体和肽可以通过静脉内，腹膜内，肌内，皮下，腔内，透皮施药，同时也可以通过蠕动装置来输送。包含了本发明中人单克隆抗体或肽的治疗组合物一般采用静脉的方法施药，比如通过注射一个单位剂量的治疗组合物。术语“单位剂量”在本发明的治疗组合物参考使用时是指适宜以单一剂量施用于个体的物理上分散的单位，每一个单位包含有预先计算好的，能够产生预期疗效的活性物质和需要的稀释剂，即载体或媒介物。该组合物以一种和剂量形式相容的模式来施用，而且施用量为治疗有效剂量。施用量取决于被治疗的个体，该个体可以利用活性组分的系统的能力以及所需的治疗效果。活性组分的精确施用量取决于医师的判断，而且每一个个体都是独特的。尽管如此，合适的系统施用剂量范围在这里被公开，而且该剂量决定于施用途径。适宜的施药方案同样也是多种多样的，但是典型的该适宜的施药方案包括初次施药后，每间隔一小时或几个小时再通过随后的注射或其他施用重复剂量。作为选择，也可以使用连续的静脉滴注以维持血液中的浓度在体内具有治疗效果。一种含有整合蛋白αIIbβ3结合位点的抗整合蛋白αIIbβ3的单克隆抗体或由此单克隆抗体衍生出的肽可以在体内或体外用于调节血小板上整合蛋白αIIbβ3的功能。比如，该人单克隆抗体或肽可以被用在药学上可接受的组合物，当该组合物以有效剂量被施用于人体的时候，能够抑制血小板凝集，因此可以降低血栓形成的可能性。因此，一种抑制血小板凝集的抗整合蛋白αIIbβ3的单克隆抗体在体内的使用可以调节体内任何由血小板凝集所导致的生理应答，比如血液凝固和一些炎症反应。当该方法在体内实施时，有效剂量的抗体或肽的组合物通过静脉内给药的方法施用于哺乳动物，该抗体或肽的组合物含有生理上可接受的稀释剂以及可以与整合蛋白αIIbβ3发生免疫反应同时可以抑制血小板凝集的抗体分子。同时该哺乳动物被保持足够时间，以使得抗体分子能够和整合蛋白αIIbβ3发生免疫反应而且形成免疫反应产物，同时也使得含有该肽的结合位点和整合蛋白αIIbβ3结合并形成一种肽-受体复合物，这样一般的配基就不能够和受体结合了。本发明中具有整合蛋白αIIbβ3特异性的抗体可以被用作一种抗血栓类治疗剂。该抗体(或其片段)可以被用于抑制血小板凝集和血栓形成。该抗体也同样可以被用于抑制由血小板凝集引起的周期性的流动变化，该过程可能早于血栓的形成或再形成。该抗体可以被用于许多种需要避免血栓形成或再形成(栓塞)的过程中。比如，该抗体可以被施用于个体(比如哺乳动物如人)，来避免肺部栓塞，暂时性缺血发作(TIAs)，深静脉栓塞，冠状动脉旁路手术以及在放置人工瓣膜或脉管(比如在自体，非自体的或者人造的脉管移植中)的手术中所引起的血栓形成。本发明中的抗体也可以被施用于个体来避免血管成形术中产生的血小板凝集和血栓形成，该血管成形术可以由气囊，冠状动脉粥样斑块切除术，激光血管成形术或其他的一些适宜方法来完成。抗体可以在血管成形术过程之前施用(早于血管成形术的)，血管成形术过程中施用或血管成形术后施用。这种治疗方法可以避免血栓形成，并因此降低血管成形术后出现血栓形成并发症的可能性，该并发症包括诸如死亡，心肌梗塞或是需要进行PTCA或冠状动脉旁路手术的再发缺血事件。血小板凝集激活凝固级联反应，并产生一种更加稳定的血纤维蛋白原网和栓塞块，这些都可以使用溶血栓剂来使其溶解。该抗体可以被单独施用于个体(如人)，或者是和一种溶血栓剂一起使用来防止或降低发生在溶血栓反应之后的再栓塞的发生，并且加速斑块的溶解速度。所述溶血栓剂包括比如一种纤维蛋白溶酶原活化剂(如组织纤维蛋白溶酶原活化剂，尿激酶或链激酶，重组的组织纤维蛋白溶酶原活化剂)或者是一种抗凝血剂或抗血小板药物，比如阿司匹林，肝素或香豆素抗凝血剂(如warfarin)。该抗体或片段可以先于溶血栓剂或抗凝血剂施用，同时施用，或者是在溶血栓剂或抗凝血剂之后施用。该抗体或片段的施用量为足够抑制能够导致再栓塞形成的血小板凝集。该抗体或抗体的片段的有效剂量(如，抑制血小板凝集并因而抑制血栓形成的有效剂量)可以利用一种药学上可接受的载体，比如灭菌盐溶液，通过非肠道的方式给药，优选的方式是静脉给药。缓冲介质也可以包含其中。该抗体制剂通常也可以包含添加剂，比如稳定剂(如聚山梨醇酯80，USP/NF)。该抗体可以单剂量给药，或连续给药，或多样给药(例如，一次大量注射后进行连续滴注)。作为选择，该抗体可以通过一种控释装置(例如，通过一种多聚体给药系统或膜片给药系统)或者其他的适宜方法来给药。施药量取决于很多因素，例如临床症状，个体重量，是否施用其他药物(例如溶血栓剂)等。本发明中具有整合蛋白αIIbβ3特异性的免疫球蛋白也可以被用于血栓成像。在此用途中一般优选抗体片段。如前所述，嵌合的重链基因可以被设计成被截短的形态以合成一种嵌合的免疫球蛋白片段(例如Fab，Fab’或F(ab’)2)，并将该片段用于免疫荧光闪烁成像。这些分子可以用放射性同位素，如碘131，碘125，锝99或碘111等直接标记，也可以通过偶联的螯合剂，如DTPA来标记，进而产生放射免疫荧光闪烁造影剂。此外，也可以通过把放射性金属结合功能域(螯合区)通过工程学手段加入到该嵌合抗体位点以产生可以用来标记的位点。因此，免疫球蛋白可以被设计成包含非人类血小板特异性的可变区，人恒定区(优选为截短的)以及来自于金属结合蛋白比如金属硫蛋白的金属结合功能域。该整合蛋白αIIbβ3特异性的免疫球蛋白被施用到疑有血栓的病人体内。在该标记的免疫球蛋白已经充分定位于血栓位点以后，标记产生的信号可以由一部光扫描装置，例如伽玛照相机来进行探测。然后探测到的信号再转变成血栓的影像。该影像使得对于血栓在体内的定位以及合适治疗方案的制定成为了可能。以下实施例举例说明了本发明的示例性实施方案，并不以任何方式对本发明的说明书或权利要求进行限制。实施例细胞系，蛋白质和肽人脐静脉内皮细胞(HUVEC)是从Biowhittaker公司(Walkersville，MA)购买的，而且该细胞是在随细胞一起购买的EGM-2培养基(Biowhittaker)中培养的。整合蛋白αIIbβ3是从酶研究实验室(SouthBend，IN)购买的。整合蛋白αvβ3和整合蛋白αvβ5是从Chemicon公司(Temecula，CA)购买的。人血纤维蛋白原是从Sigma-Aldrich公司(St，Louis，MO)购买的。本实验中所使用的肽是Peptron公司(Taejon，Korea)合成的。人血纤维蛋白原和肽都是使用EZ-link-PFP-生物素(Pierce，Rockford，IL)，同时按照公司提供的使用说明进行生物素(酰)化的。阿昔单抗(ReoPro)是从EliLilly公司(Indianapolis，IN)购买的。文库的建立使用TRIREAGENTRNA抽提试剂(MolecularResearchCenter，Cincinnati，OH)从六位健康的志愿者捐赠的骨髓中提取总RNA。第一链cDNA可以使用SUPERSCRIPT预扩增系统(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)，利用寡(dT)引物法来合成。然后使用引物neo-rad-f(GTGTATTACTGTGCGAGAGTGGGGNNKNNKNNKCGTGCCGACNNKNNKNNKTACGCTATGGACGTCTGGGGC)(参见SEQIDNO9的序列图)，引物dpseq(AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC)(参见SEQIDNO10的序列图)以及噬菌粒载体pCcomb3X-TT(参见Barbas，C.F.3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.)2001)PhageDisplayALaboratoryMannal，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)作为模板，用聚合酶链式反应方法对编码如下片段的cDNA进行扩增反应编码部分FR3片段、随机化HCDR3序列以及融合到重链恒定区I(CH1)的重链可变区VH)的FR4区域。