专利名称：沙棘提取物、其制备方法及其在制备药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及沙棘提取物，尤其涉及从沙棘中提取的三种具有活性的化合物、其制备方法及其在制备药物中的应用。
背景技术：
困扰人们的日常炎性疾病包括关节炎症，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风关节炎等；炎性皮肤病，例如湿疹、牛皮癣、皮炎等；炎性眼疾，例如眼色素层炎、结膜炎等；肺部疾病，例如哮喘、支气管炎、急性呼吸窘迫综合症等；菌血症、那毒素血症、口疮溃疡、龈炎、胰腺炎等；胃肠道疾病，例如节段性回肠炎、萎缩性胃炎、溃疡性结肠炎、腹腔炎、消化性溃疡、应激性肠道综合症，例如由幽门螺旋杆菌感染而引起的粘膜炎症或者由非甾体类抗炎药引起的肠胃病等等。
有关各种炎症致病作用的机理是已知体内一氧化氮(NO)是介导细胞免疫和炎症的毒性物质。其前体是左旋精氨酸(L-arg)，L-arg末端胍基上的2个相同的氢原子之一在NO合成酶(NOS)的作用下生成NO。目前已经分离出三种不同类型的NOS，包括内皮NO合成酶(eNOS)，神经元NO合成酶(nNOS)及诱导型NO合成酶(iNOS)。目前已知，巨噬细胞、肝细胞、平滑肌细胞、腺癌细胞以及上皮细胞均能表达iNOS。某些炎性细胞因子和微生物产物如脂多糖(LPS)则可诱导iNOS表达。iNOS一旦被诱导即可表达出高度活性，产生大量NO。
因此，长时间以来，人们致力于寻找NO合成酶的抑制剂来治疗与之相关的炎性疾病。但这些抑制剂大多局限于化学合成的物质，副作用较大。现有技术中未见从天然中草药植物中提取抗炎活性物质的报道。
由于各种炎症长期困扰人类的健康生活，有关的科学工作者始终不遗余力的试图开发新型的疗效确切、副作用少、研制成本低的抗炎活性化合物。加深对中草药的研究可能是实现这个愿望的良好载体。
沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是主要分布在中国黄河流域的胡颓子科植物，在中国，沙棘的果实用于治疗咳嗽痰多，消化不良，食积腹痛，瘀血经闭，跌扑瘀肿。(《中华人民共和国药典》2005年版一部(化学工业出版社，第127页)。
由于植物药副作用小，研究和制取的成本低，所以从中草药中发现有确切疗效的药物活性成分，将是一个可取的尝试。
发明内容
本发明的目的是提供沙棘提取物、其提取方法及其在制备治疗或预防有关炎性疾病的药物中的用途。
本发明从沙棘中提取的化合物(1)、(2)、(3)、(4)分别用下式表示 从沙棘中提取的化合物中的(2)、(3)、(4)为活性化合物；活性化合物(4)或其与(1)、(2)、(3)的任意组合及其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物都具有药物活性。
本发明从沙棘中提取活性化合物的方法包括如下步骤1)沙棘经丙酮提取后的提取液减压浓缩、干燥得到萃取物；2)将上述萃取物用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；将氯仿的提取液减压浓缩、干燥得到氯仿的萃取物；3)将上述氯仿的萃取物经层析柱依次用正己烷和乙酸乙酯混合液、甲醇和水混合液洗脱；4)对上述收集到的洗脱液经高压液相色谱进一步分离精制，得到活性化合物。
在上述提取方法中，减压、浓缩优选在40摄氏度进行。在上述提取方法中，高压液相色谱的流动相为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝60∶35∶5。
本发明从沙棘中提取的化合物(4)或其与(1)、(2)、(3)的任意组合或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物可用于治疗或预防抑制NO生成活性是有益的疾病的药物制备。
本发明从沙棘中提取的活性化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物可用于治疗或预防炎性疾病的药物制备。