在编码重链可变区(VH)中FR1区到FR3区的cDNA的扩增过程中，我们使用引物DP-47N-term(GCTGCCCAACCAGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTA)(参见SEQIDNO11的序列图)和引物DP-47FR3(CACTCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCCTCGGCTCT)(参见SEQIDNO12的序列图)来对先前制备的人骨髓cDNA进行PCR扩增。所有的扩增反应都是使用Pharmacia公司(Piscataway，NJ)的Taq聚合酶，在标准PCR反应条件下进行的。两个cDNA片段则使用叠加延伸PCR方法，用引物lead-VH(GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC)(参见SEQIDNO13的序列)和引物dp-Ex(GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC)(参见SEQIDNO14的序列)进行连接。对于以前选出的存在于噬菌粒载体pCcomb3X-TT上的DPK-26人κ轻链cDNA，则使用引物ompseq(AAGACAGCTATCGCGATTGCAGTG)(参见SEQIDNO15中序列)和引物leadB(GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC))参见SEQIDNO16中序列)进行PCR扩增。编码重链片段的cDNA库和轻链通过叠加延伸PCR反应，使用引物ompseq和引物dp-Ex进行融合。所形成的Fab编码序列库用SfiI(Roche，Indianapolis，IN)消化后连接到如噬粒载体pComb3X，然后再转化进入大肠杆菌ER2537菌株(NewEnglandBiolabs，BeverIy，MA)中(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。库的筛选一共进行了7轮的淘选过程(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。首先，前5轮进行的是抗固定化人整合蛋白αIIbβ3的淘选过程，在该过程中使用包含100ng蛋白的50μl金属缓冲液(25mMTris-HCl，pH7.5，137mMNaCl，1mMKCl，1mMMgCl2，1mMCaCl2和1mMMnCl2)作为包被液。Tween20浓度为0.05％的TBS(Tris-bufferedsaline)溶液作为漂洗液和胰蛋白酶(Becton-Dickson)浓度为10mg/ml的TBS溶液作为洗脱液。淘选过程中使用的是96孔板(Costar3690，Corning，NY)。在37℃时胰蛋白酶消化30分钟。在第六轮淘选过程中，包含25ng蛋白的金属离子缓冲液被用于包被，Tween20浓度为0.5％的TBS溶液作为漂洗液。在第七轮淘选过程中，包含12.5ng蛋白的金属离子缓冲液被用于包被。第一轮中，96孔板被漂洗5次，第二轮和第三轮漂洗10次，其余四轮漂洗15次。每一轮淘选过程后产生的噬菌体池都使用噬菌体ELISA方法进行测定，该噬菌体ELISA测定过程中使用偶联辣根过氧化物酶的羊抗-M13作为二级抗体。最后一轮淘选结束后，输出培养皿里长出的单菌落所产生的噬菌体被使用噬菌体ELISA的方法来测试其对人整合蛋白αIIbβ3的结合情况。(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。轻链重排和筛选编码Vκ和Vλ的cDNA从所制备的人骨髓cDNA中扩增出来，该过程使用的是早先报道过的引物(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)，该引物包含可以与各种Vκ和Vλ家族N末端编码序列杂交的有义引物，也包括可以与Vκ和Vλ的FR4区中C术端编码序列杂交的反义引物，这些引物均为高度保守的(参见Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.，andFoeller，C.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，PublicHealthService，Natl.Inst.Health，Bethesda)。如所述制备Cκ和Cλ的编码序列(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)，而且该编码序列通过叠加延伸PCR的方法被分别融合到Vκ和Vλ的编码序列，该过程使用的是引物RSC-F(GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGCTC)(参见SEQIDNO17中序列)和引物lead-B(GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC)(参见SEQIDNO18)。两种克隆方案被用于从筛选出来的Fab中取代DPK-26人κ轻链。策略一中，DPK-26人κ轻链编码cDNA用内切酶SacI和XbaI(NewEnglandBiolabs)消化的方法，从最后一次淘选结束后得到的噬粒载体池中移除。接着用相同的限制性内切酶消化人轻链编码序列库，并将其连接到准备好的噬粒载体，然后再转化进入大肠杆菌ER2537菌株内。第二种策略中，使用引物lead-VH和引物dpseq将重链片段编码cDNA从最后一次淘选结束后得到的噬粒载体池中扩增出来，然后再使用引物ompseq和dp-EX，通过叠加延伸PCR反应将这些重链片段编码cDNA和人轻链编码序列库融合起来。得到的Fab编码库用内切酶SfiI消化，然后连接到如噬粒载体pComb3X，再使用先前描述的方法转化进入大肠杆菌ER2537菌株中(具体参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。在这两种轻链库混合后进行了3轮淘选，每次使用12.5ng包被的整合蛋白αIIbβ3。每一轮反应中，样品孔被漂洗15次。在最后一次淘选结束之后，噬菌体由输出培养皿里长出的单菌落产生，同时使用所述噬粒ELISA的方法来检测该噬菌体对整合蛋白αIIbβ3的结合情况(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。ELISA合成可溶性Fab的方法采用已经出版的方法(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。简要地，筛选出的菌落在5ml超级培养基中37℃下培养6小时，加入IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，Sigma-Aldrich)至最终浓度1mM后培养过夜。Costar369096孔板的每一个样品孔用含有100ng整合蛋白αIIbβ3的50μl金属离子缓冲液在4℃下包被过夜。该96孔板中加入含有3％(w/v)脱脂乳的TBS包被液，然后37℃下孵育1小时进行封闭。接下来，50μl被等体积的含有3％(w/v)脱脂乳的TBS溶液稀释过的该培养基的上清液，50μl用含有3％(w/v)脱脂乳的TBS溶液稀释到终浓度为1μg/ml的辣根过氧化物酶偶联的大鼠抗-HA单克隆抗体3F10(Roche)，以及50μlABTS底物溶液(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)被陆续加入样品孔中。在加入反应试剂之前，该96孔板应该用含0.05％Tween20的TBS溶液洗涤5次。过程中的每一步该96孔板都要在37℃下孵育1小时。为了检测筛选出Fab的交叉反应性，在上述相同的条件下使用包被过的整合蛋白αvβ3，αvβ5和α5β1进行平行试验。纤维蛋白原结合抑制实验Costar369096孔板的样品孔用50μl含有100ng整合蛋白αIIbβ3的金属离子缓冲液4℃包被过夜。该96孔板用水漂洗两遍，并且用160μl含有3％(w/v)脱脂乳的TBS封闭液37℃下封闭1小时。