适宜的盐包括与有机和无机酸或碱形成的盐。药学上可接受的盐包括与下列酸形成盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、丁酮二酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。药学上可接受的碱式盐包括铵盐、碱金属盐如钠盐和钾盐、碱土金属盐如钙盐和镁盐以及与有机碱如二环己基胺和N-甲基-D-葡糖胺形成的盐。
生理官能衍生物的实例包括酯、酰胺、氨基甲酸酯，优选酯和酰胺。
本发明的化合物还可有利地与第二种药学活性物质，尤其是可诱导的环氧酶(COX-2)同工酶的选择性抑制剂联合用药，具体的本发明提供的化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体与COX-2抑制剂联合用药以治疗炎症、炎性疾病以及与炎症相关的疾病。
炎性疾病及临床病症包括关节疾病，特别是关节炎(例如类风湿性关节炎、骨关节炎)、或胃肠道疾病(如溃疡性结肠炎、胃炎、以及其它感染引起的粘膜炎症、由非甾体抗炎药引起的肠病)、肺部疾病(如成人呼吸道窘迫症、哮喘、囊纤维化、慢性阻塞性肺部疾病)、心脏病(如心肌炎)、神经组织疾病(如多发性硬化病)、胰腺疾病(如糖尿病及并发症)、肾疾病(如肾小球性肾炎)、皮肤病(如皮炎、牛皮癣、湿疹、荨麻疹)、眼部疾病(如青光眼)、移植器官疾病(如排斥反应)、多器官疾病(如系统性红斑狼疮)及病毒和细菌感染后的炎性后遗症。
此外，本发明提供的化合物可以有助于预防或治疗与HIV感染有关的淋巴细胞的丢失、增加放射治疗期间肿瘤细胞的放射性敏感性、降低肿瘤的生长、肿瘤发展、血管生成和肿瘤转移。
本发明提供的化合物还可以用于制备保健食品、饮料、或饲料等。
本发明提取沙棘中活性化合物的方法简单实用，所提取的活性化合物结构明确，并具有确切的NO抑制生成活性，达到抗炎的作用，没有细胞毒性。
具体实施例方式
实施例1提取物的制备与化合物结构的确定将3.0kg的沙棘枝皮粉碎，加入80％丙酮(丙酮∶水＝8∶2)10升，在室温中放置12个小时。过滤，得到萃取液。萃取后的沙棘粉末再度用80％的丙酮10L提取，与之前得到的萃取液混合。此溶液40℃的条件下进行在减压浓缩，得到929.8g的褐色粉末萃取物。
取粉木萃取物929.8g溶解于3L水中，然后用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、丁醇各2L，依次提取。提取液在40℃的条件下进行减压浓缩，正己烷层得到21.14g萃取物，氯仿层得到29.34g萃取物，乙酸乙酯层得到37.12g萃取物，正丁醇层得到180.23g萃取物，水层得到631.73提取物。对萃取物分别进行NO产生抑制试验(参照后面化合物试验方法)。各个萃取物的抑制率分别是正己烷层89.5％，氯仿层90.3％，乙酸乙酯层67.2％，正丁醇层24.6％，水层0.8％，根据MTT毒性测定方法，正己烷层显示有毒性。
取氯仿萃取物28.1g，用硅胶层析柱(Wako gel C-300和光纯药，6.5×18cm)进行分离。用正己烷∶乙酸乙酯＝100∶0、98∶2、96∶4、92∶8、85∶15、80∶20、60∶40、20∶80、0∶100进行洗脱萃取，合并相同流份，得到6个流份取液。fr.1(1.3g)、fr.2(1.0g)、fr.3(2.0g)、fr.4(1.5g)、fr.5(2.8g)、fr.6(12.2g)。
fr.2(1.0g)流份用Chromatorex ODS层析柱(Fuji Silysia Chemical公司制造、100-200mesh、5.5×15cm)进行分离，用甲醇∶水＝90∶10、甲醇溶液洗脱，合并相同流份，得4个流份(fr.2-1-fr.2-4)流份。fr.2-3(0.23g)用HPLC层析柱分离。HPLC层析柱采用Shiseido Silica SG80A(Shiseido公司制造、10×250mm)，流动相用正己烷∶乙酸乙酯＝80∶20，流速为4ml/min(室温)，用Shodex RI-72(示差检测器)监控，在保留时间为13分2秒时，取出显示最高点的分离液。将此分离液在40℃的条件下进行减压、浓缩，得到了化合物(1)-白色针状结晶(12.9mg)。