该96孔板用水简单漂洗以后，每一个样品孔都加入了50μl含有Fab、提纯的FabsRAD87和阿昔单抗的培养基上清液，或者是50μl混合了合成肽和1.2μM生物素酰化纤维蛋白原的含3％(w/v)脱脂乳的TBS溶液。Fab的最终浓度被调整为介于1.3×10-8M到8.0×10-7M之间；而上述合成肽的最终浓度被调整为介于8.9×10-8M到9.1×10-5M之间。所加入的试剂首先在37℃下孵育2个小时，再用水漂洗10次，然后用含0.05％Tween20的TBS溶液漂洗5次后加入50μl稀释于含3％脱脂乳的TBS溶液中的0.5μg/ml的链(霉)亲和素-辣根过氧化物酶(streptavidine-HRP)，于37℃下孵育1小时。如上漂洗后，再加入50μlABTS底物溶液(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。该实验每一种浓度重复三次，并计算结果的平均值和标准方差。流式细胞术从一位健康的志愿者身上抽取外周血，并且收集在一个ACD试管(BectonDickinson，SanJose，CA)中。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用0.05％(w/v)的胰蛋白酶，0.53mMEDTA(LifeTechnologies)处理5分钟，再以500g转速离心2分钟收集，然后再悬浮于含1％(w/v)BSA的PBS溶液中。随后向重悬于40μl含1％(w/v)BSA的PBS溶液，或者是重悬于40μl外周血中的细胞中加入FabRAD87或者Fab阿昔单抗。室温下孵育40分钟后用含1％(w/v)BSA的PBS溶液漂洗2次，然后加入10μl偶联的FITC和抗-人IgG多克隆抗体(Sigma-Aldrich)，该抗体稀释于750μl含1％(w/v)BSA的PBS溶液。加入该溶液后室温下孵育20分钟。用含1％(w/v)BSA的PBS溶液漂洗2次之后，可以使用来自BectonDickinson公司(SanJose，CA)的FACStar仪器进行流式细胞术。血小板凝集检测人类外周血的采集如前所述。富含血小板的血浆(PRP)以转速135g离心15分钟的方法，从采集到的外周血中获得。接下来以转速1500g离心15分钟产生了血小板含量较少的血浆(PPP)。通过混合PRP和PPP可以制备血小板浓度为300000-350000个/μl血浆的条件性(conditioned)血浆。溶解于15μlPBS的RAD87单克隆抗体，阿昔单抗和肽分别加入435μl的该血浆，以使得单克隆抗体的最终浓度20nM到100nM之间，肽的最终浓度为0.4μM到90μM之间。血小板凝集检测是按照以前描述的方法并且使用全血比浊法(lumi-aggregometer)(Chrono-log，Havertown，RA)进行的(参见Klinkhardt，U.，Kirchmaier，C.M.，Westrup，D.，Breddin，H.K.，Mahnel，R.，Graff，J.，Hild，M.，andHarder，S.(2000)DifferentialinvitroeffectsoftheplateletglycoproteinIIb/IIIainhibitorsabxicimaborSR121566Aonplateletaggregation.fibrinogenbindingandplateletsecretoryparameters.ThrombRes97，201-207)。监测每种样品的阻抗直到建立稳定的基线(每分钟的飘移量＜5mV)。为了诱导血小板凝集，加入9μl的ADP溶剂以使得达到的最终浓度为20μM。一对电极之间随着时间增加而增加的电阻信号通过一个表面被传输到个人电脑中并加以分析(AGGRO/LINK，Chrono-log)。亲和性检测FabsRAD87和阿昔单抗与整合蛋白αIIbβ3之间的解离常数是按照以前描述的方法，通过竞争性ELISA进行测定(参见Djavadi-Ohaniance，L.，Goldberg，M.E.，andFirguet，B.(1996)Measuringantibodyaffinityinsolution.InAntibodyEngineering(McCafferty，J.，Hoogenboom，H.R.，andChiswell，J.，eds)pp.77-98，IRLPress，Oxford；Yi，K.，Chung，J.，Kim，H.，Kim，I.，Jung，H.，Kim，J.，Choi，I.，Suh，P.，andChung，H.(1999)Expressionandcharacterizationofanti-NCA-95scFv(CEA79scFv)inaprokaryoticexpressionvectormodifiedtocontainaSfiIandNotIsite.Hybridoma18，243-249)。简要地说，Costar369096孔板的样品孔都使用50μl含有250ng整合蛋白αIIbβ3的金属离子缓冲液4℃下包被过夜。接着该96孔板用水漂洗5次，然后再用160μl含2％(w/v)BSA的PBS溶液37℃下封闭2小时。再加入提纯的FabsRAD87或阿昔单抗到终浓度为2×10-10M。整合蛋白αIIbβ3的终浓度被调节为1×10-7M到1×10-10M之间。这些混合物被孵育过夜，以达到平衡状态。96孔板用水简单漂洗以后，再加入抗体-抗原混合物到样品孔中，然后室温下孵育2小时。该96孔板先用0.05％Tween20的PBS液漂洗3次，然后加入200ng/ml偶联的辣根过氧化物酶和抗-人IgG抗体(Pierce)。室温下孵育1小时后，该96孔板用0.05％Tween20的PBS液漂洗5次，然后加入50μlABTS底物溶液(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。在37℃孵育2小时以后，加入50μl3N盐酸溶液终止反应。每个样品孔的吸光度值由酶标反应分析仪，在405nm波长下测量。y轴为v/[Ag]，x轴为v的Scatchard曲线可以绘制出来。[Ag]为游离抗原的浓度；v为已结合的抗体的比例，该比例数值是由规定浓度的可溶性抗原的吸光度值与该可溶性抗原不存在时的吸光度值的比值。该Scatchard曲线中一条直线的斜率等于1/Kd。天然/合成的人Fab库的建立和筛选本研究的目的是通过在HCDR3区域中移植一个两端都侧接3个随机氨基酸残基的RAD基序来构建合成的人抗体，该抗体可以区别整合蛋白αIIbβ3和其它RGD结合整合蛋白，尤其是整合蛋白αvβ3。第一步，我们利用一个RAD基序，而不是RGD基序，作为中心识别序列。第二步，移除早期研究中中心识别序列周围存在的一个二硫键CX9C。第三步，该合成的HCDR3序列库被移植入从人骨髓cDNA中扩增出来的天然的人VH序列库中。因此，除了通过将HCDR3随机化以外，也通过将VH区多样化来建立二级文库多样性。一个含有随机HCDR3序列VGXXXRADXXXYAMDV(参见SEQIDNO3)的人抗体库在噬粒载体pComb3X中建立起来，该序列中的X指代20种天然氨基酸中的任一种。使用人重链可变区基因DP-47特异引物和从6名健康志愿者体内采集的人骨髓cDNA作为模板，采用PCR的方法进行扩增编码重链可变区中FR1至FR3片段的VH。天然/合成的重链杂交体起初是和初始选择的DPK-26人κ轻链配对的。得到的Fab库被克隆入噬粒载体pComb3X后产生出1×109独立的转化菌株的多样性。从未筛选的库中随机挑出的克隆证实了VH和HCDR3序列的多样性。使用固定化的人整合蛋白αγβ3进行7次淘选后，80％以上的被选择克隆都连结上整合蛋白αIIbβ3。如噬菌体ELISA中分析结果所示(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。基于轻链重排技术，筛选出的重链片段编码序被进行第二轮的筛选过程。为实现该目的，该DPK-26人κ轻链被人κ和λ轻链库所取代，该轻链库是从人骨髓cDNA扩增得到的。产生的天然人轻链库再一次被克隆入噬粒载体pComb3X中，得到包含7×108个独立的转化菌株的多样性。