fr.3(2.0g)流份用HPLC层析柱分离。HPLC层析柱采用Shiseido Silica SG80A(Shiseido公司制造、10×250mm)，流动相用正己烷∶乙酸乙酯＝70∶30，流速为4ml/min(室温)，用ShodexRI-72(示差检测器)监控，在保留时间为8分20秒时，取出显示最高点的分离液。将此分离液在40℃的条件下进行减压、浓缩，得到流份230mg。该流份再次用HPLC层析柱分离。HPLC层析柱采用Capcell PAK C18(Shiseido公司制造、10×250mm)，流动相用甲醇∶水＝95∶5，流速为4ml/min(室温)，用UV(210nm)监控，在保留时间为10分40秒时，取出显示最高点的分离液。将此分离液在40℃的条件下进行减压、浓缩，得到了化合物(2)-白色粉末(24.9mg)。
fr.4(1.5g)流份用Chromatorex ODS层析柱(Fuji Silysia Chemical公司制造、100-200mesh、5.5×15cm)进行分离，用甲醇∶水＝50∶50、甲醇∶水＝70∶30、甲醇∶水＝90∶10、甲醇溶液洗脱，合并相同流份，得9个流份(fr.4-1-fr.4-9)流份。fr.4-1(0.12g)流份用HPLC层析柱分离。HPLC层析柱采用Capcell PAK C18(Shiseido公司制造、10×250mm)，流动相用甲醇∶水＝35∶65，流速为4ml/min(室温)，用UV(254nm)监控，在保留时间为13分40秒时，取出显示最高点的分离液。将此分离液在40℃的条件下进行减压、浓缩，得到了化合物(3)-黄色油状(12.8mg)。fr.4-6(0.07g)流份用HPLC层析柱分离。HPLC层析柱采用Shiseido Silica SG80A(Shiseido公司制造、10×250mm)，流动相用正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝60∶35∶5，流速为4ml/min(室温)，用UV(254nm)监控，在保留时间为11分13秒时，取出显示最高点的分离液。将此分离液在40℃的条件下进行减压、浓缩，得到了化合物(4)-白色粉末(6.0mg)。
化合物(1)、(2)、(3)断定为有文献记载的物质。化合物(4)为没有文献记载的物质。
实施例2确定理化参数及化合物的结构化合物(4)的性状、分子量等见表1；化合物(4)13C-NMR、1H-NMR的数据见表2。并由以上数据最终确定了有关化合物的结构式。
表1化合物(4)的性状、分子量、UV、IR
表2化合物4的NMR光谱数据(ppm、in Methanol-d4600MHz)s单峰 d双峰 t三重峰 m多重峰()值为Hz
化合物4的结构式确定如下
实施例3抑制NO生成试验由于干扰素r以及脂多糖刺激而产生的巨石噬细胞对NO生成的阻碍效果(抑制NO生成的效果)通过下面的实验方法求得。并且根据阻碍效果的IC50(um)来评价NO生成的抑制效果。
所用材料RAW 264.7细胞(大日本制药)N-1-盐酸萘乙二胺(1g和光纯药)磺胺(500g和光纯药)Ham’s F12培养基(SIGMA N488 500mL)IFN-γ(Geneyme/Techne 100μg)脂多糖(LPS，055B5 10mg，Sigma)磷酸(500ml和光纯药)DMSO(500ml和光纯药)96孔微滴定板(50/盒住友电木，商品名〔8096R〕)试验方法RAW264.7细胞，是在5％的CO2、37℃的温度、含有10％FBS的Ham’s F12的培养基中培育出来的。将处在对数生长期的RAW264.7细胞浓度调整为1.2×106个/ml，将细胞在CO2恒温箱中培养2小时后。添加了各种浓度的萃取物或离析成分。同时添加LPS(100ng/ml)，INF-γ(10U/ml)，检体0.4μL。在CO2恒温箱中培养一段时间后，取培养上清，将RAW264.7细胞的培养上清100μL放进平底96孔板中，用Griess法定量NO的氧化体NO2-。使DMSO的浓度在培养基中成为0.2％以下，加入0.1％萘二胺溶液50μL、1％对氨基苯磺酰胺溶液50μL，室温中闭光放置10分钟。用分光光度计测定570nm、(对照655nm)的0.D.。根据NaNO2标准溶液作成的检量线，定量培养基中的NO2-。
细胞毒性通过MTT法、由镜检确定。MTT法是已知的常规方法。即，于96孔微滴定板，每孔200μl细胞浓度为1.0×105细胞/ml，添加不同浓度的提取物或单体组分，将细胞培养16小时，加入MTT试剂，再培养4小时。弃上清，添加150μLDMSO，将生成的甲臜(formazane)完全溶解，测定570nm下的吸光度。
活性评价计算出NO2-的量，代入下面的公式求出抑制效果抑制率(％)＝{1-(X-Y)/(Z-Y)}×100X在实验化合物存在下，由IFN-γ和LPS诱导产生的NO2-的量，Y；在实验化合物、IFN-γ和LPS均不存在的情况下，诱导产生的NO2-的量，ZIFN-γ和LPS诱导产生的NO2-的量。
化合物(4)的NO生成抑制效果的IC50如下所示表3从沙棘离析出的单品化合物氧化氮生成抑制实验结果
实施例4原子团灭活实验原子团灭活实验以Okada等的方法，进行如下在96孔板(住友电木制，#8096 R)中加入0.2M醋酸缓冲液(pH5.5)40μL、12％含水乙醛溶液120μL、加入用二甲亚砜溶解的实验化合物0.4μL，再加入0.5mM DPPH溶液40μL，在暗室中放置30分钟。之后，用感光板读数器(Bio-Rad制3550)测定520nm的吸光度。
灭活率(％)＝{1-(X-Z)/(Y-Z)}×100X添加了实验化合物时的吸光度Y没有添加实验化合物时的吸光度Z只有二甲亚砜和12％甲醛溶液时的吸光度表4从沙棘离析出的化合物原子团灭活实验的结果
实施例5制备药物剂型当本发明提供的化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物单独给药时，优选以药用制剂提供，该制剂包括当化合物(1)或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物其药学上可接受的载体或赋形剂以及可任选的一种或多种其它的治疗成份。
所述制剂包括口服给药制剂、胃肠外给药制剂(包括皮内注射、肌内注射、静脉注射以及关节腔内注射)、吸入制剂(包括由不同剂量的加压气雾器、喷雾器、吹入器中产生的微粒粉剂或雾剂)、直肠和局部给药制剂(包括皮肤给药、口腔给药、舌下给药、眼内给药)。最适合的给药途径取决于用药患者的状况和疾病。制剂通常以单位剂型提供，并且可以通过药学领域中已知的任何方法进行制备。所有的方法都包括将活性成份与载体混合的步骤，载体由一个或多个辅助成分构成。通常情况下通过使活性成分与液体或精细固体载体或两者均匀紧密结合，随后根据需要将所述产物制成制剂；适宜口服给药的本发明制剂可以以独立的单位如胶囊剂、扁囊剂或片剂提供，而每单位含有预定量的活性成分；散剂或颗粒剂；水溶性液体或悬浮液；或水包油型乳剂或油包水型乳剂；也可以是大丸剂、药糖剂或糊剂。
通过任选与一种或多种辅助成分一起压片或塑型可以制备片剂；通过在适当的机器上压制自由流动形式如粉末或颗粒(任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合)中的活性组分可以制备压制片剂；所述片剂可任选为包衣或压痕的，并且配成制剂以提供活性成分的缓释或控释。
胃肠外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射液，该注射液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抗菌剂及使制剂与患者血液等张的溶质，水性和非水性的无菌悬浮液，该悬浮液可以含有悬浮剂和增稠剂；所述制剂可以以单位剂量或多剂量包装，例如用密封的安剖管和管制瓶提供；并且可以在冷冻干燥的条件下储存，自使用前仅需提供无菌的液体载体如盐水或注射用水；可以用散剂、颗粒剂及前面描述的各种片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
直肠给药的制剂可用常见的载体(如可可脂或聚乙二醇)的栓剂形式提供。
用于口腔的局部给约的制剂(如口腔含化剂或舌下给药剂)，包括在调味基质(如蔗糖、阿拉伯糖)中的活性成份的锭剂。
可以理解，除上面特别提到的成分外，本发明的制剂还包括本领域相关制剂类型的其它常规成分，例如适于口服给药的调味剂等。
①将从沙棘提取的化合物10g与玉米淀粉40g混合，加水制成软材，过12目筛造粒、干燥，得到颗粒剂，在本颗粒剂中每500mg中含化合物(1)100mg。
②将从沙棘提取的化合物40g与乳糖100g、硬脂酸镁10g混合，以每600mg填充肠溶胶囊，本肠溶胶囊剂中，每个胶囊含化合物(1)160mg。
3将从沙棘提取的化合物25g以普通的注射剂制造法，用加热至60摄氏度的注射用蒸馏水1000ml溶解，用Nacl调解等张，封入安剖瓶。本注射液10ml中含有化合物(1)250mg。