三轮在固定化的人整合蛋白αIIbβ3上的淘选过程以后，如噬菌体ELISA实验分析结果，所有的筛选出来的克隆都结合上了整合蛋白αIIbβ3。接下来将10株显示最强结合能力的克隆个体作DNA测序分析。除了一个以外，其它所有克隆的HCDR3区都含有一个二硫键限制性环形结构，该环形结构具有保守序列V(V/W)CRAD)K/R)RC(参见SEQIDNO4和表2)。其中一个例外克隆RAD1具有相应的序列THSRADRRE(参见SEQIDNO19和表2)。所有的克隆都显示具有DP-47VH重链片段。其中4个克隆含有初始的DPK-26人κ轻链，6个克隆显示含有由天然人轻链库衍生出来的人κ或λ轻链。筛选出的人Fab的生物化学性质和功能描述用ELISA的方法检测筛选出的10个克隆所表达的Fab对于RGD-结合整合蛋白的反应性。所有的Fab都很牢固地与人整合蛋白αIIbβ3结合，但是不与人整合蛋白αγβ3，α5β1，和αγβ5结合(参见图1)。为了检测其对于表达在人血小板表面的天然整合蛋白αIIbβ3的反应性，这些Fab接下来都用流式细胞仪分析。所有筛选出的Fab均被发现可以和人血小板结合，而非相关的Fab则不与血小板结合。由于整合蛋白αIIbβ3和血小板之间的反应部分由RGD基序介导的，所以我们接下来检测筛选出的Fab是否能够抑制这种蛋白质-蛋白质之间的反应。为了实现这个目的，我们进行了基于固定化整合蛋白αIIbβ3的，生物素(酰)化的纤维蛋白原以及辣根过氧化物酶标记亲和素的竞争性ELISA测定。筛选出的Fab以不同浓度与生物素(酰)化纤维蛋白原混合，接下来再与固定化的整合蛋白αIIbβ3一起孵育。辣根过氧化物酶标记亲和素被用于检测与固定化的整合蛋白αIIbβ3结合的生物素(酰)化的纤维蛋白原。所有筛选的Fab都显示出对整合蛋白αIIbβ3和纤维蛋白原之间相互作用的强力抑制。我们接下来的研究对象是显示出与整合蛋白αIIbβ3极强结合能力的FabRAD87。FabRAD87被大肠杆菌表达后用上面所述的方法进行提纯(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。流式细胞术结果显示FabRAD87只结合人血小板，而不与主要表达整合蛋白αγβ3的人脐静脉内皮细胞结合(如图2所示)。与之对比的，Fab阿昔单抗(ReoPro，EliLily，Indianapolis，IN)则与血小板和人脐静脉内皮细胞都能结合(如图2所示)，该结果进一步验证了Fab阿昔单抗与两种β3整合蛋白的交叉反应性(参见Bougie，D.W.，Wilker，P.R.，Wuitschick，E.D.，Curtis，B.R.，Malik，M.，Levine，S.，Lind，R.N.，Pereira，J.，andAster，R.H.(2002)Acutethrombocytopeniaaftertreatmentwithtirofibanoreptifibatideisassociatedwithantibodiesspecificforligand-occupiedGPIIb/IIIa.Blood100，2071-2076)。在一种半数抑制浓度(IC50)值为8.0×10-8M的剂量依赖型方案中，FabRAD87阻断了整合蛋白αIIbβ3和纤维蛋白原之间的反应。平行实验中，Fab阿昔单抗的半数抑制浓度(IC50)值为9.0×10-8M(参见图3A和表3)。基于竞争性ELISA实验(参见Suzuki，K.，Sato，K.，Kamohara，M.，Kaku，S.，Kawasaki，T.，Yano，S.，andIizumi，Y(2002)Comparativestudiesofahumanizedanti-glycoproteinIIb/IIIamonoclonalantibody，YM337，andabciximaboninvitroantiplateleteffectandbindingproperties.BiolPharmBull25，1006-1012；Co，M.S.，Yano，S.，Hsu，R.K.，Landolfi，N.F.，Vasquez，M.，Cole，M.，Tso，J.T.，Bringman，T.，Laird，W.，Hudson，D.，andetal.(1994)Ahumanizedantibody单价FabRAD87和整合蛋白αIIbβ3之间反应的Kd值为3.3×10-9M(如表3所示)。相同的测定显示，单价Fab阿昔单抗和整合蛋白αIIbβ3之间反应的Kd值为1.1×10-9M，与已公布的6.2×10-9M不同(如表3所示)(参见Tam，S.H.，Sassoli，P.M.，Jordan，R.E.，andNakada，M.T.(1998)Abciximab(ReoPro，chimeric7E3Fab)demonstratesequivalentaffinityandfunctionalblockadeofglycoproteinIIb/IIIaandalpha(v)beta3integrins.Circulation98，1085-1091)。由于整合蛋白αIIbβ3和纤维蛋白原之间的反应是血小板凝集中的关键步骤，因此我们接下来检测FabRAD87是否能够在体外抑制血小板凝集。通过把ADP加入到由人类外周血制备的条件性血浆中，至最终浓度为20μM。FabRAD87被发现能够强烈抑制血小板凝集，其EC50值为60nM或3μg/ml(如图4和表3所示)。在一个平行实验中，当血小板凝集反应被5μM的ADP诱导发生时，Fab阿昔单抗的EC50值为45nM，而在以往的报道中，该EC50值为34nM(参见Klinkhardt，U.，Kirchmaier，C.M.，Westrup，D.，Breddin，H.K.，Mahnel，R.，Graff，J.，Hild，M.，andHarder，S.(2000)DifferentialinvitroeffectsoftheplateletglycoproteinIIb/IIIainhibitorsabxicimaborSR121566Aonplateletaggregation，fibrinogenbindingandplateletsecretoryparameters.ThrombRes97，201-207)。源于筛选出的HCDR3序列的合成肽的生物化学和功能描述四种九肽被使用化学方法合成，该九肽的序列来源于筛选出的结合整合蛋白αIIbβ3的Fab中HCDR3区的序列。该系列包含3种环状肽，VWCRADKR(参见SEQIDNO6)，VWCRADRRC(参见SEQIDNO5)和VVCRADRRC(参见SEQIDNO7)，以及一种线形肽THSRADRRE(参见SEQIDNO19)。使用上面描述过的竞争性ELISA测定法，所有的环形肽均被发现可以在微摩尔级浓度范围内抑制整合蛋白αIIbβ3和纤维蛋白原之间的反应。该线形肽以及3个对照肽在相同的浓度范围内均不能抑制整合蛋白αIIbβ3和纤维蛋白原之间的反应(参见图3B)，该对照肽中两个含有反转的RAD基序，VVCDARRRC(参见SEQIDNO20)和THSDARRRE(参见SEQIDNO21)，另一个包含非相关序列。结合能力最强的两个环形肽——VWCRADRRC(参见SEQIDNO5)和VWCRADKRC(参见SEQIDNO6)的IC50值分别为1.2×10-6M和4.2×10-6M。而来源于FabRAD87的环形肽VVCRADRRC的IC50值为1.1×10-5M，该值比FabRAD87的IC50值高两个数量级。图5表示的是使用不同浓度的VWCRADRRC(参见SEQIDNO5)(A)，VVCRADRRC(参见SEQIDNO7)(B)，VWCRADKR(参见SEQIDNO6)(C)以及一种对照肽(D)进行的体外血小板凝集实验结果。很明显地，三种环形肽在90μM浓度下可以完全抑制血小板凝集，而线形肽和对照肽则不能抑制该凝集作用。与整合蛋白αIIbβ3/纤维蛋白原反应测定结果一致的是，环形肽VWCRADRRC(参见SEQIDNO5)——唯一一个可以在9μM(参见图5A)这样的低浓度下抑制血小板凝集的肽，再一次被发现其抑制能力是最强的。