实施例6制备食品本发明提供的化合物也可以以食品的形式提供，优选的食品形式包括粉末、颗粒、糊剂、胶状物等，颗粒形式可以添加糖(如乳糖)来增加甜味；也可以制备成饮料的形式；这些食物或饮料除沙棘提取物外，还可以加入维生素、无机元素，如钙、醇类、去味剂，如多酚。这些食物包括特殊的健康食品、医用食品等种类。
权利要求
1.一种沙棘中提取物，其中包括化合物(4)或其与化合物(1)、(2)、(3)的任意组合及其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物；提取的化合物(1)、(2)(3)、(4)分别用下式表示
2.根据权利要求1所述的沙棘中提取物，其特征在于，适宜的盐包括与有机和无机酸或碱形成的盐，药学上可接受的盐包括与下列酸形成盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、丁酮二酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸；药学上可接受的碱式盐包括铵盐、碱金属盐、如钠盐和钾盐、碱土金属盐如钙盐和镁盐以及与有机碱如二环己基胺和N-甲基-D-葡糖胺形成的盐。
3.根据权利要求1所述的沙棘提取物，其特征在于，生理官能衍尘物包括酯、酰胺、氨基甲酸酯，优选酯和酰胺。
4.一种沙棘提取物的提取方法，包括如下步骤1)将棘枝皮粉碎，丙酮提取后的提取液减压浓缩、干燥得到萃取物；2)将上述萃取物用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；将氯仿的提取液减压浓缩、干燥得到氯仿的萃取物；3)将山上述氯仿的萃取物经层析柱依次用正己烷和乙酸乙酯混合液、甲醇和水混合液洗脱；4)对上述收集到的洗脱液经高压液相色谱进一步分离，减压浓缩、干燥，得到活性合物。
5.根据权利要求4所述沙棘提取物的提取方法，其特征在于，减压浓缩在40摄氏度进行；高压液相色谱的流动相为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝60∶35∶5。
6.根据权利要求1-3之一所述的沙棘提取物或其和第二种药学活性物质的组合物，以药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。
7.根据权利要求1-3之一所述的沙棘提取物，在制备治疗或预防炎性疾病药物中的用途。
8.根据权利要求1-3之一所述的沙棘提取物和第二种药学活性物质的组合物，在制备治疗或预防炎性疾病药物中的用途。
9.根据权利要求7或8所述的沙棘提取物在制备治疗或预防炎性疾病药物中的用途，其特征在于，所述炎性疾病及临床病症包括关节疾病，特别是关节炎，例如类风湿性关节炎、骨关节炎；或胃肠道疾病，如溃疡性结肠炎、胃炎、以及其它感染引起的粘膜炎症、由非甾体抗炎药引起的肠病；肺部疾病，如成人呼吸道窘迫症、哮喘、囊纤维化、慢性阻塞性肺部疾病；心脏病，如心肌炎；神经组织疾病如多发性硬化病；胰腺疾病，如糖尿病及并发症；、肾疾病，如肾小球性肾炎；皮肤病，如皮炎、牛皮癣、湿疹、荨麻疹；眼部疾病，如青光眼；移植器官疾病，如排斥反应；多器官疾病，如系统性红斑狼疮及病毒和细菌感染后的炎性后遗症。
10.根据权利要求1-3之一所述的从沙棘提取物，在制备保健食品、饮料、或饲料中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种沙棘提取物、其制备方法及其在制备药物中的应用。本发明从沙棘中提取的化合物共4种，其中活性化合物为3种。本发明沙棘提取物及其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物，可用于制备治疗或预防炎性疾病药物，还可以用于制备保健食品、饮料、或饲料等。本发明提供的提取沙棘中活性化合物的方法简单、实用，所提取的活性化合物结构明确。
文档编号A61P13/12GK1742736SQ20051009038
公开日2006年3月8日 申请日期2005年8月16日 优先权日2005年8月16日
发明者邰源临, 卢顺光, 杨志刚, 李永海, 温中平, 北中进, 大根谷章浩, 王立岩, 赵十一, 都留信也 申请人:水利部沙棘开发管理中心