虽然其潜在的施用效果和阿昔单抗一样均为抗血栓类药物，但是我们这里讨论的RAD抗体仍然具有一些很独特的性质。首先，它们是人源抗体，这样引起病人体内免疫应答的可能性就会很低。第二，和RGD肽和模拟肽(peptidomimetic)(参见Xiong，J.P.，Stehle，T.，Zhang，R.，Joachimiak，A.，Frech，M.，Goodman，S.L.，andArnaout，M.A.(2002)CrystalstructureoftheextracellularsegmentofintegrinalphaVbeta3incomplexwithanArg-Gly-Aspligand.Science296，151-155)一样，该RAD抗体可以直接阻断整合蛋白αIIbβ3上的RGD结合位点。与之形成对比的，阿昔单抗不含有RGD或类RGD基序，因此它与整合蛋白αIIbβ3的结合原理被认为是通过空间或变构阻碍，而不是通过对RGD结合位点的直接阻断与屏蔽。第三点，RAD抗体与整合蛋白αIIbβ3特异性地结合，而阿昔单抗却不能区分整合蛋白αγβ3和整合蛋白αIIbβ3。阿昔单抗的交叉反应性与我们的早期合成的整合蛋白结合抗体相类似。(参见Barbas，C.F.，3rd，Languino，L.R.，andSmith，J.W.(1993)High-affinityself-reactivehumanantibodiesbydesignandselectiontargetingtheintegrinligandbindingsite.ProcNatlAcadSciUSA90，10003-10007；Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChem269，32788-32795)。原因不明的严重的血小板减少症是施用整合蛋白αIIbβ3抑制剂时最主要的安全问题。如前面提到的那样，据报道，阿昔单抗中人抗-鼠可变区结构域是在阿昔单抗二次给药后病人产生严重血小板减少症的最主要的原因。(参见Curtis，B.R.，Swyers，J.，Divgi，A.，McFarland，J.G.，andAster，R.H.(2002)Thrombocytopeniaaftersecondexposuretoabciximabiscausedbyantibodiesthatrecognizeabciximab-coatedplatelets.Blood99，2054-2059)。该发现使得通过将其CDR移植入人可变结构域中的方法使得abcximab进一步人源化成为必需(参见Rader，C.，Ritter，G.，Nathan，S.，Elia，M.，Gout，I.，Jungbluth，A.A.，Cohen，L.S.，Welt，S.，Old，L.J.，andBarbas，C.F.，3rd(2000)Therabbitantibodyrepertoireasanovelsourceforthegenerationoftherapeutichumanantibodies.JBiolChem275，13668-13676)。尽管如此，如果不能根据该抗体结构方面的具体信息而作出结构方面较好的改变，那么这种CDR移植方案则有可能产生一些结合能力较大程度减小的抗体，比如最近在进行临床实验的抗-整合蛋白αIIbβ3的抗体YM337(参见Suzuki，K.，Sato，K.，Kamohara，M.，Kaku，S.，Kawasaki，T.，Yano，S.，andIizumi，Y(2002)Comparativestudiesofahumanizedanti-glycoproteinIIb/IIIamonoclonalantibody，YM337，andabciximaboninvitroantiplateleteffectandbindingproperties.BiolPharmBull25，1006-1012；Co，M.S.，Yano，S.，Hsu，R.K.，Landolfi，N.F.，Vasquez，M.，Cole，M.，Tso，J.T.，Bringman，T.，Laird，W.，Hudson，D.，andetal.(1994)AhumanizedantibodyspecificfortheplateletintegringpIIb/IIIa.Jlmmunol152，2968-2976)。由于RAD抗体完全由人源序列组成，除了合成的HCDR3以外，该RAD抗体被预期比嵌合或人源化的抗体具有更少的免疫原性。我们的RAD抗体的人抗独特型抗体的诱导是有可能的。由于循环的抗独特型抗体可以与血小板整合蛋白αIIbβ3竞争地结合RAD抗体，而不是通过RAD抗体结合到血小板的表面，因此设想其不会引起严重的血小板减少症是合理的。最近的一个有趣的发现就是在施用tirofiban和eptifibatide这类小分子药物后出现严重血小板减少症的病人体内发现了一种人抗体，该人抗体在与tirofiban或eptifibatide混合时，可以选择性识别整合蛋白αIIbβ3(参见Bougie，D.W.等)。在这种情况下，RAD抗体通过诱导整合蛋白αIIbβ3表面的免疫原性表位的展示而导致血小板减少症的可能性还是存在的，因为这些RAD抗体的结合方式与小分子药物是相同的。包含LJ-CP3，OPG2和PAC-1在内的一些对整合蛋白αIIbβ3具有特异性的鼠单克隆抗体的HCDR3区中包含RYD基序(参见Puzon-McLaughlin，W.，Kamata，T.，andTakada，Y.)2000)Multiplediscontinuousligand-mimeticantibodybindingsitesdefinealigandbindingpocketinintegrinalpha(IIb)beta(3).JBiolChem275，7795-7802；Kamata，T.，Irie，A.，Tokuhira，M.，andTakada，Y.(1996)CriticalresiduesofintegrinalphaIIbsubunitforbindingofalphaIIbbeta3)glycoproteinIIb-IIIa)tofibrinogenandligand-mimeticantibodies(PAC-1，OP-G2，andLJ-CP3).JBiolChem271，18610-18615；Prammer，K.V，Boyer，J.，Ugen，K.，Shattil，S.J.，andKieber-Emmons，T.(1994)BioactiveArg-Gly-Aspconformationsinanti-integrinGPIIb-IIIaantibodies.Receptor4，93-108；Tomiyama，Y.，Brojer，E.，Ruggeri，Z.M.，Shattil，S.J.，Smiltneck，J.，Gorski，J.，Kumar，A.，Kieber-Emmons，T.，andKunicki，T.J.(1992)AmolecularmodelofRGDligands.AntibodyDgenesegmentsthatdirectspecificityfortheintegrinalphaIIbbeta3.JBiolChem267，18085-18092；Niiya，K.，Hodson，E.，Bader，R.，Byers-Ward，V.，Koziol，J.A.，Plow，E.F.，andRuggeri，Z.M.(1987)IncreasedsurfaceexpressionofthemembraneglycoproteinIIb/IIIacomplexinducedbyplateletactivation.Relationshiptothebindingoffibrinogenandplateletaggregation.Blood70，475-483；Bennett，J.S.，Hoxie，J.A.，Leitman，S.F.，Vilaire，G.，andCines，D.B.(1983)Inhibitionoffibrinogenbindingtostimulatedhumanplateletsbyamonoclonalantibody.ProcNatlAcadSciUSA80，2417-2421)。这些鼠单克隆抗体与整合蛋白αIIbβ3之间的结合可以完全被RGD肽完全阻断，这说明它们的RYD基序介导了该鼠抗体和RGD结合位点之间的直接反应。有趣的是，HCDR3区中包含一个RYD基序鼠单克隆抗体，16N7C2，却不能区分各种β3整合蛋白(参见Deckmyn，H.，Stanssens，P.，Hoet，B.，Declerck，P.J.，Lauwereys，M.，Gansemans，Y，Tornai，I.，andVermylen，J.(1994)Anechistatin-likeArg-Gly-Asp(RGD)-containingsequenceintheheavychainCDR3ofamurinemonoclonalantibodythatinhibitshumanplateletglycoproteinIIb/IIIafunction.BrJHaematol87，562-571)。因此，与我们合成的RAD基序相类似的，在一些情况下，天然的RYD基序被用于选择性识别整合蛋白αIIbβ3。尽管如此，与合成的RAD抗体比较而言，LJ-CP3，OPG2和PAC-1的HCDR3区都没有一个可以作为类-RGD基序的二硫键(Tomiyama，Y，Brojer，E.，Ruggeri，Z.M.，Shattil，S.J.，Smiltneck，J.，Gorski，J.，Kumar，A.，Kieber-Emmons，T.，andKunicki，T.J.(1992)AmolecularmodelofRGDligands.AntibodyDgenesegmentsthatdirectspecificityfortheintegrinalphaIIbbeta3.JBiolChem267，18085-18092)，这说明或者通过VDJ区重组的方法得到的结构多样性存在局限性，或者该方法是一种抗-HCDR3区二硫键的筛选方法。先前我们用于筛选人抗体的方法通常是使用合成的移植的RGD基序或是一种HCDR3中的类-RGD基序来与整合蛋白αγβ3和αIIbβ3结合(参见Barbas，C.F.，3rd，Languino，L.R.，andSmith，J.W.)1993)High-affinityself-reactivehumanantibodiesbydesignandselectiontargetingtheintegrinligandbindingsite.ProcNatlAcadSciUSA90，10003-10007；Smith，J.W.，Hu，D.，Satterthwait，A.，Pinz-Sweeney，S.，andBarbas，C.F.，3rd(1994)Buildingsyntheticantibodiesasadhesiveligandsforintegrins.JBiolChenu269，32788-32795；Barbas，C.F.，3rd(1993)Recentadvancesinphagedisplay.CurrOpinBiotechnol4，526-530)。筛选出的抗体对其中任一种整合蛋白都不具有专有的特异性。在筛选具有更高特异性的抗体的尝试过程中，我们使用一种随机化设计的HCDR3序列VGXXXRADXXXYAMDV(参见SEQIDNO3)建立了一个新的合成人源抗体库。除了使用RAD基序取代RGD基序以外，新库最大的不同点在于移除了旧库中的一个包围整合蛋白结合位点的CX9C二硫键及其侧位残基。有趣的是，新库针对抗-整合蛋白αIIbβ3抗体的筛选过程产生了一种新的基序展示(motif-displaying)的CX5C型二硫键，该二硫键被发现存在于90％的筛选出的抗体序列中。这个稍小的环形结构，在以前的CX9C型二硫键的筛选中，如果有可能的话，那么很有可能产生一种很独特的对整合蛋白αIIbβ3的选择性。筛选出的存在HCDR3区域中的序列XXXRADXXX(参见SEQIDNO22)基序在结构方面的限制促使我们对于其抗体折叠到功能特性方面都进行深入研究。3种在CX5C型二硫键中展示RAD基序的合成肽VWCRADRRC(参见SEQIDNO5)，VWCRADKRC(参见SEQIDNO6)和VVCRADRRC(参见SEQIDNO7)都可以抑制所筛选的RAD抗体与整合蛋白αIIbβ3之间的结合，纤维蛋白原与整合蛋白αIIbβ3之间的结合以及抑制血小板凝集。但线性合成肽THSRADRRE(参见SEQIDNO19)则不具有这种抑制能力。抗整合蛋白αIIbβ3的肽拮抗剂已经用噬菌体展示的方法从肽库中筛选出来了(参见O′Neil，K.T.，Hoess，R.H.，Jackson，S.A.，Ramachandran，N.S.，Mousa，S.A.，andDeGrado，W.F.(1992)IdentificationofnovelpeptideantagonistsforGPIIb/IIIafromaconformationallyconstrainedphagepeptidelibrary.Proteins14，509-515；Koivunen，E.，Wang，B.，andRuoslahti，E.(1995)PhagelibrariesdisplayingcyclicpeptideswithdifferentringsizesligandspecificitiesoftheRGD-directedintegrins.Biotechnology(NY)13，265-270；Koivunen，E.，Restel，B.H.，Rajotte，D.，Lahdenranta，J.，Hagedorn，M.，Arap，W.，andPasqualini，R.(1999)Integrin-bindingpeptidesderivedfromphagedisplaylibraries.MethodsMolBiol129，3-17)。CX5C，CX6C，CX7C和CX9C的约束型的肽库也被使用。尽管如此，只有CX6C和CX7C肽库产生了整合蛋白αIIbβ3的结合体。筛选出的序列可以被分类成2组那些含有RGD基序的和那些含有类-RGD基序的，其中RGD中的甘氨酸或精氨酸残基被取代。处于中心位置的甘氨酸被一些不同的氨基酸残基，比如丝氨酸，苏氨酸，亮氨酸，丙氨酸，谷氨酰胺，组氨酸和蛋氨酸等所取代。两种肽CRADVPLC(参见SEQIDNO23)和CMSRADRPC(参见SEQIDNO24)含有RAD基序。从整合蛋白αIIbβ3筛选出来的含有RGD的序列与那些从整合蛋白αγβ3与α5β1筛选出来的序列不同，在与该RGD基序直接相连的靠近C术端的地方含有较丰富的芳香残基，比如色氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。另外，一些存在于RGD基序外的序列含有1或2个碱性残基。尽管如此，该筛选出来的肽链序列中，没有一个和我们筛选的HCDR3序列VWCRADKRC(参见SEQIDNO6)，VWCRADRRC(参见SEQIDNO5)和VVCRADRRC(参见SEQIDNO7)有相似之处。值得注意的是包含我们的CX5C核心共有序列CRAD(K/R)RC的CX5C肽库不能产生任何整合蛋白αIIbβ3结合肽，这说明在我们的筛选出来的HCDR3序列N-末端的VW或VV残基在与整合蛋白αIIbβ3之间的相互作用中起着关键的作用。肽链和抗体库的噬菌体展示技术在研究和发展的各种应用中已经成为一项标准技术(参见Barbas，C.F.，3rd，Burton，D.R.，Scott，J.K.，andSilverman，G.J.(2001)PhageDisplayALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork；Kay，B.K.，Kasanov，J.，andYamabhai，M.(2001)Screeningphage-displayedcombinatorialpeptidelibraries.Methods24，240-246；Sidhu，S.S.(2000)Phagedisplayinpharmaceuticalbiotechnology.CurrOpinBiotechnol11，610-616)。抗体免疫球蛋白可变区中的肽库融合了这些技术，同时在抗体，肽和类肽类药物的发现之间提供了一种具有迷惑力的联系。这里我们示范了这种制备新的特异性抗-受体肽链和抗体的方法的有效性。抗体支架中生物活性物质和/或结合肽的放置或它们在支架中的制备为用作生物工具或治疗剂的免疫学试剂的快速开发作准备(参见Barbas，C.F.，3rd(1993)Recentadvancesinphagedisplay.CurrOpinBiotechnol4，526-530)。经常地，肽本身在体内就具有可变的活性，而且它们的结合可能很难被监控，尽管如此，肽在抗体中的展示有可能会解决其探测问题，以及肽链蛋白质水解和它们的快速清除相关联的问题，因为该抗体和抗体片段显示出相对可预测的药代动力学行为。在必要的时候，比如在癌症的治疗中，作为免疫效应分子偶联的结果，抗体的Fc区可以赋予肽序列细胞杀伤功能。我们相信，该方法能够应用于具有结合活性的多种肽以快速制备有用的免疫试剂(参见Brown，K.C.(2000)Newapproachesforcell-specifictargetingidentificationofcell-selectivepeptidesfromcombinatoriallibraries.CurrOpinChemBiol4.16-21)。虽然本发明参照示范性的实施方案来特别说明或描述，那些本领域的普通技术人员将明白其中形式和细节上的可作的不同变化而不脱离本发明的范围和实质。那些本领域的技术人员或理解本发明描述的人，将明白如何利用本发明提及的其它适合的技术和方法进行不同形式的应用。因此，本发明是可以被实施的，而不是仅限于这里特定的描述。以上的描述是阐述性而非限制性的。对于本领域的普通技术人员来说，通过了解以上的描述，很显然能够实施许多其他的方案。因此本发明的范围因决定于权利要求定义的本发明的精神和范围，以及与其等价的整个权利范围。序列表<110>斯克利普斯研究院<120>整合蛋白ALPHA.IIB.BETA.3特异性抗体和肽<130><160>24<210>1<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>1CysSerPheGlyArgGlyAspIleArgAsnCys1510<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>2GlySerPheGlyArgGlyAspIleArgAsnGly1510<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><221>unsure<222>3，4，5，9，10，11<223>随机DNA序列<400>3ValGlyXaaXaaXaaArgAlaAspXaaXaaXaaTyrAlaMetAsp151015Val<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>4ValValCysArgAlaAspLysArgCys15<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>5ValTrpCysArgAlaAspArgArgCys15<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>6ValTrpCysArgAlaAspLysArgCys15<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>7ValValCysArgAlaAspArgArgCys15<210>8<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>8ValArgValValCysArgAlaAspArgArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>9<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><221>aorgorcort<222>25，26，28，29，31，32，43，44，46，47，49，50<223>随机DNA序列<400>9gtgtattactgtgcgagagtggggnnknnknnkcgtgccgacnnknnknnktacgctatg60gacgtctggggc<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10agaagcgtagtccggaacgtc<210>11<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>11gctgcccaaccagccatggccgaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggta<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>12cactctcgcacagtaatacacggccgtgtcctcggctct<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13ggccatggctggttgggcagc<210>14<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>14gaggaggaggaggaggagagaagcgtagtccggaacgtc<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15aagacagctatcgcgattgcagtg<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16ggccatggctggttgggcagc<210>17<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>17gaggaggaggaggaggaggcggggcccaggcggccgagctc<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18ggccatggctggttgggcagc<210>19<211>9<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>19ThrHisSerArgAlaAspArgArgGlu15<210>20<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>20ValValCysAspAlaArgArgArgCys15<210>21<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>21ThrHisSerAspAlaArgArgArgGlu15<210>22<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>unsure<222>1，2，3，7，8，9<223>随机DNA序列<400>22XaaXaaXaaArgAlaAspXaaXaaXaa15<210>23<211>8<212>PRT<213>人工序列<400>23CysArgAlaAspValProLeuCys15<210>24<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>24CysMetSerArgAlaAspArgProCys15<210>25<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>25ValArgValValCysArgAlaAspLysArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>26<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>26ValArgValTrpCysArgAlaAspArgArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>27<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>27ValArgValTrpCysArgAlaAspLysArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>28<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>28ValGlyValValCysArgAlaAspArgArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>29<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>29ValGlyValValCysArgAlaAspLysArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>30<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>30ValGlyValTrpCysArgAlaAspArgArgCysTyrAlaMetAsp151015Val<210>31<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>31ValGlyValTrpCysArgAlaAspLysArgCysTyrAlaMetAsp151015Val权利要求1.一种分离并提纯的包含9到大约50个氨基酸残基的肽，该肽具有选自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸残基序列，并且该肽具有抑制血小板凝集的活性。2.权利要求1的肽，该肽包括SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列。3.权利要求2的肽，该肽由SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列组成。4.权利要求2的肽，该肽基本上由SEQIDNo5-7中任一个的氨基酸残基序列组成。5.一种与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应的抗体，该抗体包含选自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31的氨基酸残基序列，其中所述氨基酸残基序列包含在该抗体的决定簇互补区中。6.权利要求5的抗体，其中决定簇互补区位于该抗体的重链上。7.权利要求5的抗体，其中决定簇互补区是HCDR3。8.权利要求5的抗体，其选自此处指定为RAD3，RAD4，RAD9，RAD11，RAD12，RAD32，RAD34，RAD87或RAD88的抗体并且与整合蛋白αIIbβ3发生特异性免疫反应。9.权利要求5的抗体，其是一种人源抗体。10.一种抗体，其具有权利要求8中抗体的免疫反应性。11.一种抑制血小板凝集的方法，该方法包括将血小板与抑制有效量的权利要求1的肽相接触。12.一种抑制血小板凝集的方法，该方法包括将血小板与抑制有效量的权利要求5的抗体相接触。13.一种抑制纤维蛋白原与血小板结合的方法，该方法包括将血小板与抑制有效量的权利要求1的肽相接触。14.一种抑制血小板凝集的方法，该方法包括将血小板与抑制有效量的权利要求5的抗体相接触。15.一种具有整合蛋白αIIbβ3结合活性的抗体，其中所述结合与其它蛋白质的结合活性竞争，所述其它蛋白质包含三肽基序精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(RAD)的氨基酸残基序列，并且所述结合是在标准竞争测定中进行的。16.权利要求15的抗体，其中所述其它蛋白质是另外一种抗体，该抗体的决定簇互补区含有一种氨基酸残基序列，该氨基酸序列选自SEQIDNo8，25，26，27，28，29，30和31，而且所述的结合是在标准竞争测定中进行的。17.一种分离并提纯的编码一种肽的多核苷酸，该肽包含9到约50个氨基酸残基而且具有选自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸残基序列，并且该肽具有抑制血小板凝集的活性。18.一种包括权利要求17的多核苷酸的载体。19.一种包括权利要求18的载体的宿主细胞。20.一种使用多核苷酸制备蛋白质的方法，该方法包括a)在蛋白质表达的条件下，培养权利要求19中的宿主细胞；b)从宿主细胞培养物中回收蛋白质，该蛋白质包含选自SEQIDNo4，5，6和7的氨基酸序列。21.一种药用组合物，该药用组合物包含权利要求1的肽和适宜的药用载体，该药用组合物以适宜于静脉给药、动脉给药、淋巴循环给药、腹膜内给药、透皮给药、皮下给药、肌内给药、关节腔内给药以及肺部给药的形态存在。22.一种药用组合物，该药用组合物包含权利要求5的抗体和适宜的药用载体，该药用组合物以适宜于静脉给药、动脉给药、淋巴循环给药、腹膜内给药、透皮给药、皮下给药、肌内给药、关节腔内给药以及肺部给药的形态存在。23.一种药用组合物，该药用组合物包含权利要求15的抗体和适宜的药用载体，该药用组合物以适宜于静脉给药、动脉给药、淋巴循环给药、腹膜内给药、透皮给药、皮下给药、肌内给药、关节腔内给药以及肺部给药的形态存在。24.权利要求1中的肽，该肽用作治疗剂以防止在选自肺部栓塞、暂时性缺血发作(TIAs)、深静脉栓塞、冠状动脉旁路手术和在自体，非自体或者合成的脉管移植中放置人工瓣膜或脉管的手术的条件下的血栓形成。25.权利要求5的抗体，该抗体用作治疗剂以防止在选自肺部栓塞、暂时性缺血发作(TIAs)、深静脉栓塞、冠状动脉旁路手术和在自体，非自体或者合成的脉管移植中放置人工瓣膜或脉管的手术的条件下的血栓形成。26.权利要求15的抗体，该抗体用作治疗剂以防止在选自肺部栓塞、暂时性缺血发作(TIAs)、深静脉栓塞、冠状动脉旁路手术和在自体，非自体或者合成的脉管移植中放置人工瓣膜或脉管的手术的条件下的血栓形成。27.权利要求1的肽，该肽用作治疗剂以防止在选自通过球囊、冠状动脉粥样斑块切除术和激光血管成形术进行的血管成形术过程中的血栓形成。28.权利要求5的抗体，该抗体用作治疗剂以防止在选自通过球囊、冠状动脉粥样斑块切除术和激光血管成形术进行的血管成形术过程中的血栓形成。29.权利要求15的抗体，该抗体用作治疗剂以防止在选自通过球囊、冠状动脉粥样斑块切除术和激光血管成形术进行的血管成形术过程中的血栓形成。30.一种处理个体以治疗或防止血栓形成性紊乱的方法，该紊乱选自肺部栓塞、暂时性缺血发作(TIAs)、深静脉栓塞、冠状动脉旁路手术和在自体，非自体或者合成的脉管移植中放置人工瓣膜或脉管的手术，该方法包括施用一定量的权利要求1的肽于个体以达到治疗效果。31.一种处理个体以治疗或防止血栓形成性紊乱的方法，该紊乱选自肺部栓塞、暂时性缺血发作(TIAs)、深静脉栓塞、冠状动脉旁路手术和在自体，非自体或者合成的脉管移植中放置人工瓣膜或脉管的手术，该方法包括施用一定量的权利要求5的抗体于个体以达到治疗效果。32.一种处理个体以治疗或防止血栓形成性紊乱的方法，该紊乱选自肺部栓塞、暂时性缺血发作(TIAs)、深静脉栓塞、冠状动脉旁路手术和在自体，非自体或者合成的脉管移植中放置人工瓣膜或脉管的手术，该方法包括施用一定量的权利要求15的抗体于个体以达到治疗效果。全文摘要本发明涉及一种整合蛋白α文档编号A61K39/395GK1901930SQ200480040119公开日2007年1月24日申请日期2004年12月3日优先权日2003年12月3日发明者C·F·巴巴斯,钟振浩申请人:斯克利普斯研究院